Somministrazione e campionamento intraventricolare di farmaci per studi di farmacocinetica e farmacodinamica

Riepilogo

La somministrazione di terapie direttamente nel sistema nervoso centrale è un modo per aggirare la barriera emato-encefalica. Il presente protocollo dimostra l'iniezione intracerebroventricolare per la successiva raccolta del liquido cerebrospinale e degli organi corporei. Ciò facilita lo studio della farmacocinetica e della farmacodinamica dei farmaci in modelli animali per lo sviluppo di nuovi trattamenti.

Abstract

Sebbene la barriera emato-encefalica (BEE) protegga il cervello da entità estranee, impedisce anche ad alcune terapie di attraversare il sistema nervoso centrale (SNC) per migliorare malattie o infezioni. I farmaci vengono somministrati direttamente nel SNC negli animali e nell'uomo per aggirare la BEE. Il presente protocollo descrive un modo unico di trattare le infezioni cerebrali attraverso la somministrazione intraventricolare di antibiotici, cioè le polimixine, gli antibiotici di ultima linea per il trattamento dei batteri Gram-negativi multi-resistenti ai farmaci. È stato sviluppato un semplice protocollo di chirurgia stereotassica per impiantare una cannula guida che raggiunge il ventricolo laterale nei ratti. Dopo un periodo di recupero di 24 ore, i ratti possono essere iniettati consapevolmente e ripetutamente attraverso una cannula montata sulla guida. Le iniezioni possono essere erogate manualmente in bolo o in infusione utilizzando una pompa di microiniezione per ottenere una portata lenta e controllata. L'iniezione intraventricolare è stata confermata con successo con il colorante Evans Blue. Il liquido cerebrospinale (CSF) può essere drenato e il cervello e altri organi possono essere raccolti. Questo approccio è molto adatto per gli studi che prevedono la somministrazione di farmaci al SNC e la successiva valutazione dell'attività farmacocinetica e farmacodinamica.

Introduzione

La barriera emato-encefalica (BEE) è un meccanismo protettivo cruciale per il sistema nervoso centrale (SNC). La barriera anatomica selettivamente permeabile separa il sangue circolante e i suoi soluti dal fluido extracellulare del cervello, impedendo così alla maggior parte delle molecole di entrare nel cervello 1,2,3,4, a seconda delle loro dimensioni, lipofilia 5 e disponibilità di un meccanismo di trasporto attivo 2.

Questa barriera protettiva è utile per l'efficace regolazione dell'intricata omeostasi cerebrale e della salute del SNC ^4,6. Tuttavia, rende anche difficile la somministrazione di farmaci per il trattamento delle infezioni cerebrali o di altre malattie del SNC ^4,7. Oltre a interrompere la BBB utilizzando una varietà^{di metodi8,9}, l'approccio principale per aggirare la BBB consiste nel somministrare un farmaco direttamente nel cervello rilasciandolo nel liquido cerebrospinale (CSF)⁴. Anche se si tratta di una pratica relativamente invasiva, è stata utilizzata con successo per fornire terapie mirate a pazienti e animali da laboratorio. Nell'uomo, i farmaci possono essere somministrati nel sistema intraventricolare o nel liquido cerebrospinale e successivamente campionati utilizzando il serbatoio Ommaya, un serbatoio che risiede sotto il cuoio capelluto, collegato a un catetere inserito nel ventricolo laterale^10,11. Tecniche simili sono state stabilite negli animali da laboratorio come i roditori per raggiungere obiettivi equivalenti. Le pompe micro-osmotiche sono state impiantate nei topi 12,13,14,15 e nei ratti ^16,17 per la somministrazione continua di farmaci nel sistema ventricolare o nel parenchima cerebrale. Inoltre, sono state condotte iniezioni intracerebroventricolari dirette in topi anestetizzati utilizzando un ago monouso^18,19 e in ratti coscienti tramite una cannula impiantata chirurgicamente 20,21,22,23. La somministrazione di farmaci al SNC è stata un metodo inestimabile per migliorare la comprensione in vari campi 20,24,25,26,27,28.

