Intraventrikuläre Wirkstoffverabreichung und Probenahme für pharmakokinetische und pharmakodynamische Studien

Zusammenfassung

Die direkte Verabreichung von Therapeutika an das zentrale Nervensystem ist eine Möglichkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu umgehen. Das vorliegende Protokoll zeigt eine intrazerebroventrikuläre Injektion zur anschließenden Entnahme von Liquor cerebrospinalis und Körperorganen. Dies erleichtert die Untersuchung der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Arzneimitteln im Tiermodell für die Entwicklung neuer Therapien.

Zusammenfassung

Obwohl die Blut-Hirn-Schranke (BHS) das Gehirn vor Fremdkörpern schützt, verhindert sie auch, dass einige Therapeutika in das Zentralnervensystem (ZNS) eindringen, um Krankheiten oder Infektionen zu lindern. Medikamente werden bei Tieren und Menschen direkt in das ZNS verabreicht, um die BHS zu umgehen. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode zur Behandlung von Hirninfektionen durch intraventrikuläre Verabreichung von Antibiotika, d.h. Polymyxinen, den Antibiotika der letzten Wahl zur Behandlung multiresistenter gramnegativer Bakterien. Es wurde ein einfaches stereotaktisches Operationsprotokoll entwickelt, um bei Ratten eine Führungskanüle zu implantieren, die in den Seitenventrikel reicht. Nach einer Erholungsphase von 24 h können Ratten bewusst und wiederholt durch eine Kanüle, die an der Schablone befestigt wird, injiziert werden. Die Injektionen können manuell als Bolus oder Infusion mit einer Mikroinjektionspumpe verabreicht werden, um eine langsame und kontrollierte Flussrate zu erhalten. Die intraventrikuläre Injektion wurde erfolgreich mit dem Farbstoff Evans Blue bestätigt. Liquor cerebrospinalis (CSF) kann abgelassen werden, das Gehirn und andere Organe können entnommen werden. Dieser Ansatz ist sehr gut geeignet für Studien, die die Verabreichung des Arzneimittels an das ZNS und die anschließende Bewertung der pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Aktivität beinhalten.

Einleitung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist ein entscheidender Schutzmechanismus für das zentrale Nervensystem (ZNS). Die selektiv durchlässige, anatomische Barriere trennt das zirkulierende Blut und seine gelösten Bestandteile von der extrazellulären Flüssigkeit des Gehirns und verhindert so, dass die meisten Moleküle in das Gehirn gelangen ^1,2,3,4, abhängig von ihrer Größe, ihrer Lipophilie 5 und der Verfügbarkeit eines aktiven Transportmechanismus 2.

Diese Schutzbarriere ist vorteilhaft für die wirksame Regulierung der komplizierten Homöostase des Gehirns und der Gesundheit des ZNS ^4,6. Es erschwert jedoch auch die Verabreichung von Medikamenten zur Behandlung von Infektionen im Gehirn oder anderen ZNS-Erkrankungen ^4,7. Abgesehen von der Störung der BHS mit einer Vielzahl von Methoden ^8,9 besteht der primäre Ansatz zur Umgehung der BHS darin, ein Medikament direkt ins Gehirn zu bringen, indem es in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) freigesetzt ^wird4. Obwohl es sich um eine relativ invasive Praxis handelt, wurde sie erfolgreich eingesetzt, um Patienten und Labortieren gezielte Therapeutika zu verabreichen. Beim Menschen können Arzneimittel in das intraventrikuläre System oder den Liquor abgegeben und anschließend unter Verwendung des Ommaya-Reservoirs, eines Reservoirs, das sich unter der Kopfhaut befindet und an einem Katheter befestigt ist, der in den lateralen Ventrikel eingeführt wird^10,11, ^entnommen werden. Ähnliche Techniken wurden bei Labortieren wie Nagetieren etabliert, um gleichwertige Ziele zu erreichen. Mikroosmotische Pumpen wurden bei Mäusen 12,13,14,15 und Ratten^16,17 implantiert^, um eine kontinuierliche Wirkstoffabgabe in das ventrikuläre System oder das Hirnparenchym zu ermöglichen. Zusätzlich wurden direkte intrazerebroventrikuläre Injektionen bei anästhesierten Mäusen mit einer Einwegnadel^18,19 und bei bewussten Ratten über eine chirurgisch implantierte Kanüle^{durchgeführt} 20,21,22,23. Die Verabreichung von Medikamenten an das ZNS war eine unschätzbare Methode, um das Verständnis in verschiedenen Bereichen zu verbessern 20,24,25,26,27,28.

