Applicazioni dell'interferenza dell'RNA nello scarafaggio americano

Riepilogo

Il presente protocollo descrive le linee guida passo-passo per le tecniche operative RNAi in P. americana.

Abstract

Gli scarafaggi, un parassita sanitario, sono specie essenziali negli studi sullo sviluppo degli insetti e metamorfici grazie alla loro facile alimentazione e alle caratteristiche emimetaboliche. Complessivamente con sequenze di genoma ben annotate, questi vantaggi hanno reso lo scarafaggio americano, Periplaneta americana, un importante modello di insetto emimetabolico. Limitato dalla carenza di strategia di knockout, l'efficace knockdown genico basato sull'interferenza dell'RNA (RNAi) diventa una tecnica indispensabile nella ricerca genica funzionale di P. americana. Il presente protocollo descrive le tecniche di funzionamento RNAi in P. americana. Il protocollo include (1) la selezione della P. americana nelle fasi di sviluppo appropriate, (2) la preparazione per l'impostazione dell'iniezione, (3) l'iniezione di dsRNA e (4) il rilevamento dell'efficienza del knockdown genico. RNAi è un potente strumento genetico inverso in P. americana. La maggior parte dei tessuti di P. americana sono sensibili al dsRNA extracellulare. La sua semplicità consente ai ricercatori di ottenere rapidamente fenotipi disfunzionali sotto una o più iniezioni di dsRNA, consentendo ai ricercatori di utilizzare meglio il P. americana per studi di sviluppo e metamorfici.

Introduzione

L'interferenza dell'RNA (RNAi), un meccanismo conservato evolutivamente, diventa gradualmente uno strumento genetico inverso essenziale per inibire l'espressione genica in molti organismi¹, da quando Andrew Fire e Craig Mello² hanno sviluppato la strategia di silenzio genico mediato dall'RNA a doppio filamento (dsRNA). Il dsRNA viene scisso in frammenti di 21-23 nucleotidi, piccoli RNA interferenti (siRNA), dall'enzima Dicer nelle cellule per attivare la via dell'RNAi. Quindi i siRNA vengono incorporati nel complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC), che si accoppia all'mRNA bersaglio, provoca la scissione dell'mRNA e infine provoca la perdita della funzione genica ^3,4,5. Tra le specie di insetti, molti esperimenti sistemici RNAi sono stati finora segnalati in molti ordini di insetti, come Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Ditteri, Hymenoptera, Lepidoptera e Blattodea 5,6,7,8.

Gli scarafaggi (Blattaria) sono una famiglia di insetti essenziale negli studi sullo sviluppo e metamorfici con i loro rapidi cicli di crescita, la forte adattabilità all'ambiente e l'elevata plasticità dello sviluppo⁹. Prima di scoprire che l'RNAi era compatibile con gli scarafaggi, la ricerca precedente si è concentrata solo sulla prevenzione e il controllo degli scarafaggi a causa della scarsità di tecniche di manipolazione genetica negli scarafaggi. La struttura unica dell'ooteca scarafaggio ha reso difficile eseguire il knockout genetico basato sull'iniezione di embrioni con il sistema CRISPR-Cas9. Inoltre, la maggior parte dei tessuti negli scarafaggi (come P. americana) mostra una robusta risposta sistemica all'RNAi, consentendo la rapida generazione di fenotipi disfunzionali iniettando uno o più dsRNA^{mirati 9,10,11}. Queste caratteristiche hanno reso l'RNAi una tecnica indispensabile nella ricerca funzionale genica in P. americana.

Anche se è stato riportato l'uso di RNAi nella ricerca sui geni funzionali in P. americana , non era disponibile alcuna descrizione dettagliata o dettagliata. Questo rapporto fornisce una linea guida operativa passo-passo per RNAi in P. americana, utile per lo studio della funzione genica in altri scarafaggi. Inoltre, questa guida non si limita a Blattodea e può essere applicata a molti altri insetti con piccole modifiche.

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Protocollo

La linea di P. americana è stata inizialmente fornita dal Dr. Huiling Hao. Questa specie è stata mantenuta consanguineità per 30 anni⁹.

