Habilidades Microcirúrgicas de Estabelecer Cannulação permanente de veia jugular em ratos para amostragem de sangue serial de droga administrada oralmente

Resumo

Técnicas microcirúrgicas detalhadas são demonstradas para estabelecer um modelo de rato de cannulação vesícula ve jugular de longo prazo para coleta de sangue sequencial no mesmo animal. Parâmetros fisiológicos e hematológicos foram monitorados durante a fase de recuperação do rato. Este modelo foi aplicado para estudar farmacocinética de polifenól administrado oralmente sem induzir o estresse animal.

Resumo

A amostragem de sangue em pequenos animais de laboratório é necessária para a otimização do chumbo farmacêutico, mas pode causar grandes danos e estresse aos animais experimentais, o que pode afetar os resultados. A cannulação venosa jugular (JVC) em ratos é um modelo amplamente utilizado para coleta repetida de sangue, mas requer treinamento adequado de habilidades cirúrgicas e cuidados com animais. Este artigo detalha os procedimentos microcirúrgicos para estabelecer e manter um modelo permanente de ratos JVC com foco específico na colocação e vedação da cânula jugular. A importância do monitoramento fisiológico (por exemplo, peso corporal, alimentação e ingestão de água) e parâmetros hematológicos, foi destacada com resultados apresentados durante 6 dias após a cirurgia durante a recuperação do rato. O perfil de tempo de concentração de plasma de drogas administradas oralmente ácido ellagico foi determinado no modelo de rato JVC.

Introdução

A repetida aquisição de amostras de sangue de pequenos animais de laboratório, como roedores, cobaias e coelhos, é um aspecto importante para a otimização do chumbo farmacêutico e também para a redução do número de animais utilizados na pesquisa ^1,2. O pipeline para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico e formulação de medicamentos (por exemplo, vacina) requer acesso a diferentes volumes de sangue, a fim de avaliar sua robustez e desempenho in vivo, como farmacocinética (PK), toxicidade e sensibilidade ^3,4,5.

A abordagem laboratorial para coleta de amostras de sangue é amplamente classificada em dois tipos, cirúrgico e não cirúrgico⁶. A abordagem não cirúrgica é relativamente fácil de entender para o pesquisador, o que inclui técnicas comuns, como punção cardíaca, punção sinusal orbital e sangramento da veia safena e da cauda. A amostragem múltipla de sangue é possível por alguns métodos não cirúrgicos, mas o volume amostral é pequeno e pode causar ferimentos físicos e estresse psicológico aos animais¹. Por outro lado, a abordagem cirúrgica é uma alternativa favorita à venipuntura repetida, e envolve a colocação de uma cânula temporária ou permanente nos vasos sanguíneos dos animais ^7,8,9. O grande volume sanguíneo poderia ser repetidamente retirado através da cânula em ratos conscientes, evitando o estresse e a dor devido à técnica de manuseio, contenção e anestesia 7,8,10,11. No entanto, a implantação da cânula requer um pesquisador experiente com treinamento adequado para coletar o sangue com sucesso.

A coleta de sangue através da cannulação venosa jugular (JVC) em ratos é o método mais utilizado para estudar a droga PK 6,10,12,13. No entanto, o estabelecimento do modelo jvc de ratos precisa de uma prática cuidadosa de habilidades microcirúrgicas e conhecimento de cuidados pós-cirúrgicos e manutenção. Especialmente, após a cirurgia, o rato requer administração de analgésicos e tempo de recuperação suficiente para atingir condição fisiológica estável para novos experimentos 13,14,15. Embora o ganho de peso corporal (ou seja, >10 g) seja um indicador válido e comumente aplicado para a recuperação do rato, não é incomum que os ratos tenham morte inesperada no pós-operatório devido à desidratação, infecção e inflamação, o que pode ser sutil de notar no início precoce^14,15. Além disso, a obstrução do cateter no modelo JVC continua a ser um problema durante a coleta de sangue.

O presente protocolo demonstrou em detalhes os procedimentos microcirúrgicos para JVC em um rato anestesiado com foco específico na identificação, isolamento e cannulação da veia jugular. Destaca-se a importância do monitoramento fisiológico e hematológico dos ratos durante a fase de recuperação. Finalmente, amostras de sangue em série foram coletadas através do cateter venoso para estudar o PK do ácido ellagico natural administrado oralmente com baixa biodisponibilidade (ou seja, baixa concentração sistêmica) para verificar o modelo de rato JVC.

Protocolo

Os procedimentos descritos abaixo foram realizados como parte de um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Politécnica do Noroeste (No. 202101117).

