Administración intraventricular de fármacos y toma de muestras para el estudio de farmacocinética y farmacodinamia

Resumen

La administración de terapias directamente en el sistema nervioso central es una forma de eludir la barrera hematoencefálica. El presente protocolo demuestra la inyección intracerebroventricular para la posterior recolección de líquido cefalorraquídeo y órganos corporales. Esto facilita la investigación de la farmacocinética y farmacodinámica de fármacos en modelos animales para el desarrollo de nuevos tratamientos.

Resumen

Aunque la barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés) protege al cerebro de entidades extrañas, también evita que algunas terapias crucen al sistema nervioso central (SNC) para mejorar enfermedades o infecciones. Los fármacos se administran directamente en el SNC en animales y seres humanos para eludir la barrera hematoencefálica. El presente protocolo describe una forma única de tratar las infecciones cerebrales a través de la administración intraventricular de antibióticos, es decir, polimixinas, los antibióticos de última línea para tratar las bacterias gramnegativas resistentes a múltiples fármacos. Se desarrolló un protocolo sencillo de cirugía estereotáxica para implantar una cánula guía que llegaba hasta el ventrículo lateral en ratas. Después de un período de recuperación de 24 h, las ratas pueden ser inyectadas consciente y repetidamente a través de una cánula que se coloca en la guía. Las inyecciones se pueden administrar manualmente en forma de bolo o infusión mediante una bomba de microinyección para obtener un caudal lento y controlado. La inyección intraventricular se confirmó con éxito con el colorante Evans Blue. Se puede drenar el líquido cefalorraquídeo (LCR) y se pueden recolectar el cerebro y otros órganos. Este enfoque es muy susceptible para los estudios que involucran la administración de fármacos al SNC y la posterior evaluación de la actividad farmacocinética y farmacodinámica.

Introducción

La barrera hematoencefálica (BBB) es un mecanismo de protección crucial para el sistema nervioso central (SNC). La barrera anatómica selectivamente permeable separa la sangre circulante y sus solutos del líquido extracelular del cerebro, evitando así que la mayoría de las moléculas entren en el cerebro 1,2,3,4, dependiendo de su tamaño, lipofilia 5 y la disponibilidad de un mecanismo de transporte activo 2.

Esta barrera protectora es beneficiosa para la regulación efectiva de la homeostasis cerebral y la salud del SNC ^4,6. Sin embargo, también dificulta la administración de fármacos para tratar infecciones en el cerebro u otras enfermedades del SNC ^4,7. Además de interrumpir la BHE utilizando una variedad de métodos ^8,9, el enfoque principal para eludir la BHE es administrar un fármaco directamente en el cerebro liberándolo en el líquido cefalorraquídeo (LCR)⁴. A pesar de que es una práctica relativamente invasiva, se ha utilizado con éxito para administrar terapias dirigidas a pacientes y animales de laboratorio. En los seres humanos, los fármacos pueden administrarse en el sistema intraventricular o en el LCR y posteriormente se toman muestras utilizando el reservorio Ommaya, un reservorio que reside debajo del cuero cabelludo, unido a un catéter insertado en el ventrículo lateral^10,11. Se han establecido técnicas similares en animales de laboratorio, como los roedores, para lograr objetivos equivalentes. Se implantaron bombas microosmóticas en ratones 12,13,14,15 y ratas^16,17 para la administración continua de fármacos en el sistema ventricular o en el parénquima cerebral. Además, se realizaron inyecciones intracerebroventriculares directas en ratones anestesiados con aguja desechable^18,19 y en ratas conscientes mediante cánula implantada quirúrgicamente^20,21,22,23. La administración de fármacos al SNC ha sido un método invaluable para mejorar la comprensión en varios campos 20,24,25,26,27,28.