Le infezioni del SNC sono uno di questi campi che ha urgente bisogno di nuove terapie e di una migliore comprensione delle terapie antinfettive esistenti. Le infezioni del SNC causate da batteri Gram-negativi multiresistenti sono particolarmente preoccupanti⁷. Le polimixine sono gli antibiotici di ultima linea sempre più utilizzati per trattare le infezioni dovute a questi "superbatteri"²⁹. Quando le polimixine vengono somministrate per via endovenosa secondo le attuali linee guida sul dosaggio³⁰, la loro penetrazione nel SNC è molto bassa, mentre dosi più elevate aumentano il rischio di nefrotossicità. Pertanto, la terapia con polimixina per via endovenosa è di scarsa utilità per trattare le infezioni del SNC⁷. Stabilire un regime posologico sicuro ed efficace per la somministrazione di polimixine al SNC è un'urgente esigenza medica insoddisfatta 31,32,33. Pertanto, il presente protocollo è stato stabilito ed è descritto con particolare attenzione all'iniezione di antibiotici direttamente nel liquido cerebrospinale dei ratti. Può, tuttavia, essere utilizzato per somministrare qualsiasi farmaco che non sia neurotossico e in cui le concentrazioni terapeutiche possono essere somministrate in piccoli volumi (ad esempio, fino a 10 μL nei ratti). Le tecniche descritte possono anche essere modificate per colpire diverse regioni del cervello e fornire più iniezioni.

Il presente protocollo presenta una semplice tecnica chirurgica e iniettiva che consente un'efficiente farmacocinetica e distribuzione post-somministrazione di farmaci ICV. L'intervento prevede l'impianto di una cannula guida. Poiché si tratta di una procedura meno invasiva rispetto all'impianto di una pompa micro-osmotica 12,13,14,15,16,17, questa è un'opzione avanzata adatta per la somministrazione a breve termine di farmaci nel liquido cerebrospinale. Questo protocollo è semplificato e può produrre tassi di sopravvivenza molto elevati e pesi corporei stabili 24 ore dopo l'intervento, il che rappresenta un miglioramento rispetto ai metodi esistenti³⁴. Dopo l'intervento chirurgico, i ratti coscienti hanno ricevuto un'iniezione manuale di ICV in bolo o un'erogazione più lenta utilizzando una micropompa per abbassare le concentrazioni plasmatiche di picco. Allo stesso tempo, potevano muoversi liberamente nella loro gabbia. Per stabilire regimi di dosaggio dei farmaci sicuri ed efficaci, sono stati quindi utilizzati campioni di liquido cerebrospinale, cervello, midollo spinale, rene, plasma, ecc. per studiare la farmacocinetica e la distribuzione dei farmaci dopo somministrazione intracerebroventricolare (ICV). La distribuzione dei farmaci può anche essere studiata visivamente, ad esempio utilizzando l'immunoistochimica o la spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-MSI). Se necessario, può essere impiantata una cannula bilaterale, ad esempio per iniettare farmaci che altrimenti si distribuirebbero unilateralmente in entrambi gli emisferi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti seguendo il codice australiano per la cura e l'uso degli animali per scopi scientifici. Gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di Melbourne (domanda #1914890). Per gli esperimenti sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley maschi e femmine di 8-14 settimane.