ZNS-Infektionen sind ein solcher Bereich, der dringend neue Therapeutika und ein besseres Verständnis der bestehenden antiinfektiven Therapien benötigt. ZNS-Infektionen, die durch multiresistente gramnegative Bakterien verursacht werden, sind besonders besorgniserregend⁷. Polymyxine sind die Antibiotika der letzten Wahl, die zunehmend zur Behandlung von Infektionen aufgrund dieser "Superkeime" eingesetzt ^werden29. Wenn Polymyxine gemäß den aktuellen Dosierungsrichtlinien³⁰ intravenös verabreicht werden, ist ihre Penetration in das ZNS sehr gering, während höhere Dosen das Risiko einer Nephrotoxizität erhöhen. Daher ist die intravenöse Polymyxin-Therapie zur Behandlung von ZNS-Infektionen von geringem Nutzen⁷. Die Etablierung eines sicheren und wirksamen Dosierungsschemas für die Verabreichung von Polymyxinen an das ZNS ist ein dringender ungedeckter medizinischer Bedarf 31,32,33. Daher wurde das vorliegende Protokoll mit dem Schwerpunkt auf der direkten Injektion von Antibiotika in den Liquor von Ratten etabliert und beschrieben. Es kann jedoch zur Verabreichung jedes Arzneimittels verwendet werden, das nicht neurotoxisch ist und bei dem therapeutische Konzentrationen in kleinen Mengen verabreicht werden können (z. B. bis zu 10 μl bei Ratten). Die beschriebenen Techniken können auch so modifiziert werden, dass sie auf verschiedene Gehirnregionen abzielen und mehrere Injektionen verabreichen.

Das vorliegende Protokoll stellt eine unkomplizierte Operations- und Injektionstechnik dar, die eine effiziente Pharmakokinetik und Verteilung von Arzneimitteln nach der ICV-Verabreichung ermöglicht. Bei der Operation wird eine Führungskanüle implantiert. Da es sich um ein weniger invasives Verfahren handelt als die Implantation einer mikroosmotischen Pumpe 12,13,14,15,16,17, ist dies eine fortgeschrittene Option, die für die kurzfristige Verabreichung von Arzneimitteln in den Liquor geeignet ist. Dieses Protokoll ist vereinfacht und kann 24 Stunden nach der Operation zu sehr hohen Überlebensraten und stabilen Körpergewichten führen, was eine Verbesserung im Vergleich zu bestehenden Methoden darstellt³⁴. Nach der Operation erhielten die Ratten bei Bewusstsein entweder eine manuelle Bolus-ICV-Injektion oder eine langsamere Verabreichung mit einer Mikropumpe, um die maximalen Plasmakonzentrationen zu senken. Gleichzeitig konnten sie sich in ihrem Käfig frei bewegen. Um sichere und wirksame Dosierungsschemata für Arzneimittel zu etablieren, wurden dann Proben von Liquor, Gehirn, Rückenmark, Niere, Plasma usw. verwendet, um die Pharmakokinetik und die Arzneimittelverteilung nach intrazerebroventrikulärer (ICV) Verabreichung zu untersuchen. Die Wirkstoffverteilung kann auch visuell untersucht werden, z.B. mit Hilfe der Immunhistochemie oder der matrixgestützten Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (MALDI-MSI). Bei Bedarf kann eine beidseitige Kanüle implantiert werden, um z.B. Medikamente zu injizieren, die sich sonst einseitig in beide Hemisphären verteilen würden.

Protokoll

Alle Versuche wurden nach dem australischen Kodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke durchgeführt. Die Experimente wurden von der Ethikkommission der University of Melbourne genehmigt (Antrag #1914890). Für die Experimente wurden 8-14 Wochen alte männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten verwendet.