Las infecciones del SNC son uno de esos campos que necesita urgentemente nuevas terapias y una mejor comprensión de las terapias antiinfecciosas existentes. Las infecciones por SNC causadas por bacterias gramnegativas multirresistentes son particularmente preocupantes⁷. Las polimixinas son los antibióticos de última línea cada vez más utilizados para tratar las infecciones debidas a estas "superbacterias"²⁹. Cuando las polimixinas se administran por vía intravenosa según las directrices de dosificación actuales³⁰, su penetración en el SNC es muy baja, mientras que las dosis más altas aumentan el riesgo de nefrotoxicidad. Por lo tanto, la terapia intravenosa con polimixina es de poca utilidad para tratar las infecciones del SNC⁷. El establecimiento de un régimen de dosificación seguro y eficaz para la administración de polimixinas al SNC es una necesidad médica urgente no cubierta 31,32,33. Por lo tanto, se estableció y describe el presente protocolo con un enfoque en la inyección de antibióticos directamente en el LCR de ratas. Sin embargo, se puede utilizar para administrar cualquier fármaco que no sea neurotóxico y en el que se puedan administrar concentraciones terapéuticas en pequeños volúmenes (por ejemplo, hasta 10 μL en ratas). Las técnicas descritas también pueden modificarse para dirigirse a diferentes regiones del cerebro y administrar múltiples inyecciones.

El presente protocolo presenta una técnica quirúrgica e inyectable sencilla que permite una farmacocinética y distribución eficientes después de la administración de fármacos en ICV. La cirugía consiste en implantar una cánula guía. Al tratarse de un procedimiento menos invasivo que la implantación de una bomba microosmótica 12,13,14,15,16,17, se trata de una opción avanzada adecuada para la administración a corto plazo de fármacos en LCR. Este protocolo se simplifica y puede producir tasas de supervivencia muy altas y pesos corporales estables 24 h después de la cirugía, lo que supone una mejora en comparación con los métodos existentes³⁴. Después de la cirugía, las ratas conscientes recibieron una inyección manual de ICV en bolo o una administración más lenta utilizando una microbomba para reducir las concentraciones plasmáticas máximas. Al mismo tiempo, podían moverse libremente en su jaula. Para establecer regímenes de dosificación seguros y eficaces, se utilizaron muestras de LCR, cerebro, médula espinal, riñón, plasma, etc., para estudiar la farmacocinética y la distribución del fármaco después de la administración intracerebroventricular (ICV). La distribución de fármacos también puede investigarse visualmente, por ejemplo, utilizando inmunohistoquímica o imágenes de espectrometría de masas/ionización por desorción láser/ionización asistida por matriz (MALDI-MSI). Si es necesario, se puede implantar una cánula bilateral, por ejemplo, para inyectar drogas que, de otro modo, se distribuirían unilateralmente en ambos hemisferios.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo siguiendo el código australiano para el cuidado y uso de animales con fines científicos. Los experimentos fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Melbourne (solicitud #1914890). Para los experimentos se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho y hembra de 8 a 14 semanas de edad.

