Applications de l’interférence ARN chez le cafard américain

Résumé

Le présent protocole décrit des lignes directrices étape par étape pour les techniques d’opération de l’ARNi chez P. americana.

Résumé

Les cafards, un ravageur sanitaire, sont des espèces essentielles dans les études de développement et de métamorphie des insectes en raison de leur alimentation facile et de leurs caractéristiques hémimétabrines. Ensemble avec des séquences de génome bien annotées, ces avantages ont fait du cafard américain, Periplaneta americana, un modèle important d’insecte hémimétabole. Limité par l’absence de stratégie de knock-out, l’interférence ARN efficace (ARNi) basée sur l’élimination des gènes devient une technique indispensable dans la recherche sur les gènes fonctionnels de P. americana. Le présent protocole décrit les techniques de fonctionnement de l’ARNi chez P. americana. Le protocole comprend (1) la sélection du P. americana aux stades de développement appropriés, (2) la préparation pour le réglage de l’injection, (3) l’injection d’ARNd et (4) la détection de l’efficacité de l’élimination des gènes. L’ARNi est un puissant outil génétique inverse chez P. americana. La majorité des tissus de P. americana sont sensibles à l’ARNds extracellulaire. Sa simplicité permet aux chercheurs d’obtenir rapidement des phénotypes dysfonctionnels sous une ou plusieurs injections d’ARNd ciblant, ce qui permet aux chercheurs de mieux utiliser le P. americana pour les études développementales et métamorphiques.

Introduction

L’interférence ARN (ARNi), un mécanisme conservé sur le plan de l’évolution, devient progressivement un outil génétique inverse essentiel pour inhiber l’expression des gènes dans de nombreux organismes¹, depuis qu’Andrew Fire et Craig Mello² ont développé la stratégie de silence génétique médié par l’ARN double brin (ARNdS). L’ARNds est clivé en fragments de 21 à 23 nucléotides, de petits ARN interférents (siRNA), par l’enzyme Dicer dans les cellules pour activer la voie de l’ARNi. Ensuite, les siRNA sont incorporés dans le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC), qui se couple à l’ARNm cible, provoque un clivage de l’ARNm et entraîne finalement la perte de la fonction génique ^3,4,5. Parmi les espèces d’insectes, de nombreuses expériences systémiques d’ARNi ont jusqu’à présent été rapportées dans de nombreux ordres d’insectes, tels que les orthoptères, les isoptères, les hémiptères, les coléoptères, les neuroptères, les diptères, les hyménoptères, les lépidoptères et^les blattodea ^5,6,7,8.

Les cafards (Blattaria) sont une famille d’insectes essentielle dans les études développementales et métamorphiques avec leurs cycles de croissance rapides, leur forte adaptabilité à l’environnement et leur grande plasticité développementale⁹. Avant de découvrir que l’ARNi était compatible avec les cafards, les recherches précédentes se concentraient uniquement sur la prévention et le contrôle des cafards en raison de la rareté des techniques de manipulation génétique chez les cafards. La structure unique de l’oothèque de cafard rendait difficile l’exécution d’un knockout génétique basé sur l’injection d’embryons avec le système CRISPR-Cas9. En outre, la plupart des tissus chez les cafards (tels que P. americana) présentent une réponse systémique robuste à l’ARNi, permettant la génération rapide de phénotypes dysfonctionnels en injectant un ou plusieurs ARNd ciblant ^9,10,11. Ces caractéristiques ont fait de l’ARNi une technique indispensable dans la recherche fonctionnelle sur les gènes chez P. americana.

Même si l’utilisation de l’ARNi dans la recherche sur les gènes fonctionnels chez P. americana a été rapportée, aucune description détaillée ou étape par étape n’était disponible. Ce rapport fournit une ligne directrice opérationnelle étape par étape pour l’ARNi chez P. americana, utile pour l’étude de la fonction génique chez d’autres cafards. De plus, ce guide ne se limite pas à Blattodea et peut être appliqué à de nombreux autres insectes avec des modifications mineures.