1. Chirurgia stereotassica per incannulamento del ventricolo laterale

1. Utilizzare punte di cotone autoclavate e teli chirurgici durante l'intervento.
2. Impostare quanto segue per l'intervento.
   1. Impostare il telaio stereotassico, il sistema di somministrazione dell'anestesia, i farmaci, i prodotti chimici e i materiali di assistenza (vedi Tabella dei materiali). Pulire il telaio stereotassico, la sorgente luminosa in fibra ottica, il trapano portatile, ecc., con l'80% di etanolo.
   2. Immergere la cannula guida da 22 G e la cannula fittizia associata (vedere la Tabella dei materiali) in etanolo all'80% per la sterilizzazione.
      NOTA: Il produttore ha pretagliato la guida da 22 G e la cannula cieca a una lunghezza di ~4 mm sotto il piedistallo.
   3. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (vedi Tabella dei materiali) utilizzando lo sterilizzatore a microsfere termiche per 20 s e quindi spruzzare con etanolo all'80%. Posizionare gli strumenti sterilizzati sul telo sterile.
   4. Prepara una scatola di recupero (una scatola di stabulazione per ratti rivestita con un sottopad) con metà della scatola posizionata sopra un termoforo.
3. Eseguire l'intervento chirurgico.
   1. Avvitare la cannula guida da 22 G pulita con etanolo nel supporto della cannula sul telaio stereotassico.
   2. Posizionare il ratto in una camera di induzione (300 mm x 200 mm, vedere la Tabella dei materiali) e indurre l'anestesia con isoflurano al 5% a 1 L/min di ossigeno.
   3. Una volta che il ratto è profondamente anestetizzato (nessun riflesso del pedale), spostare il ratto verso il telaio stereotassico e ridurre l'isoflurano al 2%-3% in 1 L/min di ossigeno per il mantenimento attraverso il cono del naso. Agganciare i denti alla barra del morso e tirare con cautela il cono del naso sopra il naso - tirare delicatamente indietro il ratto per verificare che sia sicuro.
   4. Applicare un lubrificante protettivo per gli occhi su entrambi gli occhi per evitare che si secchino.
   5. Iniettare carprofene (5 mg/kg), buprenorfina (0,05 mg/kg) in soluzione fisiologica e 3 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea (s.c.) per la gestione del dolore e per favorire il recupero post-operatorio.
   6. Pizzica le dita dei piedi per verificare il riflesso del pedale. Una volta assente, fissa il cranio del topo nell'inquadratura. Posizionare una barra auricolare nel condotto uditivo e stringere. Ripetere sull'altro lato.
   7. Spostare lateralmente le barre auricolari per assicurarsi che i numeri indicati sulle barre auricolari siano uguali su entrambi i lati. La testa non deve muoversi quando si preme sul cranio.
   8. Radere la parte superiore della testa con un tagliacapelli. Pulisci i capelli con un fazzoletto e soluzione salina. Se necessario, riapplicare il lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi per evitare che si secchi.
   9. Tamponare il cuoio capelluto con clorexidina al 4% e soluzione alcolica per la preparazione della pelle, utilizzando tamponi di cotone sterili per ogni passaggio (vedi Tabella dei materiali). Inizia dal centro del cranio e muoviti in cerchi verso l'esterno fino a quando tutta la superficie non è pulita.
   10. Iniettare ~150 μL di Ropivacaina (1%) s.c. (vedi Tabella dei materiali) lungo il sito di incisione previsto.
   11. Usa la lama del bisturi per praticare un'incisione di 10-15 mm lungo la linea mediana della testa, tra gli occhi fino alla base del cranio.
   12. Usa le punte di cotone e il bisturi per raschiare via il tessuto connettivo ed esporre il cranio.
   13. Immergi una punta di cotone sterile in una soluzione di perossido di idrogeno al 3% e applicala sulla superficie del cranio. Attendere 5 secondi affinché la sostanza chimica reagisca con la pelle, quindi pulire l'area con una punta di cotone asciutta.
   14. Applicare una seconda volta il perossido di idrogeno al 3%. Questo farà apparire più chiaramente le linee di sutura del cranio. Attendere 10 s affinché la sostanza chimica reagisca con la pelle, quindi pulire l'area con una punta di cotone asciutta. Lavare con soluzione fisiologica e asciugare con una punta di cotone pulita.
   15. Applicare con cura una piccola quantità di gel Super etch su una punta di cotone e poi applicarlo sulla superficie del cranio. Questo crea una superficie più porosa su cui il cemento dentale può aderire.
   16. Applicare una generosa quantità di soluzione salina sul cranio per lavare via il super mordenzante e asciugarlo con una punta di cotone pulita.
   17. Identificare il bregma e contrassegnarlo con il pennarello.
   18. Praticare una rientranza per la vite di ancoraggio in un punto che non ostruisca il posizionamento della cannula di guida.
       NOTA: Se il ventricolo laterale destro è cannulato, forare sull'emisfero sinistro e posteriormente rispetto al ventricolo.
   19. Tenere il trapano a un angolo di ~75°-80° rispetto al cranio e praticare lentamente una rientranza con una profondità di circa la metà dello spessore del cranio. Usa la soluzione salina su una punta di cotone per rimuovere la polvere di ossa.
   20. Inserire con cautela la vite tenendola saldamente nella rientranza con una pinza e avvitandola nel cranio con il cacciavite, evitando di rompere il cranio. Dopo ogni giro completo, verificare se la vite è ben salda.