1. Schiusa e alimentazione di P. americana

1. Raccogliere oothecae fresche (immediatamente dopo la deposizione delle uova) di P. americana e incubare nell'incubatrice scura a 25 ° C e 60% di umidità per ~ 25 giorni. Quindi aumentare la temperatura e l'umidità a 30 ° C e 75% 3 giorni prima della schiusa.
2. Utilizzare un setaccio con apertura di 4 mm per separare le ninfe tratteggiate dalle oothecae.
3. Tenere le ninfe in contenitori cilindrici (12 cm di diametro e 10 cm di altezza) al buio a 28 °C, 70% di umidità. Spazzolare il bordo interno dei contenitori con vaselina per evitare che gli scarafaggi fuoriescano. Fornire cibo per topi, acqua e riparo (vassoi per uova). Presta attenzione all'attività delle ninfe e pulisci regolarmente le feci e i detriti.

2. Selezione delle ninfe in instar corretta

1. Usa un tubo di vetro per scegliere il P. americana appena fuso (bianco nel colore del corpo). Conservali in nuovi contenitori e attendi la fase corretta per il trattamento.
   NOTA: Dopo ~ 19 giorni nelle condizioni di alimentazione di cui sopra, le ninfe nel 3^° instars saranno disponibili per l'iniezione. Il colore degli scarafaggi appena fusi è bianco e le stelle sono chiarite dai tempi di muta.

3. Preparazione del frammento target con promotori T7

1. Utilizzando il cDNA di P. americana come modello, progettare primer accoppiati per eseguire la PCR per ottenere un frammento di DNA da 300-800 bp del gene bersaglio⁹. Quindi clonare il frammento PCR in un vettore pTOPO (vedere Tabella dei materiali) per il sequenziamento.
2. Utilizzando il DNA del frammento bersaglio come modello, sintetizzare una nuova coppia di primer con sequenza di promotori T7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') ai terminali 5' ed eseguire un altro ciclo di PCR per ottenere il frammento bersaglio con promotori T7 su ciascun lato⁹.

4. Trascrizione e sintesi di dsRNA in vitro

1. Aggiungere 10 μL di tampone T7 2X, 2 μL della miscela enzimatica, T7 Express (vedere tabella dei materiali) e 2 μg di prodotto PCR (ottenuto al punto 3.2) nel sistema di reazione e aggiungere il volume totale a 20 μL con ddH₂O. Mescolare delicatamente manualmente e incubare a 37 °C per 30 minuti e 70 °C per 10 minuti, e poi raffreddare lentamente a temperatura ambiente.
2. Soluzione diluita di RNasi A (4 μg/μL) con ddH₂O in rapporto 1:200. Quindi aggiungere al sistema 1 μL di DNasi RQ1 RNasi-Free (1 U/μL) e 1 μL di soluzione di RNasi A diluita (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Ora, il volume di un singolo sistema è di 22 μL.
3. Incubare a 37 °C per 30 min. Quindi aggiungere il 10% del volume totale (quando si eseguono reazioni N contemporaneamente, il volume totale è N x 22 μL) di acetato di sodio e tre volumi del volume totale di isopropanolo.
4. Mescolare delicatamente a testa in giù manualmente, mettere su ghiaccio per 5 minuti e centrifugare a 13.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
5. Rimuovere il surnatante con una pipetta, lavare il residuo con etanolo al 75% (con acqua trattata con pirocarbonato di dietile (DEPC) al 25%) e quindi centrifugare a 13.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
6. Rimuovere di nuovo il surnatante. Asciugare all'aria il pellet per 15 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare ~ 100 μL di acqua DEPC per sciogliere il dsRNA, quindi diluire il dsRNA fino ai 2 μg / μL finali.
   NOTA: Il dsRNA potrebbe essere conservato a -80 °C per 6 mesi.