1. Cirugía estereotáxica para la canulación del ventrículo lateral

1. Use puntas de algodón esterilizadas en autoclave y paños quirúrgicos durante la cirugía.
2. Configure lo siguiente para la cirugía.
   1. Establezca el marco estereotáxico, el sistema de administración de anestesia, los medicamentos, los productos químicos y los materiales de asistencia (consulte la Tabla de materiales). Limpie el marco estereotáxico, la fuente de luz de fibra óptica, el taladro de mano, etc., con etanol al 80%.
   2. Remoje la cánula guía de 22 G y la cánula ficticia asociada (consulte la tabla de materiales) en etanol al 80% para la esterilización.
      NOTA: El fabricante precortó la guía de 22 G y la cánula ficticia a ~4 mm de longitud por debajo del pedestal.
   3. Esterilice los instrumentos quirúrgicos (consulte la Tabla de materiales) con el esterilizador de perlas de calor durante 20 s y luego rocíe con etanol al 80%. Coloque los instrumentos esterilizados sobre el paño estéril.
   4. Prepare una caja de recuperación (una caja de alojamiento para ratas forrada con una almohadilla) con la mitad de la caja colocada sobre una almohadilla térmica.
3. Realizar la cirugía.
   1. Enrosque la cánula guía de 22 G limpia con etanol en el soporte de cánula en el marco estereotáxico.
   2. Colocar la rata en una cámara de inducción (300 mm x 200 mm, ver Tabla de Materiales) e inducir la anestesia con isoflurano al 5% a 1 L/min de oxígeno.
   3. Una vez que la rata esté profundamente anestesiada (sin reflejo pedal), mueva la rata al marco estereotáxico y reduzca el isoflurano al 2%-3% en 1 L/min de oxígeno para su mantenimiento a través del cono nasal. Enganche los dientes en la barra de mordida y tire con cuidado del cono de la nariz sobre la nariz: tire suavemente hacia atrás de la rata para verificar que esté segura.
   4. Aplique lubricante protector para ojos en ambos ojos para evitar que se sequen.
   5. Inyecte carprofeno (5 mg/kg), buprenorfina (0,05 mg/kg) en solución salina y 3 ml de solución salina por vía subcutánea (s.c.) para el tratamiento del dolor y para ayudar a la recuperación postoperatoria.
   6. Pellizca los dedos de los pies para comprobar el reflejo del pedal. Una vez ausente, fija el cráneo de la rata en el marco. Coloque una barra en el canal auditivo y apriételo. Repita en el otro lado.
   7. Mueva las barras de los oídos lateralmente para asegurarse de que los números indicados en las barras de los oídos sean iguales en ambos lados. La cabeza no debe moverse al presionar el cráneo.
   8. Afeita la parte superior de la cabeza con una maquinilla. Limpie el cabello con un pañuelo de papel y solución salina. Si es necesario, vuelva a aplicar el lubricante ocular en ambos ojos para evitar que se sequen.
   9. Frote el cuero cabelludo con clorhexidina al 4% y solución alcohólica de preparación cutánea, utilizando hisopos de algodón estériles para cada paso (ver Tabla de Materiales). Comience en el centro del cráneo y muévase en círculos hacia afuera hasta que se limpie toda la superficie.
   10. Inyecte ~150 μL de Ropivacaína (1%) s.c. (ver Tabla de Materiales) a lo largo del sitio de la incisión prevista.
   11. Use la hoja del bisturí para hacer una incisión de 10-15 mm a lo largo de la línea media de la cabeza, desde entre los ojos hasta la base del cráneo.
   12. Use las puntas de algodón y el bisturí para raspar el tejido conectivo y exponer el cráneo.
   13. Sumerge una punta de algodón estéril en una solución de peróxido de hidrógeno al 3% y aplícala en la superficie del cráneo. Espere 5 segundos para que el producto químico reaccione con la piel y luego limpie el área con una punta de algodón seca.
   14. Aplique peróxido de hidrógeno al 3% por segunda vez. Esto hará que las líneas de sutura del cráneo se vean más claramente. Espere 10 segundos para que el producto químico reaccione con la piel y luego limpie el área con una punta de algodón seca. Lavar con solución salina y secar con una punta de algodón limpia.
   15. Aplique con cuidado una pequeña cantidad de gel Super etch en una punta de algodón y luego aplíquelo en la superficie del cráneo. Esto crea una superficie más porosa a la que se adhiere el cemento dental.
   16. Aplica una cantidad generosa de solución salina en el cráneo para lavar el súper grabador y sécalo con una punta de algodón limpia.
   17. Identifica el bregma y márcalo con el rotulador.
   18. Taladre una hendidura para el tornillo de anclaje en un lugar que no obstruya la colocación de la cánula guía.
       NOTA: Si el ventrículo lateral derecho está canulado, perfore en el hemisferio izquierdo y posteriormente en relación con el ventrículo.
   19. Sostenga el taladro en un ángulo de ~ 75 ° -80 ° con respecto al cráneo y taladre lentamente una hendidura con una profundidad de aproximadamente la mitad del grosor del cráneo. Use solución salina en una punta de algodón para limpiar el polvo de los huesos.
   20. Inserte con cuidado el tornillo sujetándolo firmemente en la hendidura con pinzas y atornillándolo en el cráneo con el destornillador, evitando romperse en el cráneo. Después de cada vuelta completa, pruebe si el tornillo se asienta firmemente.
