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Method Article
Die direkte Verabreichung von Therapeutika an das zentrale Nervensystem ist eine Möglichkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu umgehen. Das vorliegende Protokoll zeigt eine intrazerebroventrikuläre Injektion zur anschließenden Entnahme von Liquor cerebrospinalis und Körperorganen. Dies erleichtert die Untersuchung der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Arzneimitteln im Tiermodell für die Entwicklung neuer Therapien.
Obwohl die Blut-Hirn-Schranke (BHS) das Gehirn vor Fremdkörpern schützt, verhindert sie auch, dass einige Therapeutika in das Zentralnervensystem (ZNS) eindringen, um Krankheiten oder Infektionen zu lindern. Medikamente werden bei Tieren und Menschen direkt in das ZNS verabreicht, um die BHS zu umgehen. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zur Behandlung von Hirninfektionen durch intraventrikuläre Verabreichung von Antibiotika, d.h. Polymyxinen, den Antibiotika der letzten Wahl zur Behandlung multiresistenter gramnegativer Bakterien. Es wurde ein einfaches stereotaktisches Operationsprotokoll entwickelt, um bei Ratten eine Führungskanüle zu implantieren, die in den Seitenventrikel reicht. Nach einer Erholungsphase von 24 h können Ratten bewusst und wiederholt durch eine Kanüle, die an der Schablone befestigt wird, injiziert werden. Die Injektionen können manuell als Bolus oder Infusion mit einer Mikroinjektionspumpe verabreicht werden, um eine langsame und kontrollierte Flussrate zu erhalten. Die intraventrikuläre Injektion wurde erfolgreich mit dem Farbstoff Evans Blue bestätigt. Liquor cerebrospinalis (CSF) kann abgelassen werden, das Gehirn und andere Organe können entnommen werden. Dieser Ansatz ist sehr gut geeignet für Studien, die die Verabreichung des Arzneimittels an das ZNS und die anschließende Bewertung der pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Aktivität beinhalten.
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist ein entscheidender Schutzmechanismus für das zentrale Nervensystem (ZNS). Die selektiv durchlässige, anatomische Barriere trennt das zirkulierende Blut und seine gelösten Bestandteile von der extrazellulären Flüssigkeit des Gehirns und verhindert so, dass die meisten Moleküle in das Gehirn gelangen 1,2,3,4, abhängig von ihrer Größe, ihrer Lipophilie 5 und der Verfügbarkeit eines aktiven Transportmechanismus 2.
Diese Schutzbarriere ist vorteilhaft für die wirksame Regulierung der komplizierten Homöostase des Gehirns und der Gesundheit des ZNS 4,6. Es erschwert jedoch auch die Verabreichung von Medikamenten zur Behandlung von Infektionen im Gehirn oder anderen ZNS-Erkrankungen 4,7. Abgesehen von der Störung der BHS mit einer Vielzahl von Methoden 8,9 besteht der primäre Ansatz zur Umgehung der BHS darin, ein Medikament direkt ins Gehirn zu bringen, indem es in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) freigesetzt wird4. Obwohl es sich um eine relativ invasive Praxis handelt, wurde sie erfolgreich eingesetzt, um Patienten und Labortieren gezielte Therapeutika zu verabreichen. Beim Menschen können Arzneimittel in das intraventrikuläre System oder den Liquor abgegeben und anschließend unter Verwendung des Ommaya-Reservoirs, eines Reservoirs, das sich unter der Kopfhaut befindet und an einem Katheter befestigt ist, der in den lateralen Ventrikel eingeführt wird10,11, entnommen werden. Ähnliche Techniken wurden bei Labortieren wie Nagetieren etabliert, um gleichwertige Ziele zu erreichen. Mikroosmotische Pumpen wurden bei Mäusen 12,13,14,15 und Ratten16,17 implantiert, um eine kontinuierliche Wirkstoffabgabe in das ventrikuläre System oder das Hirnparenchym zu ermöglichen. Zusätzlich wurden direkte intrazerebroventrikuläre Injektionen bei anästhesierten Mäusen mit einer Einwegnadel18,19 und bei bewussten Ratten über eine chirurgisch implantierte Kanüledurchgeführt 20,21,22,23. Die Verabreichung von Medikamenten an das ZNS war eine unschätzbare Methode, um das Verständnis in verschiedenen Bereichen zu verbessern 20,24,25,26,27,28.