5. Caricamento della soluzione di dsRNA nella siringa

1. Impostare il programma nella pompa di microiniezione (vedere Tabella dei materiali) in anticipo per garantire che il volume di ciascuna iniezione sia coerente. Prima di utilizzare la siringa, pulire la siringa riempiendola con acqua DEPC 8-10 volte.
2. Installare la siringa da 10 μL sulla pompa di microiniezione, avviare la pompa e riempire la siringa con 10 μL di soluzione di dsRNA (preparata al punto 4.6). Iniettare 1 μL del dsRNA in una ninfa^3a instar (vedere il passo 2) e assicurarsi che non fuoriesca nel corpo.

6. Iniezione di dsRNA a P. americana

1. Anestetizzare gli scarafaggi con una maggiore concentrazione di CO₂ in un contenitore fino a quando gli scarafaggi non si muovono più, quindi procedere immediatamente con l'iniezione.
2. Raccogli delicatamente lo scarafaggio con una pinzetta e consegna lo scarafaggio verso l'ago con la mano. Quindi, inserire l'ago attraverso lo spazio tra due somiti addominali orizzontalmente contro l'epidermide. A proposito di inserire la profondità, più basso, meglio è.
3. Quindi, iniettare la soluzione di dsRNA nello scarafaggio. Infine, estrarre la punta dell'ago. Assicurarsi che la punta dell'ago sia il più vicino possibile all'epidermide per evitare di danneggiare gli organi interni.
   NOTA: L'iniezione deve essere effettuata al microscopio di dissezione.
4. Metti gli scarafaggi iniettati in contenitori puliti per il biodosaggio. Attendere circa 10-20 minuti per farli recuperare dagli effetti della CO₂ . Etichettare i contenitori con la data di iniezione, il tipo e la dose di dsRNA e l'età del P. americana.
5. Posizionare gli scarafaggi iniettati in un ambiente buio a 28 ° C, 70% di umidità, fornire acqua, mangime e riparo e osservare regolarmente possibili cambiamenti nel fenotipo degli scarafaggi.

7. Conferma knockdown e analisi fenotipica

1. Valutare l'efficienza dell'RNAi utilizzando tutte le tecniche di biologia molecolare disponibili come la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e il Western blotting. Per le procedure dettagliate di qRT-PCR e Western blotting, vedere i riferimenti ^1,12.
2. Per osservare e analizzare fenotipi correlati all'RNAi, utilizzare il microscopio adatto per animali viventi.
   NOTA: RNAi può influenzare la morfologia, il comportamento, la muta, la rigenerazione degli arti e altre attività fisiologiche degli scarafaggi. La frequenza specifica del fenotipo viene calcolata in base a condizioni specifiche.

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Risultati

La Figura 1 mostra un'iniezione riuscita. La siringa per microiniezione con un ago di microdiametro deve essere posizionata orizzontalmente sul booster (Figura 1A). L'ago viene inserito attraverso lo spazio tra due somiti addominali orizzontalmente contro l'epidermide (Figura 1B). Assicurarsi che il liquido entri nell'addome di P. americana . L'angolo troppo ripido dell'ago danneggerà gli organi interni (

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Discussione

Questo rapporto descriveva una strategia metodologica passo-passo RNAi in P. americana; da notare, può anche essere applicato ad altri scarafaggi (Blattella germanica, per esempio) e molti altri insetti con piccoli cambiamenti. Tuttavia, l'efficienza di silenziamento genico dell'RNAi non è sempre abbastanza elevata, con un evidente svantaggio rispetto alla strategia di knockout genico¹³. Il seguente effetto residuo del livello genico può interferire con i fenotipi reali. Per g...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
701 N 10 µL Syr (26s/51/2)	Hamilton	PN:80300	Injection
Incubator	Ningbo Jiangnan Instrument Factory	RXZ-380A-LED	For cockroaches hatching and feeding
Micro-injection pump	Alcott Biotechnology	ALC-IP600	Injection
pTOPO-Blunt Cloning Kit	Aidlab Biotechnology	CV16	For Gene clonging
quantitative Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	CFX Connect	For qRT-PCR analysis
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase
Thermal Cyclers	Bio-Rad	S1000	For DNA amplification