   21. Confirme que el cráneo es plano. Usando los brazos móviles del marco, coloque la cánula guía para tocar el cráneo en bregma. Ponga a cero el DV (dorsal-ventral) que representa las coordenadas del plano Z pulsando el botón en el monitor de control de fotogramas.
   22. Levante la cánula guía (22 G y 4 mm de longitud) con los brazos móviles del marco y muévala a lambda. Bájalo para que toque la superficie del cráneo y vuelve a notar la pantalla DV.
       NOTA: La diferencia entre DV en bregma y DV en lambda debe ser inferior a 0,2 mm. Si es necesario, ajuste el cono de la nariz en consecuencia, es decir, mueva la cabeza de la rata hacia arriba o hacia abajo según sea necesario, y repita las mediciones.
   23. Mueva la cánula guía hacia atrás para tocar bregma y vuelva a poner a cero las tres coordenadas: DV, AP (antero-posterior) y ML (medial-lateral) presionando los botones del monitor.
   24. Mueva la cánula guía a las coordenadas preestablecidas de su elección.
       NOTA: Para la canulación del ventrículo lateral derecho en una rata adulta de 300-350 g, se utilizaron las siguientes coordenadas: -0,7 mm AP, -1,4 mm ML y -4,00 mm DV (la misma longitud que la cánula guía).
   25. Marque la posición final de la cánula coloreando el extremo de la cánula con el rotulador y luego bajándolo hasta la superficie del cráneo para tocar y marcar la posición.
   26. Taladre un orificio de 2,3 mm de diámetro para la cánula guía de 22 G sujetando el eje de la broca en posición vertical recta, es decir, en un ángulo de 90° con respecto al scull. Tenga cuidado de adentrarse lenta y progresivamente en el cráneo, es decir, evite perforar el tejido cerebral.
       NOTA: Si es necesario, baje la cánula en el orificio con el brazo estereotáxico móvil para probar si la cánula se puede colocar con éxito o si se requiere una perforación adicional.
   27. Una vez que la cánula se haya bajado al cerebro, levántela de nuevo, aplique con cuidado superpegamento en la parte inferior del pedestal de plástico de la cánula y vuelva a bajar la cánula en el orificio utilizando el brazo móvil del marco estereotáxico.
   28. Déjalo en su lugar para permitir que el pegamento se asiente.
   29. Mientras espera, mezcle el solvente dental y el polvo (consulte la Tabla de materiales) en un bote de pesaje. Vierta el polvo de cemento dental en el recipiente de pesaje, use una jeringa de 1 mL para agregar ~ 300 μL de solvente y mezcle con la misma jeringa hasta que espese y tenga una consistencia utilizable. Si es necesario, agregue más polvo para aumentar la viscosidad o más solvente para reducir la viscosidad.
   30. Suelte la cánula del soporte de la cánula con el tornillo dedicado y levante con cuidado el brazo.
       NOTA: La cánula debe estar pegada al cráneo en un ángulo de 90°.
   31. Aplique el cemento dental fresco sobre el cráneo expuesto introduciéndolo en la jeringa desechable de 1 ml y aplicándolo alrededor de la cánula. Evite cualquier cemento dental en la piel o en la abertura de la cánula. Déjalo reposar durante unos segundos, dependiendo de su consistencia.
   32. Cuando el cemento dental se vuelva más espeso, use una espátula para aplicar más cemento dental y formar el soporte de cabeza final que cubra el tornillo por completo.
       NOTA: Tenga cuidado de no cubrir demasiado la cánula para que la cánula ficticia aún se pueda atornillar. Elimina el exceso de cemento dental de la piel.
   33. Inserte una cánula falsa estéril una vez que el cemento dental esté seco y firme.
   34. Apague el isoflurano, suelte las barras de los oídos, retire la rata del marco y colóquela en la caja de recuperación.
   35. Una vez que el animal se haya recuperado ~ 15-30 min, colóquelo en una caja limpia.
       NOTA: Después de la cirugía, las ratas deben tener un solo alojamiento. Considere reemplazar las tapas de las jaulas de rejilla estándar donde la tolva de alimentos desciende a la jaula con tapas de jaulas de rejilla dedicadas a gran altura para minimizar el riesgo de interferencia con el montaje de la cabeza. Alternativamente, bloquee cualquier parte de la jaula que esté mucho más baja que la altura de cría del animal.
   36. Complete la lista de verificación de monitoreo y monitoree según las pautas de monitoreo descritas en el protocolo.
       NOTA: Considere colocar algunos gránulos de comida en el piso para facilitar el acceso. Si no interfiere con el experimento, se puede proporcionar un alivio adicional del dolor en alimentos dulces para reemplazar las inyecciones adicionales de s.c. postoperatorias, por ejemplo, buprenorfina mezclada con pasta de chocolate con nueces dulces 35,36,37. En este caso, se proporcionó un poco del mismo dulce como recompensa antes y después de la cirugía para evitar la neofobia alimentaria al ofrecer alivio del dolor. La pasta de nueces se puede proporcionar en cinta adhesiva adherida a la pared de la jaula.
   37. Almacene más cánulas falsas que cánulas guía o cánulas de inyección, ya que podrían perderse entre la cama de la jaula del animal si se desprenden accidentalmente. En caso de que ocurra tal evento, reemplace la cánula por una cánula ficticia nueva y estéril.