1. Stereotaktische Chirurgie zur Kanülierung des lateralen Ventrikels

1. Verwenden Sie während der Operation autoklavierte Wattestäbchen und OP-Abdeckungen.
2. Richten Sie Folgendes für die Operation ein.
   1. Richten Sie den stereotaktischen Rahmen, das Anästhesieverabreichungssystem, Medikamente, Chemikalien und Hilfsmittel ein (siehe Materialtabelle). Reinigen Sie den stereotaktischen Rahmen, die faseroptische Lichtquelle, den Handbohrer usw. mit 80% Ethanol.
   2. Tränken Sie die 22 G Führungskanüle und die zugehörige Dummy-Kanüle (siehe Materialtabelle) in 80%igem Ethanol zur Sterilisation.
      HINWEIS: Der Hersteller hat die 22 G Führung und die Dummy-Kanüle auf ~4 mm Länge unterhalb des Sockels vorgeschnitten.
   3. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente (siehe Materialtabelle) mit dem Heatbead-Sterilisator für 20 s und besprühen Sie sie anschließend mit 80% Ethanol. Legen Sie die sterilisierten Instrumente auf das sterile Abdecktuch.
   4. Bereiten Sie eine Wiederherstellungsbox vor (eine Rattenhaltungsbox, die mit einem Unterpolster ausgekleidet ist), wobei die Hälfte der Box über ein Heizkissen gelegt wird.
3. Führen Sie die Operation durch.
   1. Schrauben Sie die ethanolgereinigte 22 G Führungskanüle in den Kanülenhalter am stereotaktischen Rahmen.
   2. Setzen Sie die Ratte in eine Induktionskammer (300 mm x 200 mm, siehe Materialtabelle) und leiten Sie eine Anästhesie mit 5 % Isofluran bei 1 l/min Sauerstoff ein.
   3. Sobald die Ratte tief anästhesiert ist (kein Pedalreflex), bewegen Sie die Ratte auf den stereotaktischen Rahmen und reduzieren Sie Isofluran auf 2%-3% in 1 L/min Sauerstoff zur Aufrechterhaltung durch den Nasenkonus. Haken Sie die Zähne in die Beißstange ein und ziehen Sie den Nasenkegel vorsichtig über die Nase - ziehen Sie die Ratte vorsichtig zurück, um zu überprüfen, ob sie fest sitzt.
   4. Tragen Sie schützendes Augengleitmittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu vermeiden.
   5. Injizieren Sie Carprofen (5 mg/kg), Buprenorphin (0,05 mg/kg) in Kochsalzlösung und 3 ml Kochsalzlösung subkutan (s.c.) zur Schmerzbehandlung und zur Unterstützung der postoperativen Genesung.
   6. Kneifen Sie die Zehen zusammen, um den Pedalreflex zu überprüfen. Wenn er nicht vorhanden ist, befestige den Schädel der Ratte im Rahmen. Setzen Sie einen Ohrbügel in den Gehörgang ein und ziehen Sie ihn fest. Wiederholen auf der anderen Seite.
   7. Bewegen Sie die Ohrbügel seitlich, um sicherzustellen, dass die auf den Ohrbügeln angegebenen Zahlen auf beiden Seiten gleich sind. Der Kopf sollte sich beim Druck auf den Schädel nicht bewegen.
   8. Rasieren Sie die Oberseite des Kopfes mit einer Haarschneidemaschine. Wischen Sie das Haar mit einem Taschentuch und Kochsalzlösung ab. Tragen Sie bei Bedarf erneut Augenschmiermittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu vermeiden.
   9. Tupfen Sie die Kopfhaut mit 4% Chlorhexidin und alkoholischer Hautvorbereitungslösung ab und verwenden Sie für jeden Schritt sterile Wattestäbchen (siehe Materialtabelle). Beginnen Sie in der Mitte des Schädels und bewegen Sie sich in Kreisen nach außen, bis alle Oberflächen gereinigt sind.
   10. Injizieren Sie ~150 μl Ropivacain (1%) s.c. (siehe Materialtabelle) entlang der vorgesehenen Inzisionsstelle.
   11. Verwenden Sie die Skalpellklinge, um einen 10-15 mm großen Schnitt entlang der Mittellinie des Kopfes zu machen, von zwischen den Augen bis zur Schädelbasis.
   12. Mit den Wattespitzen und dem Skalpell das Bindegewebe abkratzen und den Schädel freilegen.
   13. Tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen in eine 3%ige Wasserstoffperoxidlösung und tragen Sie es auf die Schädeloberfläche auf. Warten Sie 5 Sekunden, bis die Chemikalie mit der Haut reagiert hat, und reinigen Sie dann den Bereich mit einem trockenen Wattestäbchen.
   14. Tragen Sie 3% Wasserstoffperoxid ein zweites Mal auf. Dadurch werden die Nahtlinien des Schädels deutlicher. Warten Sie 10 Sekunden, bis die Chemikalie mit der Haut reagiert hat, und reinigen Sie den Bereich dann mit einem trockenen Wattestäbchen. Mit Kochsalzlösung waschen und mit einem sauberen Wattestäbchen trocknen.
   15. Tragen Sie vorsichtig eine kleine Menge Super Etch Gel auf eine Wattespitze auf und tragen Sie es dann auf die Oberfläche des Schädels auf. Dadurch entsteht eine porösere Oberfläche, auf der der Zahnzement haften kann.
   16. Tragen Sie eine großzügige Menge Kochsalzlösung auf den Schädel auf, um das Superätzmittel abzuwaschen, und trocknen Sie es mit einer sauberen Wattestäbchen.
   17. Identifizieren Sie Bregma und markieren Sie es mit dem Filzstift.
   18. Bohren Sie eine Vertiefung für die Ankerschraube an einer Stelle, die die Platzierung der Führungskanüle nicht behindert.
       HINWEIS: Wenn der rechte laterale Ventrikel kanüliert ist, bohren Sie auf der linken Hemisphäre und nach hinten relativ zum Ventrikel.
   19. Halten Sie den Bohrer in einem Winkel von ~75°-80° zum Schädel und bohren Sie langsam eine Vertiefung mit einer Tiefe von etwa der Hälfte der Schädeldicke. Verwenden Sie Kochsalzlösung auf einem Wattestäbchen, um Knochenstaub abzuwischen.
   20. Setzen Sie die Schraube vorsichtig ein, indem Sie sie mit einer Pinzette fest in der Vertiefung festhalten und mit dem Schraubendreher in den Schädel schrauben, um ein Brechen des Schädels zu vermeiden. Prüfen Sie nach jeder vollständigen Umdrehung, ob die Schraube fest sitzt.