1. Preparação pré-operatória (um dia antes da cirurgia)

NOTA: Soluções necessárias: soro fisiológico normal (cloreto de sódio 0,9% w/v), soro fisiológico heparinizado (1% c/v heparina de sódio), solução de bloqueio de cateter, anti-inflamatório não esteroide (NSAID), como solução meloxicam (2 mg/mL).

1. Preparação da solução
   1. Aliquot 200 μL de solução de bloqueio de cateter pré-embalado em um tubo de microcentrifuge estéril de 1,5 mL.
      NOTA: A solução de bloqueio de cateter é composta por soro fisiológico heparinizado (0,4% v/v de sódio heparina) misturado com glicerol (v/v,1:1).
   2. Misture 1 g de sódio de heparina em 100 mL do soro fisiológico normal para preparar 1% de soro fisiológico heparinizado.
   3. Dissolva a meloxicam em soro fisiológico normal para preparar uma solução de concentração de 2 mg/mL para alívio da dor pós-operatório.
      NOTA: A solução de solução de soro fisiológico heparinizado preparado e meloxicam é filtrada através de um filtro de 0,22 μm. Todas as soluções são esterilizadas e armazenadas a 4°C para uso futuro.
2. Instrumentos cirúrgicos e materiais
   1. Embale todas as ferramentas cirúrgicas limpas em uma bolsa e grave-a com um pedaço de fita de esterilização autoclave. Consulte a Figura 1A para os instrumentos cirúrgicos específicos utilizados.
   2. Autoclave a bolsa cirúrgica a 121 °C por 30 min para o uso do dia seguinte.
3. Preparação animal
   1. Antes da cirurgia, abriga todos os ratos machos Sprague-Dawley (SD) na Sala Animal padrão com temperatura controlada a 22 ± 1 °C. Alimente-os com o alimento de laboratório padrão e ad libitum de água por pelo menos 7 dias.
      NOTA: Tanto os ratos machos quanto os femininos podem ser usados para o modelo JVC, e suas idades típicas e pesos corporais variam de 9-14 semanas e 294 ± 57 g, respectivamente.
   2. Anestesiar o rato com 3%-3,5% de isoflurane misturado com oxigênio em uma câmara pré-anestesia. Determine se o rato fica inconsciente pela falta de resposta ao aperto no pé.
   3. Leve suavemente o rato para fora, coloque o nariz do rato em uma peça de nariz anestésico fornecendo 2%-2,5% de isoflurano.
   4. Na posição ventral e dorsal, remova a pele completamente ao redor do ombro direito e áreas posteriores do pescoço com creme depilatório e uma navalha de estimação. Devolva o rato para a gaiola para a cirurgia a ser realizada no dia seguinte.

2. Antes da cirurgia no dia

1. Prepare a estação de trabalho asséptica
   1. Pulverizar 75% de álcool médico para desinfetar a área de operação e, em seguida, colocar a almofada de aquecimento coberta com uma almofada limpa. Coloque a lâmpada LED com uma fonte de luz fria ao lado da estação de trabalho.
   2. Pré-aqueça as soluções necessárias (passo 1.1) à temperatura ambiente.
   3. Encha 0,6 mL de soro fisiológico heparinizado e 0,15 mL de solução de bloqueio de cateter em duas seringas estéreis de 1,0 mL de pontas cegas, respectivamente. Retire 2,5 mL do soro fisiológico normal usando uma seringa estéril de 5,0 mL.
   4. Mergulhe as bolas de algodão em 75% de álcool médico. Esprema o excesso de etanol antes de usar.
   5. Pese e grave o peso corporal do rato.