2. Inyecciones de ICV

1. Prepare el fármaco y el vehículo, por ejemplo, 30 mg/ml de polimixina B (ver Tabla de materiales) en solución salina estéril al 0,9%. Mantener el volumen de inyección entre 5-10 μL en ratas adultas con un peso corporal comprendido entre 300-400 g.
2. Al menos 24 horas después de la cirugía, pesa la rata y transpórtala a la sala de procedimientos.
3. Calcule el volumen de inyección utilizando el peso corporal de la rata.
4. Retire la tapa de la jaula y desenrosque la cánula fictaña.
   NOTA: Las ratas generalmente se quedan quietas cuando las sostienen suavemente en su jaula y no necesitan sujeción. Un paño de cocina se puede usar para una rata curiosa o nerviosa o un cosquilleo en los pómulos.
5. Para una inyección en bolo, conecte el tubo de PE-50 (consulte la tabla de materiales) de al menos 40 cm de longitud a una microjeringa hermética al gas de 10 μL tirando de un extremo del tubo sobre la aguja fija o extraíble de la jeringa y asegurándose de un sellado hermético. Coloque la cánula inyectora instalada en el otro extremo del tubo.
   1. Extraiga la cantidad requerida a través de la cánula. Inserte la cánula en la guía hasta que esté colocada e inyecte. Una vez que se haya inyectado todo el líquido, sostenga el émbolo de la jeringa en su lugar durante al menos un minuto adicional para evitar el reflujo.
6. Para una tasa de administración más lenta, inyecte los medicamentos con una bomba de microinyección (consulte la tabla de materiales).
   1. En primer lugar, utilice agua filtrada y una jeringa desechable de 1 ml con una aguja de extracción de 23 g para llenar completamente el tubo de PE-50. A continuación, retire la jeringa desechable de la aguja de extracción y sustitúyala por la microjeringa.
   2. Retira 1-3 μL para crear una burbuja de aire pequeña pero visible. A continuación, extraiga la cantidad necesaria de medicamentos. Opcionalmente, marque la burbuja de aire con un marcador para ayudar en la visibilidad del flujo de fármaco. Bloquee la jeringa en su lugar en la bomba.
      NOTA: Asegúrese de que la configuración correcta del medicamento y el equipo utilizado, es decir, configure la velocidad de administración y el diámetro interno de la jeringa utilizada de acuerdo con el manual del usuario.
7. Una vez inyectado todo el líquido, detenga la bomba si no se detiene automáticamente. Deje la aguja insertada durante al menos un minuto más para evitar el reflujo.
8. Retire lentamente la cánula inyectora y enrosque la cánula guía.
9. Limpie el equipo aspirando y expulsando etanol y agua desionizada tres veces cada uno.