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Protocole

La ligne de P. americana a été initialement fournie par le Dr Huiling Hao. Cette espèce est maintenue avec la consanguinité depuis 30 ans⁹.

1. Éclosion et alimentation de P. americana

1. Recueillir les oothèques fraîches (immédiatement après la ponte) de P. americana et incuber dans l’incubateur sombre à 25 °C et 60 % d’humidité pendant environ 25 jours. Augmentez ensuite la température et l’humidité à 30 °C et 75% 3 jours avant l’éclosion.
2. Utilisez un tamis avec une ouverture de 4 mm pour séparer les nymphes hachées des oothèques.
3. Gardez les nymphes dans des récipients cylindriques (12 cm de diamètre et 10 cm de hauteur) dans l’obscurité à 28 °C, 70% d’humidité. Brossez le bord intérieur des récipients avec de la vaseline pour empêcher les cafards de s’échapper. Fournissez de la nourriture, de l’eau et un abri aux rats (plateaux à œufs). Faites attention à l’activité des nymphes et nettoyez régulièrement les excréments et les débris.

2. Sélection des nymphes dans l’amidon approprié

1. Utilisez un tube en verre pour choisir le P. americana fraîchement fondu (couleur blanche). Conservez-les dans de nouveaux contenants et attendez le bon stade pour le traitement.
   REMARQUE: Après ~ 19 jours dans les conditions d’alimentation ci-dessus, les nymphes dans les 3^èmes instars seront disponibles pour injection. La couleur des cafards fraîchement mués est blanche et les instars sont clarifiées par les temps de mue.

3. Préparation du fragment cible avec des promoteurs T7

1. En utilisant l’ADNc de P. americana comme modèle, concevoir des amorces appariées pour effectuer la PCR afin d’obtenir un fragment d’ADN de 300 à 800 bp du gène cible⁹. Ensuite, clonez le fragment pcR dans un vecteur pTOPO (voir Tableau des matériaux) pour le séquençage.
2. En utilisant l’ADN du fragment cible comme modèle, synthétisez une nouvelle paire d’amorces avec séquence promotrice T7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') aux bornes 5' et effectuez un autre cycle de PCR pour obtenir le fragment cible avec des promoteurs T7 de chaque côté⁹.

4. Transcription et synthèse de l’ARNds in vitro

1. Ajouter 10 μL de tampon T7 2X, 2 μL du mélange enzymatique, T7 Express (voir tableau des matériaux) et 2 μg de produit PCR (obtenu à l’étape 3.2) dans le système de réaction et additionner le volume total à 20 μL avec ddH₂O. Mélanger doucement à l’envers manuellement et incuber à 37 °C pendant 30 min et 70 °C pendant 10 min, puis refroidir lentement à température ambiante.
2. Diluer la solution de RNase A (4 μg/μL) avec de la ddH₂O dans un rapport de 1:200. Ajouter ensuite 1 μL de DNase sans RNase RQ1 (1 U/μL) et 1 μL de solution diluée de RNase A au système (voir tableau des matériaux).
   REMARQUE: Maintenant, le volume d’un seul système est de 22 μL.
3. Incuber à 37 °C pendant 30 min. Ajoutez ensuite 10% du volume total (lors de l’exécution simultanée de réactions N, le volume total est N x 22 μL) d’acétate de sodium et trois volumes du volume total d’isopropanol.
4. Mélanger doucement à l’envers manuellement, placer sur de la glace pendant 5 min et centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
5. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette, laver le résidu avec de l’éthanol à 75 % (avec de l’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) à 25 %), puis centrifuger à 13 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
6. Retirez à nouveau le surnageant. Sécher la pastille à l’air libre pendant 15 min à température ambiante. Utilisez environ 100 μL d’eau DEPC pour dissoudre l’ARNds, puis diluez l’ARNds jusqu’à la finale 2 μg/μL.
   REMARQUE: L’ARNds peut être conservé à -80 °C pendant 6 mois.