   21. Vergewissern Sie sich, dass der Schädel flach ist. Positionieren Sie die Führungskanüle mit den beweglichen Armen des Rahmens so, dass sie den Schädel am Bregma berührt. Nullen Sie den DV (dorsal-ventral), der die Koordinaten der Z-Ebene darstellt, indem Sie die Taste auf dem Monitor zur Rahmensteuerung drücken.
   22. Heben Sie die Führungskanüle (22 G und 4 mm Länge) mit den beweglichen Armen des Rahmens an und bewegen Sie sie auf Lambda. Senken Sie es so ab, dass es die Oberfläche des Schädels berührt, und beachten Sie erneut das DV-Display.
       HINWEIS: Die Differenz zwischen DV bei Bregma und DV bei Lambda sollte weniger als 0,2 mm betragen. Stellen Sie bei Bedarf den Nasenkonus entsprechend ein, d.h. bewegen Sie den Kopf der Ratte je nach Bedarf nach oben oder unten und wiederholen Sie die Messungen.
   23. Bewegen Sie die Führungskanüle zurück, um das Bregma zu berühren, und stellen Sie alle drei Koordinaten wieder auf Null fest: DV, AP (anterior-posterior) und ML (medial-lateral), indem Sie die Tasten am Monitor drücken.
   24. Bewegen Sie die Führungskanüle auf die vorher festgelegten Koordinaten Ihrer Wahl.
       HINWEIS: Für die Kanülierung des rechten Seitenventrikels bei einer erwachsenen Ratte mit einem Gewicht von 300 bis 350 g wurden die folgenden Koordinaten verwendet: -0,7 mm AP, -1,4 mm ML und -4,00 mm DV (die gleiche Länge wie die Führungskanüle).
   25. Markieren Sie die endgültige Kanülenposition, indem Sie das Ende der Kanüle mit dem Markierungsstift einfärben und dann auf die Schädeloberfläche absenken, um die Position zu berühren und zu markieren.
   26. Bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 2,3 mm für die Führungskanüle 22 G, indem Sie den Bohrschaft in einer geraden vertikalen Position, d.h. in einem 90°-Winkel zum Schädel, halten. Achten Sie darauf, langsam und schrittweise tiefer in den Schädel vorzudringen, d.h. vermeiden Sie Bohrungen in das Hirngewebe.
       HINWEIS: Falls erforderlich, senken Sie die Kanüle mit dem beweglichen stereotaktischen Arm in das Loch ab, um zu testen, ob die Kanüle erfolgreich platziert werden kann oder ob weitere Bohrungen erforderlich sind.
   27. Sobald die Kanüle in das Gehirn abgesenkt wurde, heben Sie sie wieder an, tragen Sie vorsichtig Sekundenkleber auf die Unterseite des Kunststoffsockels der Kanüle auf und senken Sie die Kanüle mit dem beweglichen Arm des stereotaktischen Rahmens wieder in das Loch ab.
   28. Lassen Sie ihn an Ort und Stelle, damit der Kleber aushärten kann.
   29. Mischen Sie während des Wartens Zahnlösungsmittel und Pulver (siehe Materialtabelle) in einer Waage. Gießen Sie Zahnzementpulver in die Waage, verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um ~300 μl Lösungsmittel hinzuzufügen, und mischen Sie mit derselben Spritze, bis es eindickt und eine brauchbare Konsistenz hat. Fügen Sie bei Bedarf mehr Pulver hinzu, um die Viskosität zu erhöhen, oder mehr Lösungsmittel, um die Viskosität zu verringern.
   30. Lösen Sie die Kanüle mit der speziellen Schraube aus dem Kanülenhalter und heben Sie den Arm vorsichtig an.
       HINWEIS: Die Kanüle sollte in einem 90°-Winkel auf den Schädel geklebt werden.
   31. Tragen Sie den frischen Zahnzement auf den freiliegenden Schädel auf, indem Sie ihn in die 1-ml-Einwegspritze aufziehen und um die Kanüle herum auftragen. Vermeiden Sie Zahnzement auf der Haut oder die Kanülenöffnung. Lassen Sie es je nach Konsistenz einige Sekunden lang einwirken.
   32. Wenn der Zahnzement dicker wird, tragen Sie mit einem Spachtel mehr Zahnzement auf und formen Sie die endgültige Kopfhalterung, die die Schraube vollständig abdeckt.
       HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu viel von der Kanüle abzudecken, damit die Dummy-Kanüle noch angeschraubt werden kann. Entfernen Sie überschüssigen Zahnzement von der Haut.
   33. Setzen Sie eine sterile Dummy-Kanüle ein, sobald der Zahnzement trocken und fest ist.
   34. Schalten Sie das Isofluran aus, lösen Sie die Ohrbügel, nehmen Sie die Ratte aus dem Rahmen und legen Sie sie in die Aufwachbox.
   35. Sobald sich das Tier ~15-30 Minuten erholt hat, halten Sie es in einer sauberen Haltungsbox.
       HINWEIS: Nach der Operation müssen Ratten in Einzelställen untergebracht werden. Erwägen Sie, die Standard-Gitterkäfigoberteile, bei denen der Lebensmittelbehälter in den Käfig abgesenkt wird, durch spezielle hoch erhöhte Gitterkäfigoberseiten zu ersetzen, um das Risiko von Interferenzen mit der Kopfhalterung zu minimieren. Alternativ können Sie alle Teile des Käfigs absperren, die viel niedriger sind als die Aufzuchthöhe des Tieres.
   36. Füllen Sie die Überwachungscheckliste aus und überwachen Sie gemäß den im Protokoll beschriebenen Überwachungsrichtlinien.
       HINWEIS: Erwägen Sie, einige Lebensmittelpellets auf den Boden zu legen, um sie leichter erreichen zu können. Wenn es das Experiment nicht beeinträchtigt, kann zusätzliche Schmerzlinderung in süßer Nahrung bereitgestellt werden, um zusätzliche postoperative SC-Injektionen zu ersetzen, z. B. Buprenorphin gemischt mit süßer Nussschokoladenpaste 35,36,37. In diesem Fall wurde ein Teil der gleichen Süßigkeit als Belohnung vor und nach der Operation verabreicht, um eine Neophobie bei der Schmerzlinderung zu vermeiden. Die Mutterpaste kann auf Klebeband geliefert werden, das an der Käfigwand befestigt ist.
   37. Lagern Sie mehr Dummy-Kanülen als Führungskanülen oder Injektionskanülen, da diese bei versehentlichem Lösen in der Käfigeinstreu verloren gehen könnten. Ersetzen Sie in einem solchen Fall die Kanüle durch eine neue, sterile Dummy-Kanüle.