3. Muestreo de LCR y tejidos

1. Transporta a la rata a una sala de procedimientos.
2. Coloque la rata en la cámara de inducción e induzca la anestesia con isoflurano al 5% en oxígeno 2 L/min hasta que la respiración se haya ralentizado (~ 5 min).
3. Mueva la rata hacia el marco estereotáxico y mantenga el mismo nivel de anestesia profunda a través del cono de la nariz.
4. Comprueba el reflejo del pedal. Una vez ausente, fije la calavera en el marco con las barras de las orejas.
   NOTA: Puede ser un marco estereotáxico más simple sin pantalla, barras de oreja redondeadas o brazos móviles. Este es un procedimiento de no recuperación; La única característica necesaria son las barras de oreja de rata.
5. Con el cono de la nariz, incline la nariz de la rata hacia abajo a unos 45° para exponer el cuello a una buena posición de trabajo.
6. Con unas tijeras pequeñas, romas y curvas, palpa el cráneo y muévete posteriormente hasta el final del cráneo. En esta posición, corte la capa muscular más externa a través de la línea media del cuello, de unos 2-3 cm de longitud. Corta con cuidado todas las demás capas musculares.
   1. Use un pequeño retractor de resorte para mantener abierta la herida y permitir una buena visibilidad. Cortar hasta que la membrana de la cisterna magna sea visible. Use una punta de algodón para ayudar a eliminar suavemente más piel.
7. Si se produce sangrado, use una gasa para limpiar y detener el sangrado.
8. Si es necesario, use pequeñas tiras de tejido enrollado y colóquelo alrededor de la cisterna magna para evitar que la sangre contamine el líquido cefalorraquídeo.
   NOTA: Para confirmar el éxito de la inyección con tinte, inyecte 2-3 μL de colorante Evans Blue al 1,1% (ver Tabla de Materiales) en la rata anestesiada antes de recolectar el LCR utilizando la cánula ajustada y una jeringa desechable de 1 mL.
9. Para preparar la herramienta para extraer el líquido cefalorraquídeo, llene la jeringa con ~500 μL de agua filtrada, coloque una aguja de extracción de 23 G y tire del tubo sobre la aguja. Coloque una pipeta de vidrio tirado en el otro extremo del tubo.
10. Para extraer el líquido cefalorraquídeo, inserte lentamente la pipeta extraída en la cisterna magna expuesta.
    NOTA: El líquido cefalorraquídeo fluirá lenta y pasivamente hacia la pipeta y se extraerá activamente con la jeringa. Si se inyecta el tinte, el líquido cefalorraquídeo sería de color azul (Figura 1).
11. Agregue el líquido cefalorraquídeo en un tubo etiquetado y colóquelo inmediatamente sobre hielo seco. A continuación, el líquido cefalorraquídeo puede almacenarse a -80 °C.
12. Recoja cualquier otro tejido de interés para su análisis. En el caso del plasma, recoja al menos 3 ml de sangre cardíaca.
    1. Coloque a la rata profundamente anestesiada en su espalda y abra la cavidad torácica para exponer el corazón. Use un hemostático para sujetar la caja torácica y colóquelo en la garganta del animal para ayudar a la visibilidad. Use pinzas de tejido con ganchos para sujetar el ventrículo derecho e inserte una jeringa desechable de 5 ml con una aguja de 18 g en el ventrículo izquierdo paralelamente al tabique. Extraiga lentamente la sangre hacia la jeringa. Una vez que se recolectaron de 3 a 5 ml de sangre, retire la aguja del corazón.
13. Retire la aguja de la jeringa y colóquela en un recipiente afilado. Transfiera la sangre a tubos heparinizados y centrifuga a 2.739 x g y 4 °C durante 15 minutos antes de recoger el sobrenadante con una pipeta de 200 μL y congelarla en hielo seco.
