Anwendungen der RNA-Interferenz in amerikanischen Kakerlaken

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Schritt-für-Schritt-Richtlinien für die RNAi-Operationstechniken in P. americana.

Zusammenfassung

Kakerlaken, ein Hygieneschädling, sind aufgrund ihrer einfachen Fütterung und ihrer hemimetabolen Eigenschaften essentielle Arten in Insektenentwicklungs- und metamorphen Studien. Insgesamt haben diese Vorteile mit gut annotierten Genomsequenzen die amerikanische Kakerlake Periplaneta americana zu einem wichtigen hemimetabolen Insektenmodell gemacht. Begrenzt durch den Mangel an Knockout-Strategie wird effektiver RNA-Interferenz (RNAi)-basierter Gen-Knockdown zu einer unverzichtbaren Technik in der funktionellen Genforschung von P. americana. Das vorliegende Protokoll beschreibt die RNAi-Operationstechniken in P. americana. Das Protokoll umfasst (1) die Auswahl des P. americana in den richtigen Entwicklungsstadien, (2) die Vorbereitung auf die Injektionseinstellung, (3) die dsRNA-Injektion und (4) die Erkennung der Gen-Knockdown-Effizienz. RNAi ist ein mächtiges umgekehrtes genetisches Werkzeug in P. americana. Die Mehrheit der P. americana-Gewebe ist empfindlich gegenüber extrazellulärer dsRNA. Seine Einfachheit ermöglicht es Forschern, schnell dysfunktionale Phänotypen unter einer oder mehreren gezielten dsRNA-Injektionen zu erhalten, so dass Forscher das P. americana besser für Entwicklungs- und metamorphe Studien verwenden können.

Einleitung

RNA-Interferenz (RNAi), ein evolutionär konservierter Mechanismus, wird allmählich zu einem essentiellen reverse-genetischen Werkzeug, um die Genexpression in vielen Organismen zu hemmen¹, seit Andrew Fire und Craig Mello² die doppelsträngige RNA (dsRNA) vermittelte Genstillestrategie entwickelt haben. dsRNA wird durch das Enzym Dicer in Zellen in Fragmente von 21-23 Nukleotiden, kleinen interferierenden RNAs (siRNAs), gespalten, um den RNAi-Signalweg zu aktivieren. Dann werden siRNAs in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, der an die Ziel-mRNA koppelt, eine mRNA-Spaltung verursacht und schließlich zum Verlust der Genfunktion ^3,4,5 führt. Unter den Insektenarten wurden bisher viele systemische RNAi-Experimente in vielen Insektenordnungen berichtet, wie Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, ^{Coleoptera, Neuroptera, Diptera}, Hymenoptera, Lepidoptera und Blattodea 5,6,7,8.

Kakerlaken (Blattaria) sind eine essentielle Insektenfamilie in Entwicklungs- und metamorphen Studien mit ihren schnellen Wachstumszyklen, ihrer starken Anpassungsfähigkeit an die Umwelt und ihrer hohen Entwicklungsplastizität⁹. Bevor entdeckt wurde, dass RNAi mit Kakerlaken kompatibel war, konzentrierte sich die bisherige Forschung nur auf die Prävention und Kontrolle von Kakerlaken aufgrund einer Knappheit genetischer Manipulationstechniken bei Kakerlaken. Die einzigartige Struktur der Kakerlaken-Oothek machte es schwierig, einen auf Embryoneninjektionen basierenden Gen-Knockout mit dem CRISPR-Cas9-System durchzuführen. Außerdem zeigen die meisten Gewebe in Kakerlaken (wie P. americana) eine robuste systemische RNAi-Reaktion, die die schnelle Erzeugung dysfunktionaler Phänotypen durch Injektion einer oder mehrerer Ziel-dsRNAs 9,10,11 ermöglicht. Diese Eigenschaften machten RNAi zu einer unverzichtbaren Technik in der Genfunktionsforschung bei P. americana.

Obwohl über die Verwendung von RNAi in der funktionellen Genforschung in P. americana berichtet wurde, war keine detaillierte oder Schritt-für-Schritt-Beschreibung verfügbar. Dieser Bericht enthält eine Schritt-für-Schritt-Betriebsleitlinie für RNAi in P. americana, die für die Genfunktionsstudie bei anderen Kakerlaken nützlich ist. Darüber hinaus ist dieser Leitfaden nicht auf Blattodea beschränkt und kann mit geringfügigen Modifikationen auf viele andere Insekten angewendet werden.

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Protokoll

Die Linie von P. americana wurde ursprünglich von Dr . Huiling Hao zur Verfügung gestellt. Diese Art wird seit 30 Jahren mit Inzucht^{gepflegt 9}.