   21. Verifica che il cranio sia piatto. Utilizzando i bracci mobili del telaio, posizionare la cannula guida in modo che tocchi il cranio in corrispondenza della bregma. Azzerare il DV (dorso-ventrale) che rappresenta le coordinate del piano Z premendo il pulsante sul monitor di controllo del fotogramma.
   22. Sollevare la cannula guida (22 G e 4 mm di lunghezza) utilizzando i bracci mobili del telaio e spostarla su lambda. Abbassarlo in modo che tocchi la superficie del cranio e notare nuovamente il display DV.
       NOTA: La differenza tra DV a bregma e DV a lambda deve essere inferiore a 0,2 mm. Se necessario, regolare il cono del naso di conseguenza, cioè spostare la testa del ratto verso l'alto o verso il basso secondo necessità e ripetere le misurazioni.
   23. Riportare la cannula guida in modo che tocchi il bregma e azzerare nuovamente tutte e tre le coordinate: DV, AP (anteriore-posteriore) e ML (mediale-laterale) premendo i pulsanti sul monitor.
   24. Spostare la cannula guida alle coordinate prestabilite di scelta.
       NOTA: Per l'incannulamento del ventricolo laterale destro in un ratto adulto di 300-350 g, sono state utilizzate le seguenti coordinate: -0,7 mm AP, -1,4 mm ML e -4,00 mm DV (la stessa lunghezza della cannula guida).
   25. Segna la posizione finale della cannula colorando l'estremità della cannula usando il pennarello e poi abbassandola sulla superficie del cranio per toccare e segnare la posizione.
   26. Praticare un foro di 2,3 mm di diametro per la cannula guida da 22 G tenendo l'albero del trapano in posizione verticale diritta, cioè con un angolo di 90° rispetto al remontore. Fai attenzione a spostarti lentamente e progressivamente più in profondità nel cranio, cioè evita di perforare il tessuto cerebrale.
       NOTA: Se necessario, abbassare la cannula nel foro utilizzando il braccio stereotassico mobile per verificare se la cannula può essere posizionata correttamente o se è necessaria un'ulteriore perforazione.
   27. Una volta che la cannula è stata abbassata nel cervello, sollevarla di nuovo, applicare con cura la super colla sul lato inferiore del piedistallo di plastica della cannula e abbassare nuovamente la cannula nel foro utilizzando il braccio mobile del telaio stereotassico.
   28. Lasciare in posa per consentire alla colla di solidificarsi.
   29. Durante l'attesa, mescolare il solvente dentale e la polvere (vedi Tabella dei materiali) in una pesa. Versare la polvere di cemento dentale nella navicella di pesatura, utilizzare una siringa da 1 ml per aggiungere ~300 μl di solvente e mescolare con la stessa siringa fino a quando non si addensa e ha una consistenza utilizzabile. Se necessario, aggiungere altra polvere per aumentare la viscosità o più solvente per ridurre la viscosità.
   30. Sganciare la cannula dal porta cannula utilizzando l'apposita vite e sollevare con cautela il braccio.
       NOTA: La cannula deve essere incollata al cranio con un angolo di 90°.
   31. Applicare il cemento dentale fresco sul cranio esposto aspirandolo nella siringa monouso da 1 ml e applicandolo intorno alla cannula. Evitare qualsiasi cemento dentale sulla pelle o l'apertura della cannula. Lasciate riposare per qualche secondo, a seconda della sua consistenza.
   32. Quando il cemento dentale diventa più denso, utilizzare una spatola per applicare altro cemento dentale e formare il supporto finale della testa coprendo interamente la vite.
       NOTA: Fare attenzione a non coprire troppo la cannula in modo che la cannula fittizia possa ancora essere avvitata. Rimuovere il cemento dentale in eccesso dalla pelle.
   33. Inserire una cannula ciuccia sterile una volta che il cemento dentale è asciutto e solido.
   34. Spegni l'isoflurano, rilascia le barre auricolari, rimuovi il ratto dal telaio e mettilo nella scatola di recupero.
   35. Una volta che l'animale si è ripreso ~15-30 minuti, sistemalo in una scatola pulita.
       NOTA: Dopo l'intervento chirurgico, i ratti devono essere alloggiati in un solo alloggio. Prendere in considerazione la sostituzione delle gabbie a griglia standard in cui la tramoggia del cibo si abbassa nella gabbia con gabbie a griglia rialzate dedicate per ridurre al minimo il rischio di interferenze con il supporto della testa. In alternativa, bloccare tutte le parti della gabbia che sono molto più basse dell'altezza di allevamento dell'animale.
   36. Compila la lista di controllo per il monitoraggio e monitora secondo le linee guida di monitoraggio delineate nel protocollo.
       NOTA: Prendi in considerazione l'idea di posizionare alcuni pellet di cibo sul pavimento per raggiungerli più facilmente. Se non interferisce con l'esperimento, può essere fornito un ulteriore sollievo dal dolore nel cibo dolce per sostituire ulteriori iniezioni s.c. post-operatorie, ad esempio buprenorfina mescolata con pasta di cioccolato di noci dolci 35,36,37. In questo caso, un po' dello stesso dolce è stato fornito come ricompensa prima e dopo l'intervento chirurgico per evitare la neofobia alimentare quando si offre sollievo dal dolore. La pasta di noci può essere fornita su nastro adesivo attaccato alla parete della gabbia.
   37. Immagazzina più cannule fittizie rispetto alle cannule guida o alle cannule per iniezione, poiché potrebbero perdersi tra la lettiera della gabbia degli animali se si staccano accidentalmente. In caso di tale evenienza, sostituire la cannula con una nuova cannula fittizia sterile.