3. Durante a cirurgia

1. Preparação cirúrgica
   1. Use o casaco cirúrgico, luvas estéreis e máscara facial. Em seguida, abra a bolsa cirúrgica esterilizada, deixe todas as ferramentas cirúrgicas em 75% de álcool médico e seque-as antes do uso.
2. Isolamento da veia jugular
   NOTA: O tempo estimado de operação para esta parte é de 10 minutos.
   1. Anestesiar o rato pronto para a cirurgia e raspar com isoflurane de 3%-3,5% misturado com oxigênio em uma câmara de indução e determinar se o rato fica inconsciente pela falta de resposta ao aperto no pé.
   2. Coloque o nariz do rato na peça do nariz fornecida com isoflurane de 2%-2,5% para manter a anestesia.
   3. Injete subcutâneamente (s.q.) solução meloxicam a uma dose de 2 mg/kg.
      NOTA: Certifique-se de selecionar analgésicos que não interagem com o composto medicamentoso de interesse no estudo farmacocinético.
   4. Usando fita adesiva, contenha os antebraços do rato em sua posição ventral para cada lado da plataforma cirúrgica.
   5. Esfregue suavemente a área cirúrgica alternando entre bolas de algodão encharcadas em 75% de álcool médico e esfoliante à base de iodo por um total de três vezes.
   6. Levante cuidadosamente a pele perto da clavícula no lado direito da linha média do pescoço com fórceps e faça uma incisão em direção ao peito com cerca de 1,5-2,0 cm de comprimento com um par de tesouras cirúrgicas.
   7. Dissecar a tampa fina do tecido com uma tesoura de íris para expor a veia jugular inferior. A extremidade cefálica proximal da veia jugular externa consiste em dois ramos, que podem ser identificados visualmente.
      NOTA: Dependendo da idade e sexo do rato, o tecido mole (por exemplo, glândulas salivares, nódulos linfáticos e tecidos gordurosos) que cobrem a veia jugular varia. Em comparação com os ratos jovens, os ratos antigos são mais gordos (por exemplo, BW > 300 g), e assim precisam de mais separação tecidual antes que a veia jugular seja visível.
   8. Levante a veia jugular junto com seus tecidos membranous conjuntivos para visualizar a glândula linfática presa à veia jugular. Separe cuidadosamente a veia ao longo da direção vascular do músculo circundante, gordura e outros tecidos.
   9. Cutuca os fórceps sob a veia jugular sem danificar os vasos sanguíneos colaterais e passar dois pedaços de sutura 6-0 sob a veia para marcar as duas extremidades do vaso sanguíneo individualmente.
   10. Puxe um pedaço da sutura o mais longe possível em direção à cabeça do rato e liga a veia cranialmente com 2-3 nós usando fórceps.
   11. Coloque a segunda ligadura na extremidade caudal da veia com 1 nó solto.
3. Cannulação da veia jugular
   NOTA: O tempo estimado de operação para esta parte é de 15 minutos.
   1. Abra o pacote contendo cateter de poliuretano (PU) de 11 cm (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, Figura 1B) e conecte o cateter à seringa de ponta cega preparada preenchida com o soro fisiológico heparinizado.
   2. Empurre lentamente o soro fisiológico heparinizado para dentro do cateter para evitar bolhas de ar.
   3. Cutuque o lado plano não-ponta dos fórceps sob a veia jugular para sair do outro lado. Faça um pequeno corte em forma de V na veia perto da gravata craniana com um par de micro tesouras castroviejo e abra suavemente a incisão com a ponta dos fórceps dilatadores do vaso do cotovelo.
      NOTA: Enxágüe a incisão com soro fisiológico normal pré-aquecido (37 °C) se uma pequena quantidade de sangue jorra.
   4. Corte a abertura oblíqua da parte frontal do cateter vesculato jugular. Aperte a extremidade oblíqua do tubo com fórceps e deslize-a para a veia jugular.
      NOTA: Esta etapa pode precisar de outra pessoa para facilitar o deslizamento do cateter.
   5. Ao avançar no cateter, retire lentamente as fórceps microcirúrgicas do cotovelo e fixe a superfície externa do vaso com fórceps.
      NOTA: Se o vaso sanguíneo certo for selecionado e a ponta do cateter for deslizada com sucesso para dentro do vaso sanguíneo, todo o processo de inserção do cateter não deve sentir qualquer resistência ao fluxo.
   6. Pare de inserir o cateter ao atingir a primeira marca azul do tubo PU (Figura 1B), que tem aproximadamente 3,0 cm de comprimento.
   7. Fixar o cateter inserido na veia com ligaduras caudais e rostrais usando fórceps.
   8. Rosqueie uma sutura de 6-0 através do tecido exposto no lado direito da incisão usando uma agulha de sutura (corte curvo de 1/2, 12 mm) e amarre a ligadura com um hemostata.
   9. Dobre o cateter na segunda marca azul (Figura 1B) para ligar com a mesma ligadura (na etapa 3.3.8) e evitar oclundo o tubo de PU.
   10. Corte toda a rosca de sutura extra e feche o cateter substituindo a seringa com ponta atada por um plugue de aço inoxidável de 22 G.
4. Exteriorização do cateter
   NOTA: O tempo estimado de operação para esta parte é de 10 minutos.
   1. Coloque o rato na posição dorsal e limpe suavemente a área entre a escápula com a bola de algodão encharcada em 75% de álcool médico.
   2. Faça uma incisão muito pequena no centro do pescoço dorsal com uma tesoura cirúrgica. Através da incisão dorsal, guie e empurre suavemente o trochar sob a pele em direção à incisão ventral no lado direito do pescoço.
   3. Coloque o cateter venoso no trochar e, em seguida, puxe para fora e guie o cateter venoso em direção à incisão dorsal.
   4. Fixar o cateter exteriorizado na camada muscular da mesma forma com a sutura (veja o procedimento nas etapas 3.3.8 e 3.3.9).
   5. Feche a camada de pele de incisões ventrais e dorsais com a sutura de nylon 6-0 e agulha de sutura (3/8 corte curvo, 17 mm). Cosmei todas as incisões cirúrgicas com iodophor.
      NOTA: Os clipes de ferida são um método alternativo para fechar a incisão da pele.
   6. Remova o plugue do cateter apertando o cateter com as pontas dos dedos. Coloque uma nova seringa com pontada e lentamente retire a seringa para testar o fluxo sanguíneo.
      NOTA: Uma vez que o rato está na posição supina, pode-se não ser capaz de obter amostras de sangue. Amostras de sangue podem ser obtidas mudando para uma posição lateral do corpo.
   7. Segure novamente o cateter com as pontas dos dedos e injete 0,2 mL de soro fisiológico heparinizado e 0,1 mL de solução de bloqueio no cateter usando a seringa de ponta sem corte.
   8. Segure o cateter com as pontas dos dedos e substitua a seringa por um plugue de aço inoxidável. Desesclaria o cateter e empurre ligeiramente o plugue para garantir o aperto do cateter.