1. Schlüpfen und Fütterung von P. americana

1. Sammeln Sie frische Otheken (unmittelbar nach der Eiablage) von P. americana und inkubieren Sie im dunklen Inkubator bei 25 ° C und 60% Luftfeuchtigkeit für ~ 25 Tage. Dann erhöhen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit auf 30 ° C und 75% 3 Tage vor dem Schlüpfen.
2. Verwenden Sie ein Sieb mit 4 mm Öffnung, um die geschlüpften Nymphen von den Ootheken zu trennen.
3. Bewahren Sie die Nymphen in zylindrischen Behältern (12 cm Durchmesser und 10 cm Höhe) im Dunkeln bei 28 °C, 70% Luftfeuchtigkeit auf. Bürsten Sie den Innenrand der Behälter mit Vaseline, um zu verhindern, dass Kakerlaken entkommen. Stellen Sie Rattenfutter, Wasser und Schutz (Eierschalen) zur Verfügung. Achten Sie auf die Aktivität der Nymphen und reinigen Sie regelmäßig den Kot und die Trümmer.

2. Auswahl der Nymphen im richtigen Stadium

1. Verwenden Sie eine Glasröhre, um die frisch gehäutete P. americana (weiße Körperfarbe) herauszupicken. Bewahren Sie sie in neuen Behältern auf und warten Sie auf die richtige Phase der Behandlung.
   HINWEIS: Nach ~ 19 Tagen unter den oben genannten Fütterungsbedingungen stehen die Nymphen in den^3. Stadien zur Injektion zur Verfügung. Die Farbe von frisch gehäuteten Kakerlaken ist weiß, und die Stadien werden durch Häutungszeiten geklärt.

3. Vorbereitung des Zielfragments mit T7-Promotoren

1. Unter Verwendung der cDNA von P. americana als Vorlage entwerfen Sie gepaarte Primer zur Durchführung einer PCR, um ein DNA-Fragment von 300-800 bp des Zielgens⁹ zu erhalten. Klonen Sie dann das PCR-Fragment zur Sequenzierung in einen pTOPO-Vektor (siehe Materialtabelle).
2. Verwenden Sie die Zielfragment-DNA als Vorlage, synthetisieren Sie ein neues Paar Primer mit T7-Promotorsequenz (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') an den 5'-Terminals und führen Sie eine weitere Runde PCR durch, um das Zielfragment mit T7-Promotoren auf jeder Seite⁹ zu erhalten.

4. Transkription und Synthese von dsRNA in vitro

1. 10 μL T7 2X Puffer, 2 μL der Enzymmischung, T7 Express (siehe Materialtabelle) und 2 μg PCR-Produkt (erhalten in Schritt 3.2) in das Reaktionssystem geben und das Gesamtvolumen auf 20 μL mit ddH₂O addieren. Vorsichtig auf dem Kopf stehend manuell mischen und bei 37 °C für 30 min und 70 °C für 10 min inkubieren, und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen.
2. Verdünnen Sie RNase A-Lösung (4 μg/μL) mit ddH 2 O im Verhältnis 1:200_. Dann fügen Sie dem System 1 μL RQ1 RNase-freie DNase (1 U/μL) und 1 μL verdünnte RNase A-Lösung hinzu (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Jetzt beträgt das Volumen eines einzelnen Systems 22 μL.
3. 30 min bei 37 °C inkubieren Dann fügen Sie 10% des Gesamtvolumens (bei gleichzeitiger Durchführung von N-Reaktionen beträgt das Gesamtvolumen N x 22 μL) Natriumacetat und drei Volumina des Gesamtvolumens von Isopropanol hinzu.
4. Vorsichtig auf dem Kopf stehend manuell mischen, 5 min auf Eis legen und 10 min bei 4 °C bei 13.000 x g zentrifugieren.
5. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, waschen Sie den Rückstand mit 75% Ethanol (mit 25% Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser) und zentrifugieren Sie dann bei 13.000 x g für 5 min bei 4 °C.
6. Entfernen Sie den Überstand wieder. Trocknen Sie das Pellet 15 min bei Raumtemperatur an der Luft. Verwenden Sie ~ 100 μL DEPC-Wasser, um dsRNA aufzulösen, und verdünnen Sie dann die dsRNA auf die letzten 2 μg / μL.
   HINWEIS: Die dsRNA konnte 6 Monate bei -80 °C gelagert werden.

