JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает пошаговые рекомендации по методам эксплуатации РНКи в P. americana.

Аннотация

Тараканы, санитарный вредитель, являются важными видами в исследованиях развития насекомых и метаморфических исследований из-за их легкого кормления и гемиметаболических характеристик. В совокупности с хорошо аннотированными последовательностями генома эти преимущества сделали американского таракана, Periplaneta americana, важной моделью гемиметаболических насекомых. Ограниченный нехваткой нокаут-стратегии, эффективный нокдаун генов на основе РНК-интерференции (РНКи) становится незаменимым методом в функциональных генных исследованиях P. americana. Настоящий протокол описывает методы работы РНКи в P. americana. Протокол включает в себя (1) отбор P. americana на соответствующих стадиях развития, (2) подготовку к установке инъекции, (3) инъекцию дцРНК и (4) обнаружение эффективности нокдауна генов. РНКи является мощным обратным генетическим инструментом у P. americana. Большинство тканей P. americana чувствительны к внеклеточной дцРНК. Его простота позволяет исследователям быстро получать дисфункциональные фенотипы под одной или несколькими целевыми инъекциями дцРНК, что позволяет исследователям лучше использовать P. americana для исследований развития и метаморфизма.

Введение

РНК-интерференция (РНКи), эволюционно сохраненный механизм, постепенно становится важным обратно-генетическим инструментом для ингибирования экспрессии генов во многих организмах1, поскольку Эндрю Файр и Крейг Мелло2 разработали стратегию двухцепочечной РНК (дцРНК), опосредованной генной тишины. дцРНК расщепляется на фрагменты 21-23 нуклеотидов, небольших интерферирующих РНК (siRNAs), ферментом Dicer в клетках для активации пути RNAi. Затем siRNAs включаются в РНК-индуцированный комплекс глушения (RISC), который соединяется с целевой мРНК, вызывает расщепление мРНК и, наконец, приводит к потере функции гена 3,4,5. Среди видов насекомых до сих пор сообщалось о многих системных экспериментах RNAi во многих отрядах насекомых, таких как Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera и Blattodea 5,6,7,8.

Тараканы (Blattaria) являются важным семейством насекомых в исследованиях развития и метаморфизма с их быстрыми циклами роста, сильной приспособляемостью к окружающей среде и высокой пластичностью развития9. Прежде чем обнаружить, что RNAi совместим с тараканами, предыдущие исследования были сосредоточены только на профилактике и контроле тараканов из-за нехватки методов генетических манипуляций у тараканов. Уникальная структура таракана оотеки усложнила выполнение нокаута гена на основе инъекций эмбрионов с помощью системы CRISPR-Cas9. Кроме того, большинство тканей у тараканов (таких как P. americana) демонстрируют устойчивый системный ответ РНКи, что позволяет быстро генерировать дисфункциональные фенотипы путем инъекции одного или нескольких дцРНК 9,10,11. Эти особенности сделали РНКи незаменимым методом в генных функциональных исследованиях у P. americana.

Несмотря на то, что об использовании РНКи в исследованиях функциональных генов у P. americana сообщалось, подробного или пошагового описания не было. В этом отчете представлено одно пошаговое операционное руководство для RNAi у P. americana, полезное для изучения функции генов у других тараканов. Кроме того, это руководство не ограничивается Blattodea и может быть применено ко многим другим насекомым с незначительными изменениями.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Линия P. americana была первоначально предоставлена доктором Хуэйлин Хао. Этот вид поддерживается инбридингом в течение 30 лет9.

1. Вылупление и кормление P. americana

  1. Соберите свежие оотеки (сразу после яйцекладки) P. americana и инкубируйте в темном инкубаторе при 25 °C и влажности 60% в течение ~ 25 дней. Затем увеличьте температуру и влажность до 30 °C и 75% за 3 дня до вылупления.
  2. Используйте сито с отверстием 4 мм, чтобы отделить заштрихованных нимф от оотеков.
  3. Храните нимф в цилиндрических контейнерах (12 см в диаметре и 10 см в высоту) в темноте при 28 °C, влажности 70%. Смажьте внутренний край контейнеров вазелином, чтобы предотвратить побег тараканов. Обеспечьте крысиную пищу, воду и укрытие (лотки для яиц). Обращайте внимание на активность нимф и регулярно убирайте кал и мусор.

2. Подбор нимф в правильной звезде

  1. Используйте стеклянную трубку, чтобы выбрать свежеливую P. americana (белого цвета тела). Храните их в новых емкостях и дождитесь правильного этапа лечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через ~19 дней при вышеуказанных условиях кормления нимфы в3-х звездах будут доступны для инъекций. Цвет свежелифованных тараканов белый, а звездочки проясняются временем линьки.

3. Подготовка целевого фрагмента с промоторами Т7

  1. Используя кДНК P. americana в качестве шаблона, разработали парные праймеры для выполнения ПЦР для получения фрагмента ДНК 300-800 bp гена-мишени9. Затем клонируйте фрагмент ПЦР в вектор pTOPO (см. Таблицу материалов) для секвенирования.
  2. Используя целевой фрагмент ДНК в качестве шаблона, синтезируют одну новую пару праймеров с последовательностью промоторов Т7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') на 5' терминалах и выполняют еще один раунд ПЦР для получения целевого фрагмента с промоторами Т7 на каждой стороне9.

