Aplicações de interferência de RNA na barata americana

Resumo

O presente protocolo descreve as diretrizes passo a passo para as técnicas de operação rnai em P. americana.

Resumo

Baratas, uma praga sanitária, são espécies essenciais em estudos de desenvolvimento de insetos e metamórficos devido à sua fácil alimentação e características hemimetabólicas. Ao todo com sequências de genomas bem anotadas, essas vantagens fizeram da barata americana Periplaneta americana, um importante modelo de insetos hemimetados. Limitado pela escassez de estratégia de nocaute, o knockdown genético baseado em RNA eficaz (RNAi) torna-se uma técnica indispensável na pesquisa genética funcional da P. americana. O presente protocolo descreve as técnicas de operação RNAi em P. americana. O protocolo inclui (1) seleção do P. americana em estágios de desenvolvimento adequados, (2) preparação para a configuração da injeção, (3) injeção de dsRNA e (4) detecção de eficiência de knockdown genético. RNAi é uma poderosa ferramenta genética reversa em P. americana. A maioria dos tecidos P. americanas são sensíveis ao dsRNA extracelular. Sua simplicidade permite que os pesquisadores obtenham rapidamente fenótipos disfuncionais sob uma ou múltiplas injeções de dsRNA, permitindo que os pesquisadores usem melhor o P. americana para estudos de desenvolvimento e metamórficos.

Introdução

A interferência de RNA (RNAi), um mecanismo evolutivamente conservado, gradualmente se torna uma ferramenta essencial de reversão genética para inibir a expressão genética em muitos organismos¹, uma vez que Andrew Fire e Craig Mello² desenvolveram a estratégia de silêncio genético mediado por duplar (dsRNA). dsRNA é cortado em fragmentos de 21-23 nucleotídeos, pequenas RNAs interferentes (siRNAs), pela enzima Dicer em células para ativar a via RNAi. Em seguida, siRNAs são incorporadas ao complexo de silenciamento induzido pelo RNA (RISC), que casa o mRNA alvo, causa decote mRNA e, finalmente, resulta na perda da função genética ^3,4,5. Entre as espécies de insetos, muitos experimentos sistêmicos rnai foram relatados até agora em muitas ordens de insetos, como Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera e Blattodea 5,6,7,8.

As baratas (Blattaria) são uma família essencial de insetos em estudos de desenvolvimento e metamórficos com seus ciclos de crescimento rápido, forte adaptabilidade ao meio ambiente e alta plasticidade^{de desenvolvimento 9}. Antes de descobrir que a RNAi era compatível com baratas, pesquisas anteriores focavam apenas na prevenção e controle de baratas devido à escassez de técnicas de manipulação genética em baratas. A estrutura única da ootheca da barata tornou desafiador realizar o nocaute genético baseado em injeção de embriões com o sistema CRISPR-Cas9. Além disso, a maioria dos tecidos em baratas (como P. americana) apresenta robusta resposta sistêmica RNAi, permitindo a rápida geração de fenótipos disfuncionais injetando um ou mais dsRNAs ^9,10,11. Essas características fizeram da RNAi uma técnica indispensável em pesquisa funcional genética em P. americana.

Embora tenha sido relatado o uso de RNAi em pesquisa genética funcional em P. americana , não foi relatada nenhuma descrição detalhada ou passo a passo. Este relatório fornece uma diretriz operacional passo a passo para rnai em P. americana, útil para o estudo da função genética em outras baratas. Além disso, este guia não se limita a Blattodea e pode ser aplicado a muitos outros insetos com pequenas modificações.

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Protocolo

A linha de P. americana foi inicialmente fornecida pelo Dr. Huiling Hao. Esta espécie tem sido mantida com endogamia por 30 anos⁹.

1. Incubação e alimentação de P. americana

1. Colete oothecae fresco (imediatamente pós-colocação de ovos) de P. americana e incubar na incubadora escura a 25 °C e 60% de umidade por ~25 dias. Em seguida, aumente a temperatura e a umidade para 30 °C e 75% 3 dias antes do eclosão.
2. Use uma peneira com abertura de 4 mm para separar as ninfas eclodidas da oothecae.
3. Mantenha as ninfas em recipientes cilíndricos (12 cm de diâmetro e 10 cm de altura) no escuro a 28 °C, 70% de umidade. Escove a borda interna dos recipientes com vaselina para evitar que as baratas escapem. Fornecer comida de rato, água e abrigo (bandejas de ovos). Preste atenção à atividade das ninfas e limpe regularmente as fezes e detritos.

2. Seleção das ninfas em instar adequada

1. Use um tubo de vidro para escolher o P. americana recém-moldado (branco na cor do corpo). Mantenha-os em novos recipientes e aguarde o estágio correto para o tratamento.
   NOTA: Após ~19 dias sob as condições de alimentação acima, as ninfas^{nas instars} 3 estarão disponíveis para injeção. A cor das baratas recém-moldadas é branca, e as estrelas são esclarecidas por tempos de fusão.

3. Preparação do fragmento de alvo com promotores T7

1. Usando o cDNA de P. americana como modelo, projetamos primers emparelhados para executar PCR para obter fragmento de DNA de 300-800 bp do gene^{alvo 9}. Em seguida, clone o fragmento PCR em um vetor pTOPO (ver Tabela de Materiais) para sequenciamento.
2. Usando o DNA do fragmento de destino como modelo, sintetize um novo par de primers com sequência de promotores T7 (5'-GGATCCTACGACTCACTATAGG-3') nos terminais de 5' e realize outra rodada de PCR para obter o fragmento de destino com promotores T7 em cada lado⁹.

