Aplicaciones de la interferencia de ARN en cucarachas americanas

Resumen

El presente protocolo describe las pautas paso a paso para las técnicas de operación de ARNi en P. americana.

Resumen

Las cucarachas, una plaga sanitaria, son especies esenciales en el desarrollo de insectos y estudios metamórficos debido a su fácil alimentación y características hemimetábolas. Junto con secuencias genómicas bien anotadas, estas ventajas han hecho de la cucaracha americana, Periplaneta americana, un importante modelo de insecto hemimetábolo. Limitado por la escasez de estrategia de knockout, el knockdown de genes efectivo basado en la interferencia de ARN (RNAi) se convierte en una técnica indispensable en la investigación de genes funcionales de P. americana. El presente protocolo describe las técnicas de operación de ARNi en P. americana. El protocolo incluye (1) la selección de la P. americana en las etapas de desarrollo adecuadas, (2) la preparación para el ajuste de la inyección, (3) la inyección de dsRNA y (4) la detección de la eficiencia de derribo de genes. El ARNi es una poderosa herramienta genética inversa en P. americana. La mayoría de los tejidos de P. americana son sensibles al dsRNA extracelular. Su simplicidad permite a los investigadores obtener rápidamente fenotipos disfuncionales bajo una o múltiples inyecciones de dsRNA dirigidas, lo que permite a los investigadores utilizar mejor la P. americana para estudios de desarrollo y metamórficos.

Introducción

La interferencia de ARN (RNAi), un mecanismo conservado evolutivamente, se convierte gradualmente en una herramienta genética inversa esencial para inhibir la expresión génica en muchos organismos¹, ya que Andrew Fire y Craig Mello² desarrollaron la estrategia de silencio genético mediado por ARN de doble cadena (dsRNA). El dsRNA se escinde en fragmentos de 21-23 nucleótidos, pequeños ARN interferentes (siRNAs), por la enzima Dicer en las células para activar la vía del ARNi. Luego, los siRNAs se incorporan al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que se acopla al ARNm objetivo, causa la escisión del ARNm y finalmente resulta en la pérdida de la función^{del gen 3,4,5}. Entre las especies de insectos, hasta ahora se han reportado muchos experimentos sistémicos de ARNi en muchos órdenes de insectos, como Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera y Blattodea 5,6,7,8.

Las cucarachas (Blattaria) son una familia de insectos esenciales en estudios de desarrollo y metamórficos con sus ciclos de crecimiento rápido, fuerte adaptabilidad al medio ambiente y alta plasticidad de desarrollo⁹. Antes de descubrir que el ARNi era compatible con las cucarachas, las investigaciones anteriores solo se centraron en la prevención y el control de las cucarachas debido a la escasez de técnicas de manipulación genética en las cucarachas. La estructura única de la cucaracha ootheca hizo que fuera un desafío realizar la eliminación de genes basada en inyección de embriones con el sistema CRISPR-Cas9. Además, la mayoría de los tejidos de las cucarachas (como P. americana) muestran una respuesta arNi sistémica robusta, lo que permite la rápida generación de fenotipos disfuncionales mediante la inyección de uno o más dsRNAs^{dirigidos 9,10,11}. Estas características hicieron del ARNi una técnica indispensable en la investigación funcional génica en P. americana.

A pesar de que se ha informado del uso de ARNi en la investigación de genes funcionales en P. americana , no se disponía de una descripción detallada o paso a paso. Este informe proporciona una guía operativa paso a paso para el ARNi en P. americana, útil para el estudio de la función génica en otras cucarachas. Además, esta guía no se limita a Blattodea y se puede aplicar a muchos otros insectos con modificaciones menores.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

La línea de P. americana fue proporcionada inicialmente por el Dr. Huiling Hao. Esta especie se ha mantenido con endogamia durante 30 años⁹.

1. Eclosión y alimentación de P. americana

1. Recolecte ootecas frescas (inmediatamente después de la puesta de huevos) de P. americana e incube en la incubadora oscura a 25 ° C y 60% de humedad durante ~ 25 días. Luego aumente la temperatura y la humedad a 30 ° C y 75% 3 días antes de la eclosión.
2. Use un tamiz con una apertura de 4 mm para separar las ninfas eclosionadas de las ootecas.
3. Mantenga las ninfas en recipientes cilíndricos (12 cm de diámetro y 10 cm de altura) en la oscuridad a 28 ° C, 70% de humedad. Cepille el borde interior de los recipientes con vaselina para evitar que las cucarachas se escapen. Proporcione comida para ratas, agua y refugio (bandejas de huevos). Preste atención a la actividad de las ninfas y limpie regularmente las heces y los escombros.

2. Selección de las ninfas en el instar adecuado

1. Use un tubo de vidrio para elegir la P. americana recién muda (color blanco en el cuerpo). Manténgalos en recipientes nuevos y espere la etapa correcta para el tratamiento.
   NOTA: Después de ~ 19 días bajo las condiciones de alimentación anteriores, las ninfas en el^3er instars estarán disponibles para inyección. El color de las cucarachas recién mudadas es blanco, y las estrellas se aclaran mediante tiempos de muda.

3. Preparación del fragmento objetivo con los promotores T7

1. Utilizando el ADNc de P. americana como plantilla, diseñó cebadores pareados para realizar PCR para obtener un fragmento de ADN de 300-800 pb del gen diana⁹. A continuación, clone el fragmento de PCR en un vector pTOPO (ver Tabla de Materiales) para su secuenciación.
2. Utilizando el fragmento diana de ADN como plantilla, sintetizar un nuevo par de cebadores con secuencia promotora T7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') en los terminales 5' y realizar otra ronda de PCR para obtener el fragmento diana con promotores T7 en cada lado⁹.