4. Cuidados pós-cirúrgicos imediatos

1. Recupere o rato na posição de decúbito dorsal, reduzindo-o individualmente com a cama de corncob fresco. Muitas vezes, forneça uma almofada de aquecimento regulada pela temperatura para manter a temperatura corporal do núcleo.
   NOTA: Para o bem-estar animal, deixar comida e água na cama é uma maneira eficaz de aliviar a dor causada pelos movimentos do pescoço ao comer e beber.
2. Regisso tempo final da cirurgia e monitore o rato em intervalos de 2h por pelo menos 4h. Forneça analgesia adicional para a recuperação se o rato mostrar sinais de dor ou angústia.

5. Monitoramento fisiológico e hematológico durante a fase de recuperação

1. Monitore o peso corporal e a ingestão de alimentos e água diariamente e registe os dados.
2. Para coletar um pequeno volume de sangue fresco para o teste hematológico, coloque o rato em um contidor. Abra o plugue e insira a seringa no cateter pu venoso para garantir que o cateter não esteja obstruído.
   NOTA: A coleta de sangue foi realizada ao mesmo tempo diariamente por 6 dias consecutivos.
3. Descarte o sangue retirado inicial, que contém uma mistura de sangue, soro fisiológico heparinizado e solução de bloqueio de cateter.
4. Use uma nova seringa para coletar 150 μL de amostra de sangue fresco e transferir a amostra de sangue para o tubo de 0,5 mL contendo spray K2EDTA (1,8 mg/mL de sangue) seco na parede do tubo.
   NOTA: Se o cateter estiver bloqueado, 0,2 mL de soro fisiológico heparinizado podem ser injetados no cateter para lavar o cateter alguns minutos antes do próximo tempo de coleta de sangue.
5. Injete soro fisiológico estéril no mesmo volume para compensar o sangue retirado. Injete 150 μL de soro fisiológico normal pré-aquecido (37 °C) e infundir 0,2 mL de soro fisiológico normal heparinizado pelo cateter.
6. Injete 100 μL da solução de bloqueio no cateter para garantir a vedação e a esterilidade do cateter antes da próxima coleta de amostras.
7. Analise as amostras de sangue dentro de 2h de coleta usando um contador automatizado de células sanguíneas.

6. Amostragem de sangue repetida para estudos farmacocinéticos de medicamentos administrados oralmente

NOTA: Sugere-se que ratos com ganho de peso >10 g e nível hematológico estável sejam inscritos para estudo futuro. Seguindo o protocolo atual, os ratos JVC exigiram de 4 a 6 dias para se recuperarem.

1. Após 4-6 dias de cirurgia, acelere o rato por 12h com livre acesso à água.
   NOTA: Dependendo do objetivo experimental, o jejum do animal é opcional.
2. Gavage oralmente o rato jejuado com ácido bioativo de fenol natural a uma dose de 6 mg/kg com uma agulha de gavage reta¹⁶.
3. Coletar 200 μL de amostras de sangue nos tubos heparinizados através da cânula venosa jugular em pontos de tempo pré-determinados acima de 24 horas de administração pós-oral. O processo de coleta de sangue segue o procedimento na etapa 5.5.
   NOTA: O cateter não precisa ser fechado com a solução de bloqueio até que a coleta de sangue seja concluída.
4. Imediatamente centrifufique a amostra de sangue a 3000 x g a 4 °C por 10 min.
5. Analise a amostra de plasma extraída por espectroscopia de massa cromatografia líquida^17,18.