2. Iniezioni di ICV

1. Preparare il farmaco e il veicolo, ad es. 30 mg/mL di polimixina B (vedi Tabella dei materiali) in soluzione fisiologica sterile allo 0,9%. Mantenere il volume di iniezione tra 5 e 10 μl nei ratti adulti con un peso corporeo compreso tra 300 e 400 g.
2. Almeno 24 ore dopo l'intervento, pesare il ratto e trasportarlo in sala operatoria.
3. Calcolare il volume di iniezione utilizzando il peso corporeo del ratto.
4. Rimuovere il coperchio della gabbia e svitare la cannula fittizia.
   NOTA: I ratti di solito stanno fermi quando li tengono delicatamente nella loro gabbia e non hanno bisogno di essere trattenuti. Uno strofinaccio può essere utilizzato per un topo curioso o nervoso o per un solletico agli zigomi.
5. Per un'iniezione in bolo, collegare un tubo in PE-50 (vedere Tabella dei materiali) di almeno 40 cm di lunghezza a una microsiringa a tenuta di gas da 10 μl tirando un'estremità del tubo sopra l'ago fisso o rimovibile sulla siringa e assicurando una tenuta ermetica. Collegare la cannula dell'iniettore montata all'altra estremità del tubo.
   1. Prelevare la quantità richiesta attraverso la cannula. Inserire la cannula nella guida fino a quando non è inserita e iniettare. Una volta iniettato tutto il liquido, tenere lo stantuffo della siringa in posizione per almeno un altro minuto per evitare il riflusso.
6. Per una velocità di somministrazione più lenta, iniettare i farmaci utilizzando una pompa per microiniezione (vedere Tabella dei materiali).
   1. Innanzitutto, utilizzare acqua filtrata e una siringa monouso da 1 ml con un ago da aspirazione da 23 G per riempire completamente il tubo PE-50. Quindi rimuovere la siringa monouso dall'ago di estrazione e sostituirla con la microsiringa.
   2. Prelevare 1-3 μl per creare una bolla d'aria piccola ma visibile. Quindi, prelevare la quantità richiesta di farmaci. Facoltativamente, contrassegnare la bolla d'aria con un pennarello per facilitare la visibilità del flusso di farmaci. Bloccare la siringa in posizione sulla pompa.
      NOTA: Assicurarsi che le impostazioni siano corrette per il farmaco e l'attrezzatura utilizzata, ovvero impostare la velocità di erogazione e il diametro interno della siringa utilizzata secondo il manuale dell'utente.
7. Una volta iniettato tutto il liquido, arrestare la pompa se non si ferma automaticamente. Lasciare l'ago inserito per almeno un altro minuto per evitare il riflusso.
8. Rimuovere lentamente la cannula dell'iniettore e avvitare la cannula guida.
9. Pulire l'apparecchiatura aspirando ed espellendo l'etanolo e l'acqua deionizzata tre volte ciascuno.