ZNS-Infektionen sind ein solcher Bereich, der dringend neue Therapeutika und ein besseres Verständnis der bestehenden antiinfektiven Therapien benötigt. ZNS-Infektionen, die durch multiresistente gramnegative Bakterien verursacht werden, sind besonders besorgniserregend7. Polymyxine sind die Antibiotika der letzten Wahl, die zunehmend zur Behandlung von Infektionen aufgrund dieser "Superkeime" eingesetzt werden29. Wenn Polymyxine gemäß den aktuellen Dosierungsrichtlinien30 intravenös verabreicht werden, ist ihre Penetration in das ZNS sehr gering, während höhere Dosen das Risiko einer Nephrotoxizität erhöhen. Daher ist die intravenöse Polymyxin-Therapie zur Behandlung von ZNS-Infektionen von geringem Nutzen7. Die Etablierung eines sicheren und wirksamen Dosierungsschemas für die Verabreichung von Polymyxinen an das ZNS ist ein dringender ungedeckter medizinischer Bedarf 31,32,33. Daher wurde das vorliegende Protokoll mit dem Schwerpunkt auf der direkten Injektion von Antibiotika in den Liquor von Ratten etabliert und beschrieben. Es kann jedoch zur Verabreichung jedes Arzneimittels verwendet werden, das nicht neurotoxisch ist und bei dem therapeutische Konzentrationen in kleinen Mengen verabreicht werden können (z. B. bis zu 10 μl bei Ratten). Die beschriebenen Techniken können auch so modifiziert werden, dass sie auf verschiedene Gehirnregionen abzielen und mehrere Injektionen verabreichen.
Das vorliegende Protokoll stellt eine unkomplizierte Operations- und Injektionstechnik dar, die eine effiziente Pharmakokinetik und Verteilung von Arzneimitteln nach der ICV-Verabreichung ermöglicht. Bei der Operation wird eine Führungskanüle implantiert. Da es sich um ein weniger invasives Verfahren handelt als die Implantation einer mikroosmotischen Pumpe 12,13,14,15,16,17, ist dies eine fortgeschrittene Option, die für die kurzfristige Verabreichung von Arzneimitteln in den Liquor geeignet ist. Dieses Protokoll ist vereinfacht und kann 24 Stunden nach der Operation zu sehr hohen Überlebensraten und stabilen Körpergewichten führen, was eine Verbesserung im Vergleich zu bestehenden Methoden darstellt34. Nach der Operation erhielten die Ratten bei Bewusstsein entweder eine manuelle Bolus-ICV-Injektion oder eine langsamere Verabreichung mit einer Mikropumpe, um die maximalen Plasmakonzentrationen zu senken. Gleichzeitig konnten sie sich in ihrem Käfig frei bewegen. Um sichere und wirksame Dosierungsschemata für Arzneimittel zu etablieren, wurden dann Proben von Liquor, Gehirn, Rückenmark, Niere, Plasma usw. verwendet, um die Pharmakokinetik und die Arzneimittelverteilung nach intrazerebroventrikulärer (ICV) Verabreichung zu untersuchen. Die Wirkstoffverteilung kann auch visuell untersucht werden, z.B. mit Hilfe der Immunhistochemie oder der matrixgestützten Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (MALDI-MSI). Bei Bedarf kann eine beidseitige Kanüle implantiert werden, um z.B. Medikamente zu injizieren, die sich sonst einseitig in beide Hemisphären verteilen würden.
Alle Versuche wurden nach dem australischen Kodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke durchgeführt. Die Experimente wurden von der Ethikkommission der University of Melbourne genehmigt (Antrag #1914890). Für die Experimente wurden 8-14 Wochen alte männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet.
1. Stereotaktische Chirurgie zur Kanülierung des lateralen Ventrikels
2. ICV-Injektionen
3. Liquor- und Gewebeprobenahme
Das vorgestellte Operationsprotokoll ist sehr erfolgreich: Geschulte Chirurgen erreichten eine Überlebensrate von >99,8 % und die Tiere zeigten nach der Operation an Tag 1 ein stabiles Körpergewicht, verglichen mit ihrem Gewicht vor der Operation an Tag 0 (mittlere ± SD von 315,8 g ± 42,1 g für Tag 0 und 314,1 g ± 43,0 g für Tag 1, Abbildung 3).
Vor der Entnahme von Liquor kann eine Injektion von 1,1 % Evans Blue Farbstoff ...
Forscher und Kliniker setzen ICV-Injektionen ein, um den Schutzmechanismus der BHS zu umgehen und Medikamente direkt in das ZNS zu bringen 12,18,19,21,24. Die vorliegende Arbeit ist ein vollständiges ICV-Protokoll für die effiziente Verabreichung von Arzneimitteln in das ZNS und die Extraktion von Liquor für die pharmakokin...