4. Transcripción y síntesis de dsRNA in vitro

1. Añadir 10 μL de T7 2X Buffer, 2 μL de Enzyme Mix, T7 Express (ver Tabla de Materiales) y 2 μg de producto de PCR (obtenido en el paso 3.2) en el sistema de reacción y sumar el volumen total a 20 μL con ddH₂O. Mezclar suavemente boca abajo manualmente e incubar a 37 °C durante 30 min y 70 °C durante 10 min, y luego enfriar lentamente a temperatura ambiente.
2. Solución diluida de RNasa A (4 μg/μL) con ddH₂O en una proporción de 1:200. A continuación, agregue 1 μL de DNasa libre de RQ1 RNasa (1 U/μL) y 1 μL de solución diluida de RNasa A al sistema (consulte la Tabla de Materiales).
   NOTA: Ahora, el volumen de un solo sistema es de 22 μL.
3. Incubar a 37 °C durante 30 min. Luego agregue el 10% del volumen total (al realizar reacciones N simultáneamente, el volumen total es N x 22 μL) de acetato de sodio y tres volúmenes del volumen total de isopropanol.
4. Mezclar suavemente boca abajo manualmente, colocar sobre hielo durante 5 min y centrifugar a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
5. Retire el sobrenadante con una pipeta, lave el residuo con etanol al 75% (con agua tratada con 25% de pirocarbonato dietílico (DEPC)) y luego centrífique a 13.000 x g durante 5 min a 4 °C.
6. Retire el sobrenadante de nuevo. Seque el pellet al aire durante 15 minutos a temperatura ambiente. Use ~ 100 μL de agua DEPC para disolver dsRNA, luego diluya el dsRNA a los 2 μg / μL finales.
   NOTA: El dsRNA podría almacenarse a -80 °C durante 6 meses.

5. Carga de la solución de dsRNA en la jeringa

1. Configure el programa en la bomba de microinyección (consulte la Tabla de materiales) con anticipación para garantizar que el volumen de cada inyección sea consistente. Antes de usar la jeringa, limpie la jeringa llenándola con agua DEPC 8-10 veces.
2. Instale la jeringa de 10 μL en la bomba de microinyección, encienda la bomba y llene la jeringa con 10 μL de solución de dsRNA (preparada en el paso 4.6). Inyecte 1 μL del dsRNA en una^3ª ninfa instar (consulte el paso 2) y asegúrese de que no se filtre al cuerpo.

6. Inyección de dsRNA a P. americana

1. Anestesiar las cucarachas con una mayor concentración de CO₂ en un recipiente hasta que las cucarachas ya no se muevan, y luego proceder inmediatamente con la inyección.
2. Levante suavemente la cucaracha con pinzas y entregue la cucaracha hacia la aguja con la mano. A continuación, inserte la aguja a través del espacio entre dos somitas abdominales horizontalmente contra la epidermis. Acerca de la profundidad de inserción, cuanto menos profundo, mejor.
3. Luego, inyecte la solución de dsRNA en la cucaracha. Finalmente, saque la punta de la aguja. Asegúrese de que la punta de la aguja esté lo más cerca posible de la epidermis para evitar dañar los órganos internos.
   NOTA: La inyección debe hacerse bajo un microscopio de disección.
4. Coloque las cucarachas inyectadas en recipientes limpios de bioensayo. Espere unos 10-20 minutos para que se recuperen de los efectos del CO₂ . Etiquete los envases con la fecha de inyección, el tipo y la dosis de dsRNA, y la edad de la P. americana.
5. Coloque las cucarachas inyectadas en un ambiente oscuro a 28 ° C, 70% de humedad, proporcione agua, alimento y refugio, y observe posibles cambios en el fenotipo de las cucarachas regularmente.

7. Confirmación de derribo y análisis fenotípico

1. Evalúe la eficiencia del ARNi utilizando cualquier técnica de biología molecular disponible, como la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y western blotting. Para conocer los procedimientos detallados de qRT-PCR y Western blotting, consulte las Referencias ^1,12.
2. Para observar y analizar fenotipos relacionados con el ARNi, utilice el microscopio adecuado para animales vivos.
   NOTA: El ARNi puede afectar la morfología, el comportamiento, la muda, la regeneración de las extremidades y otras actividades fisiológicas de las cucarachas. La frecuencia específica del fenotipo se calcula de acuerdo con condiciones específicas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

La Figura 1 muestra una inyección exitosa. La jeringa de microinyección con una aguja de micro diámetro debe colocarse horizontalmente en el amplificador (Figura 1A). La aguja se inserta a través del espacio entre dos somitas abdominales horizontalmente contra la epidermis (Figura 1B). Asegúrese de que el líquido entre en el abdomen de P. americana . El ángulo demasiado pronunciado de la aguja dañará los ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Este informe describió una estrategia metodológica de ARNi paso a paso en P. americana; Cabe destacar que también se puede aplicar a otras cucarachas (Blattella germanica, por ejemplo) y muchos otros insectos con cambios menores. Sin embargo, la eficiencia de silenciamiento génico del ARNi no siempre es lo suficientemente alta, con una desventaja obvia en comparación con la estrategia de eliminación^{de genes 13}. El siguiente efecto residual a nivel de gen puede interferir co...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
701 N 10 µL Syr (26s/51/2)	Hamilton	PN:80300	Injection
Incubator	Ningbo Jiangnan Instrument Factory	RXZ-380A-LED	For cockroaches hatching and feeding
Micro-injection pump	Alcott Biotechnology	ALC-IP600	Injection
pTOPO-Blunt Cloning Kit	Aidlab Biotechnology	CV16	For Gene clonging
quantitative Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	CFX Connect	For qRT-PCR analysis
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase
Thermal Cyclers	Bio-Rad	S1000	For DNA amplification