2. ICV-Injektionen

1. Bereiten Sie das Arzneimittel und das Vehikel vor, z. B. 30 mg/ml Polymyxin B (siehe Materialtabelle) in 0,9 % steriler Kochsalzlösung. Halten Sie das Injektionsvolumen bei erwachsenen Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 300 und 400 g zwischen 5 und 10 μl.
2. Mindestens 24 Stunden nach der Operation die Ratte wiegen und in den Operationssaal transportieren.
3. Berechnen Sie das Injektionsvolumen anhand des Körpergewichts der Ratte.
4. Entfernen Sie den Käfigdeckel und schrauben Sie die Dummy-Kanüle ab.
   HINWEIS: Ratten sitzen normalerweise still, wenn sie sanft in ihrem Käfig gehalten werden, und müssen nicht zurückgehalten werden. Ein Geschirrtuch kann für eine neugierige oder nervöse Ratte oder ein Kitzeln der Wangenknochen verwendet werden.
5. Für eine Bolusinjektion befestigen Sie einen PE-50-Schlauch (siehe Materialtabelle) von mindestens 40 cm Länge an einer gasdichten 10 μL-Mikrospritze, indem Sie ein Ende des Schlauchs über die feste oder abnehmbare Nadel an der Spritze ziehen und auf einen dichten Verschluss achten. Befestigen Sie die eingesetzte Injektorkanüle am anderen Ende des Schlauchs.
   1. Ziehen Sie die erforderliche Menge durch die Kanüle auf. Führen Sie die Kanüle bis zum Einsetzen in die Führung ein und injizieren Sie sie. Sobald die gesamte Flüssigkeit injiziert ist, halten Sie den Spritzenkolben mindestens eine weitere Minute lang an Ort und Stelle, um einen Rückfluss zu vermeiden.
6. Für eine langsamere Verabreichungsrate injizieren Sie die Medikamente mit einer Mikroinjektionspumpe (siehe Materialtabelle).
   1. Verwenden Sie zunächst gefiltertes Wasser und eine 1-ml-Einwegspritze mit einer 23-g-Aufziehnadel, um den PE-50-Schlauch vollständig zu füllen. Nehmen Sie dann die Einmalspritze von der Aufziehnadel und ersetzen Sie sie durch die Mikrospritze.
   2. Ziehen Sie 1-3 μl zurück, um eine kleine, aber sichtbare Luftblase zu erzeugen. Stellen Sie dann die erforderliche Menge an Medikamenten zusammen. Optional können Sie die Luftblase mit einem Marker markieren, um den Wirkstofffluss besser sichtbar zu machen. Verriegeln Sie die Spritze an der Pumpe.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das verwendete Medikament und die verwendete Ausrüstung korrekt eingestellt sind, d. h. stellen Sie die Verabreichungsgeschwindigkeit und den Innendurchmesser der verwendeten Spritze gemäß der Bedienungsanleitung ein.
7. Sobald die gesamte Flüssigkeit eingespritzt ist, stoppen Sie die Pumpe, wenn sie nicht automatisch stoppt. Lassen Sie die Nadel mindestens eine weitere Minute lang einstechen, um einen Rückfluss zu vermeiden.
8. Entfernen Sie langsam die Injektorkanüle und schrauben Sie die Führungskanüle auf.
9. Reinigen Sie das Gerät, indem Sie jeweils dreimal Ethanol und DI-Wasser aufsaugen und ausstoßen.