4. Transcrição e síntese de dsRNA in vitro

1. Adicione 10 μL de tampão T7 2X, 2 μL do Enzima Mix, T7 Express (ver Tabela de Materiais) e 2 μg de produto PCR (obtido na etapa 3.2) no sistema de reação e somar o volume total a 20 μL com ddH₂O. Misture suavemente de cabeça para baixo manualmente e incubar a 37 °C por 30 min e 70 °C por 10 min, e, em seguida, esfriar lentamente até a temperatura ambiente.
2. Diluir solução RNase A (4 μg/μL) com ddH₂O a uma razão de 1:200. Em seguida, adicione 1 μL de DNase RNase-Free RNase (1 U/μL) e 1 μL de solução RNase A diluída ao sistema (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Agora, o volume de um único sistema é de 22 μL.
3. Incubar a 37 °C por 30 min. Em seguida, adicione 10% do volume total (ao realizar reações N simultaneamente, o volume total é N x 22 μL) de acetato de sódio e três volumes do volume total de isopropanol.
4. Misture suavemente de cabeça para baixo manualmente, coloque no gelo por 5 minutos e centrífuga a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.
5. Retire o supernatante com uma pipeta, lave o resíduo com 75% de etanol (com 25% de pirocarbonato de ditila (DEPC) água tratada e, em seguida, centrífuga a 13.000 x g por 5 min a 4 °C.
6. Remova o supernatante novamente. Seque a pelota por 15 minutos em temperatura ambiente. Use ~100 μL de água DEPC para dissolver dsRNA e, em seguida, dilua o dsRNA para os 2 μg/μL finais.
   NOTA: O dsRNA pode ser armazenado a -80 °C por 6 meses.

5. Carregar a solução dsRNA na seringa

1. Configure o programa na bomba de micro injeção (ver Tabela de Materiais) com antecedência para garantir que o volume de cada injeção seja consistente. Antes de usar a seringa, limpe a seringa preenchendo-a com água DEPC 8-10 vezes.
2. Instale a seringa de 10 μL na bomba de micro injeção, inicie a bomba e encha a seringa com 10 μL de solução dsRNA (preparada na etapa 4.6). Injete 1 μL do dsRNA em uma ninfa instar 3^rd (ver passo 2) e certifique-se de que ele não vaze para o corpo.

6. Injetando dsRNA para P. americana

1. Anestesiar as baratas com uma concentração aumentada de CO₂ em um recipiente até que as baratas não se movam mais, e então proceda imediatamente com a injeção.
2. Pegue delicadamente a barata com pinças, e entregue a barata em direção à agulha com a mão. Em seguida, insira a agulha através da lacuna entre dois somitas abdominais horizontalmente contra a epiderme. Sobre a profundidade de inserção, quanto mais rasa, melhor.
3. Então, injete a solução dsRNA na barata. Finalmente, puxe a ponta da agulha. Certifique-se de que a ponta da agulha está o mais próxima possível da epiderme para evitar danificar órgãos internos.
   NOTA: A injeção deve ser feita sob um microscópio de dissecção.
4. Coloque as baratas injetadas em recipientes limpos de bioensaio. Espere cerca de 10-20 minutos para deixá-los se recuperar dos efeitos de CO₂ . Rotule os recipientes com a data de injeção, tipo e dose de dsRNA e idade do P. americana.
5. Coloque as baratas injetadas em um ambiente escuro a 28 °C, 70% de umidade, forneça água, ração e abrigo, e observe possíveis alterações no fenótipo das baratas regularmente.

7. Confirmação de knockdown e análise fenotípica

1. Avalie a eficiência da RNAi utilizando quaisquer técnicas de biologia molecular disponíveis, como PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e mancha ocidental. Para procedimentos detalhados de qRT-PCR e de manchas ocidentais, consulte Referências ^1,12.
2. Para observar e analisar fenótipos relacionados à RNAi, utilize o microscópio adequado para animais vivos.
   NOTA: O RNAi pode afetar a morfologia, o comportamento, a fusão, a regeneração dos membros e outras atividades fisiológicas das baratas. A frequência específica do fenótipo é calculada de acordo com condições específicas.

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Resultados

A figura 1 mostra uma injeção bem sucedida. A seringa de microinjeção com uma agulha de micro diâmetro deve ser colocada horizontalmente no propulsor (Figura 1A). A agulha é inserida através da lacuna entre duas somitas abdominais horizontalmente contra a epiderme (Figura 1B). Certifique-se de que o líquido vai para o abdômen P. americana . O ângulo muito íngreme da agulha danificará os órgãos interno...

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Discussão

Este relatório descreveu uma estratégia metodológica passo a passo da RNAi em P. americana; note-se que também pode ser aplicado a outras baratas (Blattella germanica, por exemplo) e muitos outros insetos com pequenas alterações. No entanto, a eficiência de silenciamento genético da RNAi nem sempre é alta o suficiente, com uma desvantagem óbvia em comparação com a estratégia de nocaute genético¹³. O seguinte efeito residual do nível genético pode interferir com os...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
701 N 10 µL Syr (26s/51/2)	Hamilton	PN:80300	Injection
Incubator	Ningbo Jiangnan Instrument Factory	RXZ-380A-LED	For cockroaches hatching and feeding
Micro-injection pump	Alcott Biotechnology	ALC-IP600	Injection
pTOPO-Blunt Cloning Kit	Aidlab Biotechnology	CV16	For Gene clonging
quantitative Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	CFX Connect	For qRT-PCR analysis
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase
Thermal Cyclers	Bio-Rad	S1000	For DNA amplification