14. Practica la eutanasia a la rata extrayéndole el corazón con unas tijeras. Cierre el suministro de isoflurano.
15. Recolectar cualquier otro órgano abdominal de interés, como el riñón o el bazo. Identifique el órgano, sostenga el órgano de interés con pinzas de tejido con ganchos, levántelo y corte cualquier inserción. Coloque el órgano en un tubo etiquetado y congele a presión sobre hielo seco.
16. Para extraer el cerebro, decapita al animal con un par de tijeras grandes y afiladas cortando en la base del cráneo. Retire el soporte de la cabeza con la mano. Corta a través de la piel restante que cubre el cráneo.
17. Con unas tijeras de disector, corte el cráneo en la línea media desde la base hasta la lambda, es decir, corte el hueso supraoccipital por la mitad. Use un hemostático para agarrar la mitad y apartarla. Repita en el otro lado para exponer el cerebelo por completo.
18. Proceda a cortar a lo largo de la sutura sagital hasta el hueso frontal. Use un hemostático para separar cada uno de los huesos parietales. Si es necesario, corte más el hueso frontal y retire más hueso para exponer los bulbos olfativos.
19. Sostenga la cabeza boca abajo y retire cuidadosamente el cerebro con una espátula, separándolo de los nervios óptico y trigémino cortándolos con la espátula. Recoja el cerebro en un tubo y congélelo en hielo seco.
20. Los ventrículos cerebrales se teñirán de azul si se inyecta el tinte. Use una cuchilla desechable para cortar el cerebro en el lugar de la inyección (Figura 2A, B) y ~ 1 cm posterior (Figura 2C) para investigar la distribución del tinte en los ventrículos.
21. Para extirpar la médula espinal, expone la columna vertebral cortando la piel a lo largo de la línea media de la superficie dorsal de la rata. Extirpar la columna de vertebrados haciendo una incisión bilateral alrededor de ella y cortándola transversalmente en el extremo caudal de la médula espinal lumbar.
22. Corta la lámina bilateralmente a lo largo de la columna con unas tijeras hasta que toda la médula espinal quede expuesta. Levante la médula espinal desde un extremo, por ejemplo, el extremo rostral, y extráigala cortando los nervios espinales en dirección caudal hasta que se corten todos los nervios. Recoja la médula espinal en un tubo y congele la congelación en hielo seco.
    NOTA: Pesar todos los tubos antes y después de la recolección de órganos para el análisis de datos. Si es necesario y apropiado, se puede lavar el sistema ventricular después de la recolección del líquido cefalorraquídeo y antes de la recolección del cerebro para eliminar los medicamentos residuales en los compartimentos ventriculares. Utilice una jeringa de 1 ml llena de solución salina conectada al tubo y a una cánula inyectora e insértela en la cánula guía. Inyecte 2-3 mL de solución salina. La solución salina debe salir por la abertura de la cisterna magna. Las cánulas guía, las cánulas ficticias y los tornillos se pueden reutilizar sumergiéndolos en acetona durante 24 horas, seguido de remojándolos y limpiándolos con detergente médico y agua. Una vez seco, el cemento dental residual se puede eliminar con pinzas finas.

Resultados

El protocolo quirúrgico presentado es altamente exitoso, con cirujanos entrenados que alcanzaron una tasa de supervivencia del >99,8% y los animales mostraron un peso corporal estable después de la cirugía en el día 1, en comparación con su peso previo a la cirugía en el día 0 (promedio ± DE de 315,8 g ± 42,1 g para el día 0 y 314,1 g ± 43,0 g para el día 1, Figura 3).