4. Транскрипция и синтез дцРНК in vitro

  1. Добавьте 10 мкл буфера T7 2X, 2 мкл ферментной смеси, T7 Express (см. Таблицу материалов) и 2 мкг продукта ПЦР (полученного на стадии 3.2) в реакционную систему и добавьте общий объем до 20 мкл с ddH2O. Осторожно перемешайте вверх ногами вручную и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин и 70 °C в течение 10 мин, а затем медленно остудить до комнатной температуры.
  2. Раствор РНКазы А (4 мкг/мкл) с ddH2Oв соотношении 1:200. Затем добавляют в систему 1 мкл RQ1 RNase-Free DNase (1 U/μL) и 1 мкл разбавленного раствора RNase A (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь объем одной системы составляет 22 мкл.
  3. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин. Затем добавляют 10% от общего объема (при одновременном выполнении N-реакций общий объем составляет N x 22 мкл) ацетата натрия и три объема от общего объема изопропанола.
  4. Аккуратно перемешать вверх ногами вручную, поместить на лед на 5 мин и центрифугу при 13 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  5. Удалите супернатант пипеткой, промыть остаток 75% этанолом (с 25% диэтилпирокарбонатом (DEPC) очищенной водой), а затем центрифугировать при 13 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  6. Снова удалите супернатант. Высушите гранулы на воздухе в течение 15 мин при комнатной температуре. Используйте ~100 мкл воды DEPC для растворения дцРНК, затем разбавьте дцРНК до конечных 2 мкг/мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДцРНК может храниться при -80 °C в течение 6 месяцев.

5. Загрузка раствора дцРНК в шприц

  1. Настройте программу в микроинжекционном насосе (см. Таблицу материалов) заранее, чтобы обеспечить согласованность объема каждого впрыска. Перед использованием шприца очистите шприц, заполнив его водой DEPC 8-10 раз.
  2. Установите шприц объемом 10 мкл на микроинжекционный насос, запустите насос и заполните шприц 10 мкл раствора дцРНК (подготовленного на этапе 4.6). Введите 1 мкл дцРНК в3-ю звездную нимфу (см. шаг 2) и убедитесь, что она не просачивается в организм.

6. Инъекция дцРНК в P. americana

  1. Обезболивайте тараканов повышенной концентрацией CO2 в контейнере до тех пор, пока тараканы больше не двигаются, а затем немедленно приступайте к инъекции.
  2. Осторожно подберите таракана пинцетом, и доставьте таракана к игле рукой. Затем введите иглу через зазор между двумя брюшными сомитами горизонтально против эпидермиса. Что касается глубины вставки, чем мельче, тем лучше.
  3. Затем вводят раствор дцРНК в таракана. Наконец, вытащите кончик иглы. Убедитесь, что кончик иглы находится как можно ближе к эпидермису, чтобы избежать повреждения внутренних органов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция должна быть сделана под рассеченным микроскопом.
  4. Поместите введенных тараканов в чистые контейнеры для биоанализа. Подождите около 10-20 минут, чтобы они оправились от эффектов CO2 . Маркировка контейнеров с указанием даты инъекции, типа и дозы дцРНК, а также возраста P. americana.
  5. Поместите введенных тараканов в темную среду при температуре 28 °C, влажности 70%, обеспечьте воду, корм и укрытие, а также регулярно наблюдайте за возможными изменениями фенотипа тараканов.

7. Подтверждение нокдауна и фенотипический анализ

  1. Оцените эффективность РНКи, используя любые доступные методы молекулярной биологии, такие как количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и вестерн-блоттинг. Подробные сведения о процедурах qRT-PCR и вестерн-блоттинга см. в ссылках 1,12.
  2. Для наблюдения и анализа фенотипов, связанных с РНКи, используйте микроскоп, подходящий для живых животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНКи могут влиять на морфологию, поведение, линьку, регенерацию конечностей и другую физиологическую активность тараканов. Удельная частота фенотипа рассчитывается в соответствии с конкретными условиями.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1 показана успешная инъекция. Микроинъекционный шприц с иглой микродиаметра должен быть горизонтально размещен на бустере (рисунок 1А). Игла вводится через зазор между двумя брюшными сомитами горизонтально против эпидермиса (?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В настоящем докладе описана методологическая пошаговая стратегия РНКи в P. americana; Следует отметить, что его также можно применять к другим тараканам (Blattella germanica, например) и многим другим насекомым с незначительными изменениями. Тем не менее, эффективность глушения генов РНКи н...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 32070500, 31620103917, 31330072 и 31572325 C.R., Sh.L.), Фондом естественных наук провинции Гуандун (грант No 2021B1515020044 и 2020A1515011267 к C.R.), Департаментом науки и техники провинции Гуандун (грант NoNo 2019B090905003 и 2019A0102006), Департаментом науки и техники в Гуанчжоу (грант No 202102020110), Шэньчжэньской научно-технической программой (Грант No. KQTD20180411143628272 к Ш.Л.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
701 N 10 µL Syr (26s/51/2)HamiltonPN:80300Injection
IncubatorNingbo Jiangnan Instrument FactoryRXZ-380A-LEDFor cockroaches hatching and feeding
Micro-injection pumpAlcott BiotechnologyALC-IP600Injection
pTOPO-Blunt Cloning KitAidlab BiotechnologyCV16For Gene clonging
quantitative Real-Time PCR SystemsBio-RadCFX ConnectFor qRT-PCR analysis
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase
Thermal CyclersBio-RadS1000For DNA amplification

Ссылки

  1. Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
  4. Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
  5. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
  6. French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).
  7. Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).
  8. Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
  9. Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).
  10. Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
  11. Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163(2011).
  12. Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
  13. Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
  14. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  15. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
  16. Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
  17. Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
  18. Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
  19. Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778(2020).
  20. Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
  21. Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены