用于药代动力学和药效学研究的脑室内药物输送和取样

摘要

将治疗药物直接输送到中枢神经系统是绕过血脑屏障的一种方法。本方案展示了脑室内注射用于随后收集脑脊液和身体器官。这有助于在动物模型中研究药物药代动力学和药效学，以开发新的治疗方法。

摘要

尽管血脑屏障 （BBB） 保护大脑免受外来物质的侵害，但它也会阻止一些疗法进入中枢神经系统 （CNS） 以改善疾病或感染。药物直接注射到动物和人类的 CNS 中以规避 BBB。本方案描述了一种通过脑室内输送抗生素治疗脑感染的独特方法，即多粘菌素，这是治疗多重耐药革兰氏阴性菌的最后一线抗生素。开发了一种简单的立体定位手术方案，用于植入大鼠侧脑室的引导套管。恢复期 24 小时后，可以通过安装在导向器上的套管有意识地反复注射大鼠。可以使用微量注射泵以推注或输注的形式手动进行注射，以获得缓慢且受控的流速。用 Evans Blue 染料成功证实脑室内注射。脑脊液 （CSF） 可以引流，并且可以收集大脑和其他器官。这种方法非常适合涉及药物递送至 CNS 以及随后评估药代动力学和药效学活性的研究。

引言

血脑屏障 （BBB） 是中枢神经系统 （CNS） 的重要保护机制。选择性渗透的解剖屏障将循环血液及其溶质与大脑的细胞外液分开，从而阻止大多数分子进入大脑 1,2,3,4，具体取决于它们的大小、亲脂性 5 和主动运输机制的可用性 2。

这种保护屏障有利于有效调节复杂的大脑稳态和 CNS 健康 ^4,6。然而，它也使得难以输送治疗大脑感染或其他中枢神经系统疾病的药物 ^4,7。除了使用多种方法破坏 BBB ^8,9 外，规避 BBB 的主要方法是通过将药物释放到脑脊液 （CSF） 中来将药物直接输送到大脑中⁴。尽管这是一种相对侵入性的做法，但它已成功用于为患者和实验动物提供靶向治疗。在人类中，药物可以输送到脑室内系统或 CSF，然后使用 Ommaya 储液器进行采样，Ommaya 储液器是位于头皮下的储液器，连接到插入侧脑室的导管^{上 10,11}。类似的技术已经在啮齿动物等实验动物中建立，以实现等效目标。将微渗透泵植入小鼠^{12、13、14、15} 和大鼠^16、17 体内，用于将药物连续输送到心室系统或脑实质中。此外，使用一次性针头对麻醉小鼠^18,19 和清醒大鼠通过手术植入的套管 20,21,22,23 进行脑室内直接注射。将药物输送到 CNS 是增强对各个领域理解的宝贵方法 20,24,25,26,27,28。

CNS 感染就是这样一个迫切需要新疗法和加强对现有抗感染疗法的理解的领域。由多重耐药革兰氏阴性菌引起的 CNS 感染尤其令人担忧⁷.多粘菌素是越来越多地用于治疗这些“超级细菌”引起的感染的最后一线抗生素²⁹。当按照当前的剂量指南³⁰ 静脉内给药多粘菌素时，它们对 CNS 的渗透性非常低，而较高的剂量会增加肾毒性的风险。因此，静脉注射多粘菌素疗法对治疗 CNS 感染几乎没有用^{处 7}。建立安全有效的多粘菌素输送到 CNS 的剂量方案是一项紧迫的未满足的医疗需求 31,32,33。因此，建立了本方案，并描述了将抗生素直接注射到大鼠的脑脊液中。然而，它可用于施用任何无神经毒性的药物，并且治疗浓度可以小体积给药（例如，大鼠高达 10 μL）。所描述的技术也可以进行修改，以针对不同的大脑区域并提供多次注射。

本方案提出了一种简单的手术和注射技术，可实现有效的药代动力学和药物 ICV 给药后的分布。手术包括植入导流套管。由于与植入微渗透泵 12,13,14,15,16,17 相比，这是一种侵入性更小的手术，因此这是一种适用于短期将药物施入 CSF 的高级选择。该方案经过简化，可以在术后 24 小时产生非常高的存活率和稳定的体重，与现有方法相比，这是一个改进³⁴。手术后，清醒的大鼠接受手动推注 ICV 注射或使用微泵缓慢输送以降低峰值血浆浓度。同时，他们可以在笼子里自由活动。为了建立安全有效的药物给药方案，然后使用 CSF 、脑、脊髓、肾脏、血浆等样本研究脑室内 （ICV） 给药后的药代动力学和药物分布。也可以目视研究药物分布，例如，使用免疫组织化学或基质辅助激光解吸/电离质谱成像 （MALDI-MSI）。如有必要，可以植入双侧套管，例如，注射药物，否则这些药物会单侧分布到两个半球。

研究方案

所有实验均按照澳大利亚科学目的照顾和使用动物的法规进行。 实验已获得墨尔本大学伦理委员会的批准（申请 #1914890）。使用 8-14 周龄雄性和雌性 Sprague-Dawley 大鼠进行实验。

1. 侧脑室插管的立体定位手术

1. 手术过程中使用高压灭菌的棉签和手术单。
2. 为手术设置以下内容。
   1. 设置立体定位框架、麻醉输送系统、药物、化学品和辅助材料（见材料表）。 用 80% 乙醇清洁立体定位架、光纤光源、手持电钻等。
   2. 将 22 G 导向套管和相关的虚拟套管（参见 材料表）浸泡在 80% 乙醇中进行消毒。
      注意：制造商将 22 G 导轨和虚拟套管预先切割成基座下方 ~4 毫米的长度。
   3. 使用热珠灭菌器对手术器械消毒 20 秒（参见 材料表），然后喷洒 80% 乙醇。将消毒的器械放在无菌窗帘上。
   4. 准备一个回收箱（一个衬有底垫的老鼠笼），将一半的箱子放在加热垫上。
3. 进行手术。
   1. 将乙醇清洁的 22 G 导向套管拧入立体定位框架上的套管支架中。
   2. 将大鼠放入诱导室（300 mm x 200 mm，参见 材料表）中，并在 1 L/min 氧气下用 5% 异氟醚诱导麻醉。
   3. 一旦大鼠被深度麻醉（无踏板反射），将大鼠移至立体定位框架，并在 1 L/min 的氧气中将异氟醚减少至 2%-3%，以通过鼻锥维持。将牙齿钩在咬杆上，小心地将鼻锥拉到鼻子上 - 轻轻地向后拉老鼠以检查它是否牢固。
   4. 在双眼上涂抹保护性眼部润滑剂，以避免干燥。
   5. 在生理盐水中注射卡洛芬 （5 mg/kg）、丁丙诺啡 （0.05 mg/kg） 和 3 mL 生理盐水皮下 （s.c.） 用于疼痛管理和帮助术后恢复。
   6. 捏住脚趾以检查踏板反射。一旦不存在，就将大鼠的头骨固定在框架中。将一根耳杆放入耳道并拧紧。在另一侧重复。
   7. 横向移动耳栏，确保耳栏上给出的数字在两侧相等。向下按压颅骨时，头部不应移动。
   8. 用剪刀剃掉头顶。用纸巾和生理盐水擦去头发。如有必要，在双眼上重新涂抹眼部润滑剂，以避免干燥。
   9. 用 4% 洗必泰和酒精皮肤制备溶液擦拭头皮，每个步骤都使用无菌棉签（见 材料表）。从颅骨中心开始，向外转圈移动，直到所有表面都被清洁干净。
   10. 沿预定的切口部位注射 ~150 μL 罗哌卡因 （1%） 皮下注射（参见 材料表）。
   11. 使用手术刀刀片沿头部中线从眼睛之间到颅底切开 10-15 毫米的切口。
   12. 使用棉签和手术刀刮掉结缔组织并露出头骨。
   13. 将无菌棉签浸入 3% 的过氧化氢溶液中，然后将其涂抹在颅骨表面。等待 5 秒，让化学物质与皮肤发生反应，然后用干燥的棉签清洁该区域。
   14. 第二次涂抹 3% 过氧化氢。这将使颅骨的缝合线看起来更清晰。等待 10 秒，让化学物质与皮肤发生反应，然后用干燥的棉签清洁该区域。用生理盐水清洗，然后用干净的棉签晾干。
   15. 小心地将少量 Super etch 凝胶涂抹在棉签上，然后将其涂抹在颅骨表面。这为牙科粘接剂创造了一个多孔的表面。
   16. 在头骨上涂抹大量盐水以洗掉超级蚀刻剂，然后用干净的棉签擦干。
   17. 识别前囟并使用毡尖笔标记它。
   18. 在不会阻碍导向套管放置的位置为地脚螺钉钻一个凹痕。
       注意：如果右侧心室是插管的，请在左半球和相对于心室的后方钻孔。
   19. 将钻头与颅骨成 ~75°-80° 角，然后慢慢钻一个深度约为颅骨厚度一半的凹痕。在棉签上使用生理盐水擦去骨灰。
   20. 用镊子将螺钉牢牢地固定在凹口中，然后用螺丝刀将其拧入颅骨，避免颅骨破裂，从而小心插入螺钉。每转一整圈后，测试螺丝是否紧固。
   21. 确认颅骨是平的。使用框架的移动臂，将导向套管定位于前堟处的颅骨。通过按下帧控制监视器上的按钮，将表示 Z 平面坐标的 DV（背腹）归零。
   22. 使用框架的移动臂抬起导向套管（22 G 和 4 mm 长），并将其移动到 lambda。降低它，使其接触颅骨表面，并再次注意 DV 显示。
       注意：前囟处的 DV 和 lambda 处的 DV 之间的差异应小于 0.2 毫米。如有必要，相应地调整鼻锥，即根据需要向上或向下移动大鼠的头部，然后重复测量。
   23. 将导套管向后移动以接触前囟，并通过按下显示器上的按钮将所有三个坐标重新归零：DV、AP（前后）和 ML（内侧）。
   24. 将导向套管移动到预先确定的所选坐标。
       注：对于 300-350 g 成年大鼠的右侧心室插管，使用以下坐标：-0.7 mm AP、-1.4 mm ML 和 -4.00 mm DV（与导向套管长度相同）。
   25. 通过使用记号笔为套管的末端着色，然后将其降低到颅骨表面以触摸和标记位置，从而标记最终的套管位置。
   26. 通过将钻杆保持在笔直的垂直位置，即与双桨成 90° 角，为 22 G 导向套管钻一个直径为 22 毫米的孔。小心缓慢而渐进地深入颅骨，即避免钻入脑组织。
       注意： 如有必要，使用移动立体定位臂将套管放入孔中，以测试是否可以成功放置套管或是否需要进一步钻孔。
   27. 一旦套管被放入大脑中，将其抬起，小心地将强力胶涂抹在套管塑料基座的下侧，然后使用立体定位框架的移动臂将套管放回孔中。
   28. 留在原位让胶水凝固。
   29. 等待时，将牙科溶剂和粉末（参见 材料表）在称重舟中混合。将牙科水泥粉倒入称量舟中，使用 1 mL 注射器添加 ~300 μL 溶剂，并使用相同的注射器混合，直到其变稠并具有可用的稠度。如有必要，添加更多粉末以增加粘度或添加更多溶剂以降低粘度。
   30. 使用专用螺钉从套管支架上松开套管，然后小心地提起臂。
       注意：套管应以 90° 角粘在颅骨上。
   31. 将新鲜的牙科粘结剂涂抹在裸露的颅骨上，将其吸入一次性 1 mL 注射器中，然后涂抹在套管周围。避免在皮肤或套管开口上涂抹任何牙科粘接剂。让它凝固几秒钟，具体取决于其稠度。
   32. 当牙科粘接剂变厚时，用抹刀涂抹更多的牙科粘接剂，并形成完全覆盖螺钉的最终头部支架。
       注意： 小心不要覆盖太多的套管，这样假套管仍然可以拧上。去除皮肤上多余的牙科粘固剂。
   33. 一旦牙科粘固剂干燥和坚硬，就插入一个无菌的假套管。
   34. 关闭异氟醚，松开耳杆，将大鼠从框架中取出，放入恢复箱中。
   35. 一旦动物恢复 ~15-30 分钟，将其放在干净的笼子里。
       注意：手术后，大鼠需要单舍。考虑将食物料斗下降到笼中的标准网格笼顶部替换为专用的高架网格笼顶部，以最大限度地降低干扰头部支架的风险。或者，堵住笼子中远低于动物饲养高度的任何部分。
   36. 填写监测清单，并按照协议中概述的监测指南进行监测。
       注意：考虑在地板上放置一些食物颗粒，以便于拿到。如果它不干扰实验，可以在甜食中提供额外的疼痛缓解，以替代额外的术后皮下注射，例如，丁丙诺啡与甜坚果巧克力酱 35,36,37 的混合物。在这种情况下，在手术前后提供一些相同的甜食作为奖励，以避免在缓解疼痛时出现食物恐惧症。螺母糊可以通过贴在保持架壁上的胶带提供。
   37. 储备更多的假插管比引导插管或注射插管，因为如果它们不小心脱落，它们可能会迷失在动物笼子的垫料中。如果发生此类事件，请用新的无菌假插管替换套管。

2. ICV 注射剂

1. 在 0.9% 无菌盐水中制备药物和载体，例如 30 mg/mL 多粘菌素 B（参见 材料表）。对于体重在 5-10 g 之间的成年大鼠，将注射量保持在 300-400 μL 之间。
2. 在手术后至少 24 小时，称量大鼠并将其运送到手术室。
3. 使用大鼠体重计算注射体积。
4. 取下笼盖并拧下假套管。
   注意：老鼠在轻轻地将老鼠放在笼子里时通常会坐着不动，不需要约束。茶巾可用于好奇或紧张的老鼠或颧骨的挠痒痒。
5. 对于推注注射，通过将管子的一端拉到注射器上的固定或可拆卸针头上，确保紧密密封，将至少 40 cm 长的 PE-50 管（参见 材料表）连接到 10 μL 气密微量注射器上。将已安装的注射器套管连接到管道的另一端。
   1. 通过套管吸取所需的量。将套管插入导板直至安装并注射。注入所有液体后，将注射器柱塞保持在原位至少一分钟，以避免回流。
6. 对于较慢的输送速度，请使用显微注射泵注射药物（见 材料表）。
   1. 首先，使用过滤水和带有 1 G 抽吸针的一次性 23 mL 注射器将 PE-50 管完全填充。然后从抽吸针头上取下一次性注射器，并用微型注射器更换。
   2. 回吸 1-3 μL 以产生一个小但可见的气泡。然后，提取所需数量的药物。（可选）用记号笔标记气泡，以帮助观察药物流向。将注射器锁定在泵上。
      注意：确保所用药物和设备的正确设置，即根据用户手册设置所用注射器的输送速度和内径。
7. 注入所有液体后，如果泵没有自动停止，请停止泵。将针头插入至少一分钟，以避免回流。
8. 慢慢取下注射器套管并拧上导向套管。
9. 通过抽出和喷射乙醇和去离子水各 3 次来清洁设备。

3. 脑脊液和组织取样

1. 将大鼠运送到手术室。
2. 将大鼠置于诱导室中，用 5% 异氟醚在 2 L/min 氧气中诱导麻醉，直到呼吸减慢（~ 5 分钟）。
3. 将大鼠移至立体定位框架，并通过鼻锥保持相同水平的深度麻醉。
4. 检查踏板反射。一旦缺席，使用耳杆将头骨固定在框架中。
   注意：这可以是更简单的立体定位框架，没有显示器、圆形耳杆或可移动臂。这是一个非恢复程序;唯一必要的功能是任何老鼠耳条。
5. 使用鼻锥，将大鼠的鼻子向下倾斜约 45°，以使脖子处于良好的工作位置。
6. 使用小而钝的弯曲剪刀，感觉颅骨并向后移动到颅骨的末端。在这个位置，通过颈部中线切开最外层的肌肉层，长约 2-3 厘米。小心切开所有其他肌肉层。
   1. 使用小弹簧牵开器保持伤口张开，并提供良好的可见度。切割直到可以看到大池膜。使用棉签帮助轻轻去除更多皮肤。
7. 如果发生出血，请使用纱布清洁和止血。
8. 如有必要，使用小条卷起的组织并将其放在大池周围，以避免任何血液污染 CSF。
   注意：为了确认使用染料注射成功，在使用合适的套管和一次性 1 mL 注射器收集 CSF 之前，将 2-3 μL 1.1% 伊文思蓝染料（参见 材料表）注射到麻醉大鼠中。
9. 要准备提取 CSF 的工具，请在注射器中加入 ~500 μL 过滤水，连接 23 G 抽吸针头并将管子拉到针头上。将拉出的玻璃移液器连接到管路的另一端。
10. 要提取 CSF，请将拉出的移液管慢慢插入裸露的大水箱中。
    注意：CSF 将缓慢被动地流入移液器，并使用注射器主动吸取。如果注射染料，CSF 将呈蓝色（图 1）。
11. 将 CSF 加入贴有标签的试管中，并立即将其放在干冰上。然后可以将CSF储存在-80°C。
12. 收集任何其他感兴趣的组织进行分析。对于血浆，至少收集 3 mL 心脏血液。
    1. 将深度麻醉的大鼠仰卧，打开胸腔，露出心脏。使用止血钳夹住胸腔并将其放在动物的喉咙上，以提高可见度。使用带钩的组织镊子固定右心室，然后将带有 5 G 针头的 18 mL 一次性注射器平行插入左心室。慢慢将血液抽入注射器中。采集 3-5 mL 血液后，从心脏中取出针头。
13. 从注射器中取出针头并将其放入锋利的容器中。将血液转移到肝素化管中，在 2,739 x g 和 4°C 下旋转 15 分钟，然后用 200 μL 移液器收集上清液并在干冰上快速冷冻。
14. 用剪刀去除心脏，对大鼠实施安乐死。关闭异氟醚供应。
15. 收集任何其他感兴趣的腹部器官，例如肾脏或脾脏。识别器官，用带钩的组织镊子夹住感兴趣的器官，提起它并剪断任何附件。将器官放入标记的试管中，并在干冰上快速冷冻。
16. 要取出大脑，用一把锋利的大剪刀在头骨底部剪开，将动物斩首。用手拉下头戴式支架。切开覆盖颅骨的剩余皮肤。
17. 使用解剖剪刀，从基部到 lambda 的中线处切开颅骨，即将枕骨上骨切成两半。用止血钳抓住一半并将其撬开。在另一侧重复以完全暴露小脑。
18. 继续沿矢状缝合线切割至额骨。使用止血钳去除每个壁骨。如果需要，进一步切开额骨并去除更多骨头以露出嗅球。
19. 将头部倒置，用刮刀小心地撬开大脑，用刮刀将其与视神经和三叉神经分离。将大脑收集到一个管中，并在干冰上快速冷冻。
20. 如果注射染料，脑室会染成蓝色。使用一次性刀片在注射部位（图 2A、B）和后 ~1 厘米（图 2C）切割大脑，以研究心室中的染料分布。
21. 要去除脊髓，请沿大鼠背侧中线切开皮肤，露出脊柱。通过在脊椎周围做一个双侧切口并在腰椎脊髓的尾端横向切开脊椎来切除脊椎动物柱。
22. 用剪刀沿柱子双侧剪断椎板，直到整个脊髓暴露出来。从一端（例如，喙端）提起脊髓，并通过沿尾部方向劈开脊神经来提取脊髓，直到所有神经都被切断。将脊髓收集到一个管中，并在干冰上快速冷冻。
    注意：在器官收集前后称量所有试管以进行数据分析。如有必要和适当，可以在 CSF 收集后和脑收集之前清洗心室系统，以清除心室中残留的药物。使用连接到管道和注射器套管的装满盐水的 1 mL 注射器，将其插入引导套管中。注射 2-3 mL 生理盐水。盐水应从大蓄水池的开口流出。引导套管、假套管和螺钉可以通过将它们浸泡在丙酮中 24 小时来重复使用，然后浸泡并用医用清洁剂和水清洁。干燥后，可以使用细镊子去除残留的牙科粘结剂。

结果

提出的手术方案非常成功，训练有素的外科医生存活率达到 >99.8%，与第 0 天的手术前体重相比，动物在第 1 天表现出稳定的体重（平均 ± SD 为 315.8 g± 42.1 g，第 1 天 314.1 g± 43.0 g， 图 3）。

在收集 CSF 之前，将 1.1% 伊文思蓝染料注射到植入的套管中可以帮助确认注射剂已输送到预定位置。收集的 CSF 将是蓝色的（...

讨论

研究人员和临床医生使用 ICV 注射来规避 BBB 的保护机制，并将药物直接输送到 CNS 12,18,19,21,24。目前的工作是一个完整的 ICV 方案，用于将药物有效地输送到 CNS 并提取 CSF 进行药代动力学分析。在实验开始时，当在实验室中建立该方案时，可以通过?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Terumo, Japan	SS+01T
5 mL syringes	Terumo, Japan	SS+05S
Acetone	Merck, Germany	67641
Bench protector sheets	Halyard, USA	2765-C
Betadine	Mundipharma, Netherlands	1015695
Buprenorphine; Temgesic	Clifford Hallam Healthcare, Australia	1238366
Carprofen	Zoetis, Australia	10001132
Chlorhexidine	Tasman Chemicals, Australia	890401
Chux superwipes (or equivalent)	Chux, Australia	n/a	autoclaved
Clippers	n/a	n/a
Cotton swabs	LP Italiana, Italy	112191	autoclaved
Dental cement powder (Vertex Self cure powder)	Henry Schein, USA	VX-SC500GVD5
Dental cement solvent (Vertex Self cure liquid)	Henry Schein, USA	VX-SC250MLLQ
Disposable needles: 18 G, 26 G, 30 G	Terumo, Japan	NN+2525RL
Disposable surgical blades	Westlab, Australia	663-255
Dissector scissors	F.S.T.	14082-09
Dummy cannulas	Bio Scientific, Australia	C313DC/SPC	cut to 4.05 to fit the guide cannula
Ethanol 80%	Merck, Australia	10107
Evan's blue dye	Sigma	E2129 - 50G
Eye lube	Clifford Hallam Healthcare, Australia	2070491
Felt tip pen	Sharpie, USA	D-4236
Fibre optic light source	n/a	n/a
Flattened needle (18 G) or similar to apply superglue	n/a	n/a
Glass pipettes, pulled	Hirschmann Laborgeraete, Germany	9100175
Glass syringe 10 uL	Hamilton, USA	701 LT and 1701 LT
Guide cannulas	Bio Scientific, Australia	C313G/SPC	22 G, cut 4 mm below the pedestal for lateral ventricle cannulation in adult Sprague Dawley rats
Haemostat
Heat bead steriliser	Inotech, Switzerland	IS-250
Heat pad	n/a	n/a
Hydrogen peroxide 3%	Perrigo, Australia	11383
Induction chamber (Perspex 300 mm x 200 mm)	n/a	n/a
Injector cannula	Bio Scientific, Australia	C313I/SPC	cut to fit the 4 mm cannula + 0.5 mm projection
Isoflurane	Clifford Hallam Healthcare, Australia	2093803
Isoflurane vaporiser and appropriate scavenging system	n/a	n/a
Medium size weighing boats	n/a	n/a
Metal spatula	Met-App, Australia	n/a
Micro syringe pump	New Era, USA	NE-300
Microdrill	RWD Life Science Co, China	87001
Polymyxin B	Beta Pharma, China	86-40302
Protein LoBind tubes, 0.5 mL	Eppendorf, Germany	Z666491
Ropivacaine 1%; Naropin	AstraZeneca, UK	PS09634
Scissors, large	F.S.T.	14511-15
Scissors, small	F.S.T.	14079-10
Screwdriver	n/a	n/a
Screws	Mr. Specs, Australia	n/a
Stereotaxic frame	RWD Life Science Co, China	n/a	Necessary components: rat ear bars, tooth bar, anaesthesia nose cone, arm with digital readout (X, Y, Z) and cannula holder
Sterile saline 0.9%	Baxter, USA	AHB1323
Super etch (37% phosphoric acid) gel	SDI Limited, Australia	8100045
Superglue	UHU, Germany	n/a
Tissue forceps with hooks	F.S.T.	11027-12
Tubing, PE-50	Bio Scientific, Australia	C313CT