5. Chargement de la solution d’ARNds dans la seringue

1. Configurez le programme dans la pompe de micro-injection (voir Tableau des matériaux) à l’avance pour vous assurer que le volume de chaque injection est constant. Avant d’utiliser la seringue, nettoyez la seringue en la remplissant d’eau DEPC 8 à 10 fois.
2. Installez la seringue de 10 μL sur la pompe de micro-injection, démarrez la pompe et remplissez la seringue avec 10 μL de solution d’ARNd (préparée à l’étape 4.6). Injecter 1 μL de l’ARNds dans une nymphe du^3e stade (voir étape 2) et s’assurer qu’elle ne s’échappe pas dans le corps.

6. Injection d’ARNd à P. americana

1. Anesthésiez les cafards avec une concentration accrue de CO₂ dans un récipient jusqu’à ce que les cafards ne bougent plus, puis procédez immédiatement à l’injection.
2. Ramassez doucement le cafard avec une pince à épiler et livrez le cafard vers l’aiguille avec la main. Ensuite, insérez l’aiguille via l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme. A propos de la profondeur d’insertion, moins c’est, mieux c’est.
3. Ensuite, injectez la solution d’ARNd dans le cafard. Enfin, retirez la pointe de l’aiguille. Assurez-vous que la pointe de l’aiguille est aussi proche que possible de l’épiderme pour éviter d’endommager les organes internes.
   REMARQUE: L’injection doit être faite sous un microscope à dissection.
4. Mettez les cafards injectés dans des récipients d’essai biologique propres. Attendez environ 10-20 min pour les laisser récupérer des effets du CO₂ . Étiqueter les contenants avec la date d’injection, le type et la dose d’ARNds et l’âge du P. americana.
5. Placez les cafards injectés dans un environnement sombre à 28 ° C, 70% d’humidité, fournissez de l’eau, de la nourriture et un abri, et observez régulièrement les changements possibles dans le phénotype des cafards.

7. Confirmation de l’élimination et analyse phénotypique

1. Évaluer l’efficacité de l’ARNi à l’aide de toutes les techniques de biologie moléculaire disponibles telles que la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et le Transfert Western. Pour des procédures détaillées de qRT-PCR et de Transfert Western, voir les références ^1,12.
2. Pour observer et analyser les phénotypes liés à l’ARNi, utilisez le microscope adapté aux animaux vivants.
   REMARQUE: L’ARNi peut affecter la morphologie, le comportement, la mue, la régénération des membres et d’autres activités physiologiques des cafards. La fréquence spécifique du phénotype est calculée en fonction de conditions spécifiques.

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Résultats

La figure 1 montre une injection réussie. La seringue de micro-injection avec une aiguille de micro diamètre doit être placée horizontalement sur le booster (Figure 1A). L’aiguille est insérée par l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme (Figure 1B). Assurez-vous que le liquide pénètre dans l’abdomen de P. americana . L’angle trop raide de l’aiguille endommagera...

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Discussion

Ce rapport décrivait une stratégie méthodologique d’ARNi étape par étape chez P. americana; Il convient de noter qu’il peut également être appliqué à d’autres cafards (Blattella germanica, par exemple) et à de nombreux autres insectes présentant des modifications mineures. Cependant, l’efficacité du silençage génique de l’ARNi n’est pas toujours assez élevée, avec un inconvénient évident par rapport à la stratégie d’élimination^{génique 13}. L’e...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
701 N 10 µL Syr (26s/51/2)	Hamilton	PN:80300	Injection
Incubator	Ningbo Jiangnan Instrument Factory	RXZ-380A-LED	For cockroaches hatching and feeding
Micro-injection pump	Alcott Biotechnology	ALC-IP600	Injection
pTOPO-Blunt Cloning Kit	Aidlab Biotechnology	CV16	For Gene clonging
quantitative Real-Time PCR Systems	Bio-Rad	CFX Connect	For qRT-PCR analysis
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase
Thermal Cyclers	Bio-Rad	S1000	For DNA amplification