3. Liquor- und Gewebeprobenahme

1. Transportieren Sie die Ratte in einen Behandlungsraum.
2. Setzen Sie die Ratte in die Induktionskammer und leiten Sie eine Anästhesie mit 5% Isofluran in 2 L/min Sauerstoff ein, bis sich die Atmung verlangsamt hat (~ 5 min).
3. Bewegen Sie die Ratte in den stereotaktischen Rahmen und halten Sie das gleiche Maß an tiefer Anästhesie durch den Nasenkonus aufrecht.
4. Auf Pedalreflex prüfen. Wenn er nicht vorhanden ist, fixiere den Schädel mit den Ohrbügeln im Rahmen.
   HINWEIS: Dabei kann es sich um einen einfacheren stereotaktischen Rahmen ohne Display, abgerundete Ohrbügel oder bewegliche Bügel handeln. Hierbei handelt es sich um ein Nicht-Rückforderungsverfahren; Das einzige notwendige Merkmal sind eventuelle Rattenohrstangen.
5. Winkeln Sie die Nase der Ratte mit dem Nasenkonus um etwa 45° nach unten, um den Hals in eine gute Arbeitsposition zu bringen.
6. Fühlen Sie mit einer kleinen, stumpfen, gebogenen Schere den Schädel und bewegen Sie ihn nach hinten bis zum Ende des Schädels. An dieser Stelle schneidest du die äußerste Muskelschicht mitten durch die Mittellinie des Halses, etwa 2-3 cm lang. Schneide vorsichtig durch alle anderen Muskelschichten.
   1. Verwenden Sie einen kleinen Federaufroller, um die Wunde offen zu halten und eine gute Sicht zu ermöglichen. Schneiden, bis die Cisterna Magna Membran sichtbar ist. Verwende ein Wattestäbchen, um weitere Haut sanft zu entfernen.
7. Wenn Blutungen auftreten, verwenden Sie Gaze, um die Blutung zu reinigen und zu stoppen.
8. Verwenden Sie bei Bedarf kleine Streifen aus gerolltem Gewebe und legen Sie es um die Cisterna magna, um zu verhindern, dass Blut den Liquor kontaminiert.
   HINWEIS: Um den Erfolg der Injektion mit Farbstoff zu bestätigen, injizieren Sie der anästhesierten Ratte 2-3 μl 1,1 % Evans Blue Farbstoff (siehe Materialtabelle), bevor Sie Liquor mit der angepassten Kanüle und einer 1-ml-Einwegspritze sammeln.
9. Um das Werkzeug für die Extraktion von Liquor vorzubereiten, füllen Sie die Spritze mit ~500 μl gefiltertem Wasser, befestigen Sie eine 23 G Aufziehnadel und ziehen Sie einen Schlauch über die Nadel. Befestigen Sie eine gezogene Glaspipette am anderen Ende des Schlauchs.
10. Um Liquor zu extrahieren, führen Sie die gezogene Pipette langsam in die freiliegende Cisterna magna ein.
    HINWEIS: Der Liquor fließt langsam und passiv in die Pipette und wird mit der Spritze aktiv nach oben gezogen. Wenn der Farbstoff injiziert wird, wäre der Liquor blau gefärbt (Abbildung 1).
11. Geben Sie den Liquor in ein beschriftetes Röhrchen und legen Sie ihn sofort auf Trockeneis. Liquor kann dann bei -80 °C gelagert werden.
12. Entnehmen Sie jedes andere Gewebe, das für die Analyse von Interesse ist. Für Plasma entnehmen Sie mindestens 3 ml Herzblut.
    1. Legen Sie die tief betäubte Ratte auf den Rücken und öffnen Sie die Brusthöhle, um das Herz freizulegen. Verwenden Sie ein Hämostatikum, um den Brustkorb zu klemmen und ihn auf den Hals des Tieres zu legen, um die Sicht zu verbessern. Halten Sie den rechten Ventrikel mit einer Gewebezange mit Haken fest und führen Sie eine 5 mL Einmalspritze mit einer 18 G Nadel parallel zum Septum in den linken Ventrikel ein. Ziehen Sie langsam Blut in die Spritze ab. Sobald 3-5 ml Blut entnommen wurden, entfernen Sie die Nadel aus dem Herzen.
13. Nehmen Sie die Nadel aus der Spritze und legen Sie sie in einen scharfen Behälter. Das Blut in heparinisierte Röhrchen umfüllen und 15 Minuten lang bei 2.739 x g und 4 °C schleudern, bevor der Überstand mit einer 200-μl-Pipette entnommen und auf Trockeneis eingefroren wird.