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Die Autoren danken der Biomedical Science Animal Facility an der University of Melbourne für die Bereitstellung und Pflege der Tiere. Diese Forschung wurde durch ein Forschungsstipendium des National Institute of Allergy and Infectious Diseases des National Institute of Health (R01 AI146241, GR und TV) unterstützt. JL ist Principal Research Fellow des Australian National Health Medical Research Council (NHMRC). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung des Nationalen Instituts für Allergien und Infektionskrankheiten oder des Nationalen Instituts für Gesundheit wieder.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetone | Terumo, Japan | SS+01T | |
5 mL syringes | Terumo, Japan | SS+05S | |
Acetone | Merck, Germany | 67641 | |
Bench protector sheets | Halyard, USA | 2765-C | |
Betadine | Mundipharma, Netherlands | 1015695 | |
Buprenorphine; Temgesic | Clifford Hallam Healthcare, Australia | 1238366 | |
Carprofen | Zoetis, Australia | 10001132 | |
Chlorhexidine | Tasman Chemicals, Australia | 890401 | |
Chux superwipes (or equivalent) | Chux, Australia | n/a | autoclaved |
Clippers | n/a | n/a | |
Cotton swabs | LP Italiana, Italy | 112191 | autoclaved |
Dental cement powder (Vertex Self cure powder) | Henry Schein, USA | VX-SC500GVD5 | |
Dental cement solvent (Vertex Self cure liquid) | Henry Schein, USA | VX-SC250MLLQ | |
Disposable needles: 18 G, 26 G, 30 G | Terumo, Japan | NN+2525RL | |
Disposable surgical blades | Westlab, Australia | 663-255 | |
Dissector scissors | F.S.T. | 14082-09 | |
Dummy cannulas | Bio Scientific, Australia | C313DC/SPC | cut to 4.05 to fit the guide cannula |
Ethanol 80% | Merck, Australia | 10107 | |
Evan's blue dye | Sigma | E2129 - 50G | |
Eye lube | Clifford Hallam Healthcare, Australia | 2070491 | |
Felt tip pen | Sharpie, USA | D-4236 | |
Fibre optic light source | n/a | n/a | |
Flattened needle (18 G) or similar to apply superglue | n/a | n/a | |
Glass pipettes, pulled | Hirschmann Laborgeraete, Germany | 9100175 | |
Glass syringe 10 uL | Hamilton, USA | 701 LT and 1701 LT | |
Guide cannulas | Bio Scientific, Australia | C313G/SPC | 22 G, cut 4 mm below the pedestal for lateral ventricle cannulation in adult Sprague Dawley rats |
Haemostat | |||
Heat bead steriliser | Inotech, Switzerland | IS-250 | |
Heat pad | n/a | n/a | |
Hydrogen peroxide 3% | Perrigo, Australia | 11383 | |
Induction chamber (Perspex 300 mm x 200 mm) | n/a | n/a | |
Injector cannula | Bio Scientific, Australia | C313I/SPC | cut to fit the 4 mm cannula + 0.5 mm projection |
Isoflurane | Clifford Hallam Healthcare, Australia | 2093803 | |
Isoflurane vaporiser and appropriate scavenging system | n/a | n/a | |
Medium size weighing boats | n/a | n/a | |
Metal spatula | Met-App, Australia | n/a | |
Micro syringe pump | New Era, USA | NE-300 | |
Microdrill | RWD Life Science Co, China | 87001 | |
Polymyxin B | Beta Pharma, China | 86-40302 | |
Protein LoBind tubes, 0.5 mL | Eppendorf, Germany | Z666491 | |
Ropivacaine 1%; Naropin | AstraZeneca, UK | PS09634 | |
Scissors, large | F.S.T. | 14511-15 | |
Scissors, small | F.S.T. | 14079-10 | |
Screwdriver | n/a | n/a | |
Screws | Mr. Specs, Australia | n/a | |
Stereotaxic frame | RWD Life Science Co, China | n/a | Necessary components: rat ear bars, tooth bar, anaesthesia nose cone, arm with digital readout (X, Y, Z) and cannula holder |
Sterile saline 0.9% | Baxter, USA | AHB1323 | |
Super etch (37% phosphoric acid) gel | SDI Limited, Australia | 8100045 | |
Superglue | UHU, Germany | n/a | |
Tissue forceps with hooks | F.S.T. | 11027-12 | |
Tubing, PE-50 | Bio Scientific, Australia | C313CT |
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