Resultados

Este protocolo demonstrou minuciosamente como estabelecer um modelo JVC de longo prazo usando habilidades microcirúrgicas para coleta de sangue serial. A Figura 1A mostra os instrumentos cirúrgicos essenciais e materiais utilizados para a realização da cirurgia. A especificação do cateter PU com três marcas azuis também é ilustrada, o que é útil para orientar o pesquisador a colocar a cânula venosa na etapa 3.3., como usar as marcas no cateter pu para guiar a cannulaçã...

Discussão

Dominar a técnica de cannulação de vasos requer prática significativa e aprender a lição de cada operação. Christakis et al. usando a análise da soma cumulativa (CUSUM), descobriram que um pesquisador precisa praticar 200 ratos durante um período de um ano antes de estar pronto para a avaliação pk de candidatos a medicamentos²⁰. No entanto, o tempo de operação necessário para a cannulação venosa pode ser significativamente reduzido pelo número de ratos realizados

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant	Xinkang	N/A	collecting blood samples for hematology test
0.5*20 mm 1.0-mL syringe	KLMEDICAL	N/A	washing or replacing the fluid with saline
0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe	HD	N/A	Subcutaneous injection
1.0-mL Blunt tipped syringe (22G)	skillsmodel	S4-PKT22G	Inject the saline and collect blood samples through catheter
1.5 mL sterile microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S	Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution
1.5 mL microcentrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M	blood collection
1/2  circle cutting 5*12 mm suture needle	skillsmodel	S4-FHZ	Thread the muscle layer to fix the catheter
3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle	skillsmodel	S5-FHZ	Suture the incision of rat cortex
6-0 sterile non-absorbable silk suture thread	JUNSHENG	N/A	ligature
75% medical alcohol	HONGSONG	N/A	Disinfection
Adhensive tape	LIUTAI	N/A	positioning the rat
Autoclave sterilization tape	Biosharp	BS-QT-028	Mark sterilized items
Automated blood cell counter	Sysmex	XN-550	Hematology test
Castroviejo micro scissors	skillsmodel	WA1010	Cut the opening in the blood vessel
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Plasma preparation
Clean cushion	Qingjie	N/A	Prepare the operation area
Cotton balls	HC	N/A	Wound disinfection and sterilization
Cotton swabs	BEITAGOGO	N/A	Disinfection
Curved hemostat	skillsmodel	N/A	ligature
DN50 Stainless-steel rat restrainer	skillsmodel	S4-RGDQ1	Restrict the movement of rats for easy operation
Ellagic acid	Aladdin	E102710-25g	natural phenol for oral administration
Half-curved forceps	skillsmodel	53072	Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture
Heating pad	Warm mate	N/A	preventing heat loss of animal
Heparin sodium	Solarbio	H8060	anticoagulant
Iodophor	Xidebao	N/A	Clean the wound
Iris scissors	skillsmodel	54002	Bluent separation the muscle layer
Isoflurane	RWD	R510-22-16	anaesthesia
LED lamp	EMPERORFEEL	N/A	sugery
Liquid chromatography-mass spectroscopy	Thermo Fisher Scientific	VQF01-20001/ TSQ02-10002	detection of drug concentration in plasma
Meloxicam	Hongqiang	N/A	Analgesic
Normal saline	KL	N/A	Prepara the solution and protect blood vessels from drying out
Pet razor	Codos	3180	Shaving the fur
Phosphate-buffered saline	ZHHC	PW012	Preparation of Ellagic acid solution
PU catheter	skillsmodel	RJVC-PU	Jugular vein cannulation
Small animal operation anesthesia console	RWD	68620	Operation workstation
Spray bottle	Other	N/A	aseptic workstation
Stainless steel plug (22G)	skillsmodel	S4-PKD22G	Plug the catheter to ensure its sealing
Stainless steel trochar	skillsmodel	S$-PKDGZ	Guide the catheter exteriorization
Sterile lock solution	skillsmodel	SK-FB	lock the catheter to ensure its sterility
Straight feeding needle	skillsmodel	N/A	Oral gavage
Surgical pouch	BKMAM	N/A	container for sterilization of surgical instruments
Surgical scissors	skillsmodel	J21070	Cut incision on rat skin
Vessel dilator balanced forceps	skillsmodel	WA3020	Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in
ZS-MV Small animal anesthesia machine	ZSLab	1057003	inducing and maintaining anaesthesia