14. Euthanasiere die Ratte, indem du das Herz mit einer Schere entfernst. Schalten Sie die Isofluranzufuhr aus.
15. Sammeln Sie alle anderen Bauchorgane, die Sie interessieren, wie z. B. die Niere oder die Milz. Identifizieren Sie das Organ, halten Sie das gewünschte Organ mit einer Gewebezange mit Haken fest, heben Sie es an und schneiden Sie alle Befestigungen ab. Legen Sie das Organ in ein beschriftetes Röhrchen und frieren Sie es auf Trockeneis ein.
16. Um das Gehirn zu entfernen, enthaupten Sie das Tier mit einer scharfen, großen Schere, indem Sie an der Schädelbasis schneiden. Ziehen Sie die Kopfhalterung von Hand ab. Schneide durch die restliche Haut, die den Schädel bedeckt.
17. Schneiden Sie mit einer Dissektorschere den Schädel an der Mittellinie von der Basis bis zum Lambda ab, d.h. schneiden Sie den supraoccipitalen Knochen in zwei Hälften. Greife mit einem Blutstiller eine Hälfte und zwirne sie weg. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite, um das Kleinhirn vollständig freizulegen.
18. Schneiden Sie entlang der sagittalen Naht bis zum Stirnbein. Verwenden Sie ein Hämostat, um jeden der Scheitelknochen zu entfernen. Schneiden Sie bei Bedarf den Stirnknochen weiter ab und entfernen Sie mehr Knochen, um die Riechkolben freizulegen.
19. Halten Sie den Kopf auf den Kopf und hebeln Sie das Gehirn vorsichtig mit einem Spatel weg und lösen Sie es von den Sehnerven und Trigeminusnerven, indem Sie sie mit dem Spatel durchtrennen. Sammeln Sie das Gehirn in einer Tube und frieren Sie es auf Trockeneis ein.
20. Die Hirnventrikel werden blau gefärbt, wenn der Farbstoff injiziert wird. Verwenden Sie eine Einwegklinge, um das Gehirn an der Injektionsstelle (Abbildung 2A, B) und ~1 cm posterior (Abbildung 2C) zu schneiden, um die Farbstoffverteilung in den Ventrikeln zu untersuchen.
21. Um das Rückenmark zu entfernen, legen Sie die Wirbelsäule frei, indem Sie die Haut entlang der Mittellinie der Rückenfläche der Ratte durchschneiden. Schneiden Sie die Wirbelsäule heraus, indem Sie einen beidseitigen Schnitt um sie herum machen und sie am kaudalen Ende des lumbalen Rückenmarks quer durchschneiden.
22. Schneiden Sie die Lamina mit einer Schere beidseitig entlang der Säule ein, bis das gesamte Rückenmark freiliegt. Heben Sie das Rückenmark an einem Ende, z. B. dem rostralen Ende, an und ziehen Sie es heraus, indem Sie die Spinalnerven in kaudaler Richtung spalten, bis alle Nerven durchtrennt sind. Sammeln Sie das Rückenmark in einer Röhre und frieren Sie es auf Trockeneis ein.
    HINWEIS: Wiegen Sie alle Röhrchen vor und nach der Organentnahme zur Datenanalyse. Falls notwendig und angemessen, kann das ventrikuläre System nach der Liquorentnahme und vor der Gehirnentnahme gewaschen werden, um Medikamentenreste in den ventrikulären Kompartimenten zu entfernen. Verwenden Sie eine mit Kochsalzlösung gefüllte 1-ml-Spritze, die am Schlauch befestigt ist, und eine Injektorkanüle und führen Sie sie in die Führungskanüle ein. Injizieren Sie 2-3 ml Kochsalzlösung. Die Kochsalzlösung sollte aus der Öffnung in der Cisterna magna austreten. Führungskanülen, Dummy-Kanülen und Schrauben können wiederverwendet werden, indem sie 24 Stunden lang in Aceton eingeweicht und anschließend mit medizinischem Reinigungsmittel und Wasser gereinigt werden. Nach dem Trocknen kann Zahnzementreste mit einer feinen Pinzette entfernt werden.