5. Laden der dsRNA-Lösung in die Spritze

1. Richten Sie das Programm in der Mikroinjektionspumpe (siehe Materialtabelle) im Voraus ein, um sicherzustellen, dass das Volumen jeder Injektion konsistent ist. Bevor Sie die Spritze verwenden, reinigen Sie die Spritze, indem Sie sie 8-10 Mal mit DEPC-Wasser füllen.
2. Installieren Sie die 10-μL-Spritze auf der Mikroinjektionspumpe, starten Sie die Pumpe und füllen Sie die Spritze mit 10 μL dsRNA-Lösung (hergestellt in Schritt 4.6). Injizieren Sie 1 μL der dsRNA in eine Nymphe im 3. Stadium (siehe Schritt 2) und stellen Sie sicher, dass sie nicht in den Körper austritt.

6. Injektion von dsRNA in P. americana

1. Betäuben Sie die Kakerlaken mit einer erhöhten Konzentration von CO₂ in einem Behälter, bis sich die Kakerlaken nicht mehr bewegen, und fahren Sie dann sofort mit der Injektion fort.
2. Nehmen Sie die Kakerlake vorsichtig mit einer Pinzette auf und bringen Sie die Kakerlake mit der Hand in Richtung Nadel. Als nächstes führen Sie die Nadel über den Spalt zwischen zwei abdominalen Somiten horizontal gegen die Epidermis ein. Über die Einfügetiefe gilt: Je flacher, desto besser.
3. Dann injizieren Sie die dsRNA-Lösung in die Kakerlake. Zum Schluss die Nadelspitze herausziehen. Stellen Sie sicher, dass sich die Nadelspitze so nah wie möglich an der Epidermis befindet, um eine Schädigung der inneren Organe zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Injektion sollte unter einem Dissektionsmikroskop erfolgen.
4. Geben Sie die injizierten Kakerlaken in saubere Bioassay-Behälter. Warten Sie etwa 10-20 Minuten, damit sie sich von den CO 2-Effekten erholen können. Beschriften Sie die Behälter mit dem Injektionsdatum, der Art und der Dosis der dsRNA sowie dem Alter der P. americana.
5. Legen Sie die injizierten Kakerlaken in eine dunkle Umgebung bei 28 ° C, 70% Luftfeuchtigkeit, liefern Sie Wasser, Futter und Schutz und beobachten Sie mögliche Veränderungen im Phänotyp der Kakerlaken regelmäßig.

7. Knockdown-Bestätigung und phänotypische Analyse

1. Bewerten Sie die Effizienz von RNAi mit allen verfügbaren molekularbiologischen Techniken wie quantitativer Real-Time PCR (qRT-PCR) und Western Blotting. Für detaillierte qRT-PCR- und Western-Blotting-Verfahren siehe Referenzen ^1,12.
2. Um RNAi-bezogene Phänotypen zu beobachten und zu analysieren, verwenden Sie das für lebende Tiere geeignete Mikroskop.
   HINWEIS: RNAi kann die Morphologie, das Verhalten, die Häutung, die Regeneration der Gliedmaßen und andere physiologische Aktivitäten von Kakerlaken beeinflussen. Die spezifische Häufigkeit des Phänotyps wird nach bestimmten Bedingungen berechnet.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine erfolgreiche Injektion. Die Mikroinjektionsspritze mit einer Mikrodurchmessernadel sollte horizontal auf den Booster gelegt werden (Abbildung 1A). Die Nadel wird über den Spalt zwischen zwei abdominalen Somiten horizontal gegen die Epidermis eingeführt (Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit in den Bauch von P. americana gelangt. Der zu steile Winkel der Nadel schädigt di...

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Diskussion

Dieser Bericht beschrieb eine methodische Schritt-für-Schritt-RNAi-Strategie in P. americana; Bemerkenswert ist, dass es auch auf andere Kakerlaken (Blattella germanica, zum Beispiel) und viele andere Insekten mit geringfügigen Veränderungen angewendet werden kann. Die Gen-Silencing-Effizienz von RNAi ist jedoch nicht immer hoch genug, mit einem offensichtlichen Nachteil gegenüber der Gen-Knockout-Strategie¹³. Der folgende Resteffekt der Genebene kann die realen Phänotypen s...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
701 N 10 µL Syr (26s/51/2)	Hamilton	PN:80300	Injection
Incubator	Ningbo Jiangnan Instrument Factory	RXZ-380A-LED	For cockroaches hatching and feeding
Micro-injection pump	Alcott Biotechnology	ALC-IP600	Injection
pTOPO-Blunt Cloning Kit	Aidlab Biotechnology	CV16	For Gene clonging
quantitative Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	CFX Connect	For qRT-PCR analysis
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase
Thermal Cyclers	Bio-Rad	S1000	For DNA amplification