3. Prelievo di liquido cerebrospinale e tessuti

1. Trasporta il ratto in una sala operatoria.
2. Posizionare il ratto nella camera di induzione e indurre l'anestesia con isoflurano al 5% in 2 L/min di ossigeno fino a quando la respirazione non è rallentata (~ 5 min).
3. Sposta il ratto verso il telaio stereotassico e mantieni lo stesso livello di anestesia profonda attraverso il cono del naso.
4. Verificare il riflesso del pedale. Una volta assente, fissare il teschio nella montatura utilizzando le barre auricolari.
   NOTA: Questo può essere un telaio stereotassico più semplice senza display, barre auricolari arrotondate o bracci mobili. Si tratta di una procedura di non recupero; L'unica caratteristica necessaria è qualsiasi barra auricolare per ratto.
5. Usando il cono del naso, inclina il naso del ratto verso il basso di circa 45° per esporre il collo a una buona posizione di lavoro.
6. Usando piccole forbici smussate e curve, senti il cranio e muoviti posteriormente fino all'estremità del cranio. In questa posizione, tagliare lo strato muscolare più esterno proprio attraverso la linea mediana del collo, di circa 2-3 cm di lunghezza. Tagliare con cura tutti gli altri strati muscolari.
   1. Utilizzare un piccolo divaricatore a molla per tenere aperta la ferita e consentire una buona visibilità. Tagliare fino a quando la membrana della cisterna magna è visibile. Usa una punta di cotone per rimuovere delicatamente la pelle.
7. Se si verifica sanguinamento, utilizzare una garza per pulire e fermare l'emorragia.
8. Se necessario, utilizzare piccole strisce di tessuto arrotolato e posizionarle intorno alla cisterna magna per evitare che il sangue contamini il liquido cerebrospinale.
   NOTA: Per confermare il successo dell'iniezione con il colorante, iniettare 2-3 μL di colorante Evans Blue all'1,1% (vedere la Tabella dei materiali) nel ratto anestetizzato prima di raccogliere il liquido cerebrospinale utilizzando la cannula montata e una siringa monouso da 1 mL.
9. Per preparare lo strumento per l'estrazione del liquido cerebrospinale, riempire la siringa con ~500 μl di acqua filtrata, collegare un ago da 23 g e tirare il tubo sopra l'ago. Collegare una pipetta di vetro tirata all'altra estremità del tubo.
10. Per estrarre il liquido cerebrospinale, inserire lentamente la pipetta estratta nella cisterna magna esposta.
    NOTA: Il liquido cerebrospinale fluirà lentamente e passivamente nella pipetta e verrà aspirato attivamente utilizzando la siringa. Se il colorante viene iniettato, il liquido cerebrospinale sarebbe colorato di blu (Figura 1).
11. Aggiungere il liquido cerebrospinale in un tubo etichettato e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio secco. Il liquido cerebrospinale può quindi essere conservato a -80 °C.
12. Raccogliere qualsiasi altro tessuto di interesse per l'analisi. Per il plasma, raccogliere almeno 3 ml di sangue cardiaco.
    1. Posiziona il ratto profondamente anestetizzato sulla schiena e apri la cavità toracica per esporre il cuore. Usa un emostatico per bloccare la gabbia toracica e posizionala sulla gola dell'animale per favorire la visibilità. Utilizzare una pinza per tessuti con uncini per tenere il ventricolo destro e inserire una siringa monouso da 5 ml con un ago da 18 G nel ventricolo sinistro parallelamente al setto. Prelevare lentamente il sangue nella siringa. Una volta raccolti 3-5 ml di sangue, rimuovere l'ago dal cuore.
13. Togliete l'ago dalla siringa e mettetelo in un contenitore affilato. Trasferire il sangue in provette eparinizzate e centrifugare a 2.739 x g e 4 °C per 15 minuti prima di raccogliere il surnatante con una pipetta da 200 μl e congelare a scatto su ghiaccio secco.