Ergebnisse

Das vorgestellte Operationsprotokoll ist sehr erfolgreich: Geschulte Chirurgen erreichten eine Überlebensrate von >99,8 % und die Tiere zeigten nach der Operation an Tag 1 ein stabiles Körpergewicht, verglichen mit ihrem Gewicht vor der Operation an Tag 0 (mittlere ± SD von 315,8 g ± 42,1 g für Tag 0 und 314,1 g ± 43,0 g für Tag 1, Abbildung 3).

Vor der Entnahme von Liquor kann eine Injektion von 1,1 % Evans Blue Farbstoff ...

Diskussion

Forscher und Kliniker setzen ICV-Injektionen ein, um den Schutzmechanismus der BHS zu umgehen und Medikamente direkt in das ZNS zu bringen 12,18,19,21,24. Die vorliegende Arbeit ist ein vollständiges ICV-Protokoll für die effiziente Verabreichung von Arzneimitteln in das ZNS und die Extraktion von Liquor für die pharmakokin...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Terumo, Japan	SS+01T
5 mL syringes	Terumo, Japan	SS+05S
Acetone	Merck, Germany	67641
Bench protector sheets	Halyard, USA	2765-C
Betadine	Mundipharma, Netherlands	1015695
Buprenorphine; Temgesic	Clifford Hallam Healthcare, Australia	1238366
Carprofen	Zoetis, Australia	10001132
Chlorhexidine	Tasman Chemicals, Australia	890401
Chux superwipes (or equivalent)	Chux, Australia	n/a	autoclaved
Clippers	n/a	n/a
Cotton swabs	LP Italiana, Italy	112191	autoclaved
Dental cement powder (Vertex Self cure powder)	Henry Schein, USA	VX-SC500GVD5
Dental cement solvent (Vertex Self cure liquid)	Henry Schein, USA	VX-SC250MLLQ
Disposable needles: 18 G, 26 G, 30 G	Terumo, Japan	NN+2525RL
Disposable surgical blades	Westlab, Australia	663-255
Dissector scissors	F.S.T.	14082-09
Dummy cannulas	Bio Scientific, Australia	C313DC/SPC	cut to 4.05 to fit the guide cannula
Ethanol 80%	Merck, Australia	10107
Evan's blue dye	Sigma	E2129 - 50G
Eye lube	Clifford Hallam Healthcare, Australia	2070491
Felt tip pen	Sharpie, USA	D-4236
Fibre optic light source	n/a	n/a
Flattened needle (18 G) or similar to apply superglue	n/a	n/a
Glass pipettes, pulled	Hirschmann Laborgeraete, Germany	9100175
Glass syringe 10 uL	Hamilton, USA	701 LT and 1701 LT
Guide cannulas	Bio Scientific, Australia	C313G/SPC	22 G, cut 4 mm below the pedestal for lateral ventricle cannulation in adult Sprague Dawley rats
Haemostat
Heat bead steriliser	Inotech, Switzerland	IS-250
Heat pad	n/a	n/a
Hydrogen peroxide 3%	Perrigo, Australia	11383
Induction chamber (Perspex 300 mm x 200 mm)	n/a	n/a
Injector cannula	Bio Scientific, Australia	C313I/SPC	cut to fit the 4 mm cannula + 0.5 mm projection
Isoflurane	Clifford Hallam Healthcare, Australia	2093803
Isoflurane vaporiser and appropriate scavenging system	n/a	n/a
Medium size weighing boats	n/a	n/a
Metal spatula	Met-App, Australia	n/a
Micro syringe pump	New Era, USA	NE-300
Microdrill	RWD Life Science Co, China	87001
Polymyxin B	Beta Pharma, China	86-40302
Protein LoBind tubes, 0.5 mL	Eppendorf, Germany	Z666491
Ropivacaine 1%; Naropin	AstraZeneca, UK	PS09634
Scissors, large	F.S.T.	14511-15
Scissors, small	F.S.T.	14079-10
Screwdriver	n/a	n/a
Screws	Mr. Specs, Australia	n/a
Stereotaxic frame	RWD Life Science Co, China	n/a	Necessary components: rat ear bars, tooth bar, anaesthesia nose cone, arm with digital readout (X, Y, Z) and cannula holder
Sterile saline 0.9%	Baxter, USA	AHB1323
Super etch (37% phosphoric acid) gel	SDI Limited, Australia	8100045
Superglue	UHU, Germany	n/a
Tissue forceps with hooks	F.S.T.	11027-12
Tubing, PE-50	Bio Scientific, Australia	C313CT