Antes de recolectar el líquido cefalorraquídeo, ...

Discusión

Los investigadores y los médicos emplean inyecciones de ICV para eludir el mecanismo de protección de la BHE y administrar fármacos directamente en el SNC 12,18,19,21,24. El presente trabajo es un protocolo completo de ICV para administrar fármacos de manera eficiente en el SNC y extraer LCR para el análisis farmacocinét...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Terumo, Japan	SS+01T
5 mL syringes	Terumo, Japan	SS+05S
Acetone	Merck, Germany	67641
Bench protector sheets	Halyard, USA	2765-C
Betadine	Mundipharma, Netherlands	1015695
Buprenorphine; Temgesic	Clifford Hallam Healthcare, Australia	1238366
Carprofen	Zoetis, Australia	10001132
Chlorhexidine	Tasman Chemicals, Australia	890401
Chux superwipes (or equivalent)	Chux, Australia	n/a	autoclaved
Clippers	n/a	n/a
Cotton swabs	LP Italiana, Italy	112191	autoclaved
Dental cement powder (Vertex Self cure powder)	Henry Schein, USA	VX-SC500GVD5
Dental cement solvent (Vertex Self cure liquid)	Henry Schein, USA	VX-SC250MLLQ
Disposable needles: 18 G, 26 G, 30 G	Terumo, Japan	NN+2525RL
Disposable surgical blades	Westlab, Australia	663-255
Dissector scissors	F.S.T.	14082-09
Dummy cannulas	Bio Scientific, Australia	C313DC/SPC	cut to 4.05 to fit the guide cannula
Ethanol 80%	Merck, Australia	10107
Evan's blue dye	Sigma	E2129 - 50G
Eye lube	Clifford Hallam Healthcare, Australia	2070491
Felt tip pen	Sharpie, USA	D-4236
Fibre optic light source	n/a	n/a
Flattened needle (18 G) or similar to apply superglue	n/a	n/a
Glass pipettes, pulled	Hirschmann Laborgeraete, Germany	9100175
Glass syringe 10 uL	Hamilton, USA	701 LT and 1701 LT
Guide cannulas	Bio Scientific, Australia	C313G/SPC	22 G, cut 4 mm below the pedestal for lateral ventricle cannulation in adult Sprague Dawley rats
Haemostat
Heat bead steriliser	Inotech, Switzerland	IS-250
Heat pad	n/a	n/a
Hydrogen peroxide 3%	Perrigo, Australia	11383
Induction chamber (Perspex 300 mm x 200 mm)	n/a	n/a
Injector cannula	Bio Scientific, Australia	C313I/SPC	cut to fit the 4 mm cannula + 0.5 mm projection
Isoflurane	Clifford Hallam Healthcare, Australia	2093803
Isoflurane vaporiser and appropriate scavenging system	n/a	n/a
Medium size weighing boats	n/a	n/a
Metal spatula	Met-App, Australia	n/a
Micro syringe pump	New Era, USA	NE-300
Microdrill	RWD Life Science Co, China	87001
Polymyxin B	Beta Pharma, China	86-40302
Protein LoBind tubes, 0.5 mL	Eppendorf, Germany	Z666491
Ropivacaine 1%; Naropin	AstraZeneca, UK	PS09634
Scissors, large	F.S.T.	14511-15
Scissors, small	F.S.T.	14079-10
Screwdriver	n/a	n/a
Screws	Mr. Specs, Australia	n/a
Stereotaxic frame	RWD Life Science Co, China	n/a	Necessary components: rat ear bars, tooth bar, anaesthesia nose cone, arm with digital readout (X, Y, Z) and cannula holder
Sterile saline 0.9%	Baxter, USA	AHB1323
Super etch (37% phosphoric acid) gel	SDI Limited, Australia	8100045
Superglue	UHU, Germany	n/a
Tissue forceps with hooks	F.S.T.	11027-12
Tubing, PE-50	Bio Scientific, Australia	C313CT