14. Eutanasia del ratto rimuovendo il cuore con le forbici. Chiudere l'alimentazione di isoflurano.
15. Raccogli tutti gli altri organi addominali di interesse, come il rene o la milza. Identificare l'organo, tenere l'organo di interesse con una pinza per tessuti con ganci, sollevarlo e tagliare eventuali attacchi. Metti l'organo in un tubo etichettato e congelalo a scatto su ghiaccio secco.
16. Per rimuovere il cervello, decapita l'animale con un paio di forbici affilate e grandi tagliando alla base del cranio. Estrarre manualmente il supporto per la testa. Taglia la pelle rimanente che copre il cranio.
17. Usando le forbici da dissettore, tagliare il cranio sulla linea mediana dalla base alla lambda, cioè tagliare a metà l'osso sopraoccipitale. Usa un emostatico per afferrarne una metà e allontanarla. Ripeti sull'altro lato per esporre completamente il cervelletto.
18. Procedere al taglio lungo la sutura sagittale fino all'osso frontale. Usa un emostatico per rimuovere ciascuna delle ossa parietali. Se necessario, tagliare ulteriormente l'osso frontale e rimuovere altro osso per esporre i bulbi olfattivi.
19. Tenere la testa capovolta e sollevare con cura il cervello con una spatola, staccandolo dai nervi ottico e trigemino recidendoli con la spatola. Raccogli il cervello in un tubo e congela a scatto su ghiaccio secco.
20. I ventricoli cerebrali saranno colorati di blu se il colorante viene iniettato. Utilizzare una lama monouso per tagliare il cervello nel sito di iniezione (Figura 2A, B) e ~1 cm posteriormente (Figura 2C) per studiare la distribuzione del colorante nei ventricoli.
21. Per rimuovere il midollo spinale, esporre la colonna vertebrale tagliando la pelle lungo la linea mediana della superficie dorsale del ratto. Asportare la colonna vertebrale praticando un'incisione bilaterale attorno ad essa e tagliandola trasversalmente all'estremità caudale del midollo spinale lombare.
22. Tagliare la lamina bilateralmente lungo la colonna usando le forbici fino a quando l'intero midollo spinale è esposto. Sollevare il midollo spinale da un'estremità, ad esempio l'estremità rostrale, ed estrarlo fendendo i nervi spinali in direzione caudale fino a quando tutti i nervi non sono tagliati. Raccogli il midollo spinale in un tubo e congela a scatto su ghiaccio secco.
    NOTA: Pesare tutte le provette prima e dopo la raccolta degli organi per l'analisi dei dati. Se necessario e appropriato, il sistema ventricolare può essere lavato dopo la raccolta del liquido cerebrospinale e prima della raccolta del cervello per rimuovere i farmaci residui nei compartimenti ventricolari. Utilizzare una siringa da 1 ml riempita con soluzione fisiologica attaccata al tubo e una cannula per iniettore e inserirla nella cannula guida. Iniettare 2-3 mL di soluzione fisiologica. La soluzione salina dovrebbe uscire dall'apertura della cisterna magna. Le cannule guida, le cannule fittizie e le viti possono essere riutilizzate immergendole nell'acetone per 24 ore, quindi immergendole e pulindole con detergente medico e acqua. Una volta essiccato, il cemento dentale residuo può essere rimosso utilizzando una pinza fine.

Risultati

Il protocollo chirurgico presentato ha un grande successo, con chirurghi qualificati che hanno raggiunto un tasso di sopravvivenza del >99,8% e animali che mostrano un peso corporeo stabile dopo l'intervento chirurgico il giorno 1, rispetto al loro peso pre-operatorio il giorno 0 (± media SD di 315,8 g ± 42,1 g per il giorno 0 e 314,1 g ± 43,0 g per il giorno 1, Figura 3).

Prima di raccogliere il liquido cerebrospinale, un'inie...

Discussione

Ricercatori e medici impiegano iniezioni di ICV per aggirare il meccanismo protettivo della BBB e somministrare farmaci direttamente nel SNC 12,18,19,21,24. Il presente lavoro è un protocollo ICV completo per la somministrazione efficiente di farmaci nel SNC e l'estrazione di CSF per l'analisi farmacocinetica. All'inizio dell...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Terumo, Japan	SS+01T
5 mL syringes	Terumo, Japan	SS+05S
Acetone	Merck, Germany	67641
Bench protector sheets	Halyard, USA	2765-C
Betadine	Mundipharma, Netherlands	1015695
Buprenorphine; Temgesic	Clifford Hallam Healthcare, Australia	1238366
Carprofen	Zoetis, Australia	10001132
Chlorhexidine	Tasman Chemicals, Australia	890401
Chux superwipes (or equivalent)	Chux, Australia	n/a	autoclaved
Clippers	n/a	n/a
Cotton swabs	LP Italiana, Italy	112191	autoclaved
Dental cement powder (Vertex Self cure powder)	Henry Schein, USA	VX-SC500GVD5
Dental cement solvent (Vertex Self cure liquid)	Henry Schein, USA	VX-SC250MLLQ
Disposable needles: 18 G, 26 G, 30 G	Terumo, Japan	NN+2525RL
Disposable surgical blades	Westlab, Australia	663-255
Dissector scissors	F.S.T.	14082-09
Dummy cannulas	Bio Scientific, Australia	C313DC/SPC	cut to 4.05 to fit the guide cannula
Ethanol 80%	Merck, Australia	10107
Evan's blue dye	Sigma	E2129 - 50G
Eye lube	Clifford Hallam Healthcare, Australia	2070491
Felt tip pen	Sharpie, USA	D-4236
Fibre optic light source	n/a	n/a
Flattened needle (18 G) or similar to apply superglue	n/a	n/a
Glass pipettes, pulled	Hirschmann Laborgeraete, Germany	9100175
Glass syringe 10 uL	Hamilton, USA	701 LT and 1701 LT
Guide cannulas	Bio Scientific, Australia	C313G/SPC	22 G, cut 4 mm below the pedestal for lateral ventricle cannulation in adult Sprague Dawley rats
Haemostat
Heat bead steriliser	Inotech, Switzerland	IS-250
Heat pad	n/a	n/a
Hydrogen peroxide 3%	Perrigo, Australia	11383
Induction chamber (Perspex 300 mm x 200 mm)	n/a	n/a
Injector cannula	Bio Scientific, Australia	C313I/SPC	cut to fit the 4 mm cannula + 0.5 mm projection
Isoflurane	Clifford Hallam Healthcare, Australia	2093803
Isoflurane vaporiser and appropriate scavenging system	n/a	n/a
Medium size weighing boats	n/a	n/a
Metal spatula	Met-App, Australia	n/a
Micro syringe pump	New Era, USA	NE-300
Microdrill	RWD Life Science Co, China	87001
Polymyxin B	Beta Pharma, China	86-40302
Protein LoBind tubes, 0.5 mL	Eppendorf, Germany	Z666491
Ropivacaine 1%; Naropin	AstraZeneca, UK	PS09634
Scissors, large	F.S.T.	14511-15
Scissors, small	F.S.T.	14079-10
Screwdriver	n/a	n/a
Screws	Mr. Specs, Australia	n/a
Stereotaxic frame	RWD Life Science Co, China	n/a	Necessary components: rat ear bars, tooth bar, anaesthesia nose cone, arm with digital readout (X, Y, Z) and cannula holder
Sterile saline 0.9%	Baxter, USA	AHB1323
Super etch (37% phosphoric acid) gel	SDI Limited, Australia	8100045
Superglue	UHU, Germany	n/a
Tissue forceps with hooks	F.S.T.	11027-12
Tubing, PE-50	Bio Scientific, Australia	C313CT