A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
העברת תרופות ישירות למערכת העצבים המרכזית היא אחת הדרכים לעקוף את מחסום הדם-מוח. הפרוטוקול הנוכחי מדגים הזרקה תוך מוחית לאיסוף עוקב של נוזל המוח ואיברי הגוף. זה מקל על חקירת פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה של תרופות במודלים של בעלי חיים לפיתוח טיפולים חדשים.
למרות שמחסום הדם-מוח (BBB) מגן על המוח מפני ישויות זרות, הוא גם מונע מחלק מהטיפולים לעבור למערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי לשפר מחלות או זיהומים. תרופות ניתנות ישירות למערכת העצבים המרכזית בבעלי חיים ובבני אדם כדי לעקוף את ה-BBB. הפרוטוקול הנוכחי מתאר דרך ייחודית לטיפול בזיהומים במוח באמצעות אספקה תוך חדרית של אנטיביוטיקה, כלומר, פולימיקסין, אנטיביוטיקה קו אחרון לטיפול בחיידקים גראם-שליליים עמידים לתרופות מרובות. פרוטוקול ניתוח סטריאוטקסי פשוט פותח להשתלת צינורית מנחה המגיעה לחדר הצדדי בחולדות. לאחר תקופת החלמה של 24 שעות, ניתן להזריק חולדות באופן מודע וחוזר דרך צינורית המותקנת למדריך. ניתן לתת זריקות באופן ידני כבולוס או עירוי באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה כדי להשיג קצב זרימה איטי ומבוקר. ההזרקה התוך חדרית אושרה בהצלחה עם צבע כחול אוונס. ניתן לנקז נוזל מוחי שדרתי (CSF), ולאסוף את המוח ואיברים אחרים. גישה זו מתאימה מאוד למחקרים הכוללים אספקת תרופות למערכת העצבים המרכזית והערכה לאחר מכן של פעילות פרמקוקינטית ופרמקודינמית.
מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מנגנון הגנה חיוני למערכת העצבים המרכזית (CNS). המחסום האנטומי החדיר באופן סלקטיבי מפריד בין הדם הזורם והמומסים שלו לבין הנוזל החוץ-תאי של המוח, ובכך מונע מרוב המולקולות להיכנס למוח 1,2,3,4, תלוי בגודלן, ליפופיליות5 וזמינות מנגנון הובלה פעיל2.
מחסום מגן זה מועיל לוויסות יעיל של הומאוסטזיס מורכב במוח ובריאות מערכת העצבים המרכזית 4,6. עם זאת, זה גם מקשה על מתן תרופות לטיפול בזיהומים במוח או במחלות אחרות של מערכת העצבים המרכזית 4,7. מלבד שיבוש ה-BBB באמצעות מגוון שיטות 8,9, הגישה העיקרית לעקיפת ה-BBB היא העברת תרופה ישירות למוח על ידי שחרורה לנוזל המוח השדרתי (CSF)4. למרות שמדובר בפרקטיקה פולשנית יחסית, היא שימשה בהצלחה למתן טיפולים ממוקדים לחולים וחיות מעבדה. בבני אדם, ניתן להעביר תרופות למערכת התוך חדרית או CSF ולאחר מכן לדגום אותן באמצעות מאגר אומאיה, מאגר השוכן מתחת לקרקפת, המחובר לצנתר המוחדר לחדר הצדדי10,11. טכניקות דומות הוקמו בחיות מעבדה כמו מכרסמים כדי להשיג מטרות שוות ערך. משאבות מיקרו-אוסמוטיות הושתלו בעכברים 12,13,14,15 ובחולדות16,17 להעברת תרופות רציפה למערכת החדרים או לפרנכימה המוחית. בנוסף, הזרקות תוך מוחיות ישירות בוצעו בעכברים מורדמים באמצעות מחט חד פעמית18,19 ובחולדות בהכרה באמצעות צינורית שהושתלה בניתוח 20,21,22,23. העברת תרופות למערכת העצבים המרכזית הייתה שיטה שלא תסולא בפז לשיפור ההבנה בתחומים שונים 20,24,25,26,27,28.
זיהומים במערכת העצבים המרכזית הם תחום כזה שזקוק בדחיפות לטיפולים חדשים ולהבנה משופרת של טיפולים אנטי-זיהומיים קיימים. זיהומים במערכת העצבים המרכזית הנגרמים על ידי חיידקים גראם-שליליים עמידים לתרופות מדאיגות במיוחד7. פולימיקסינים הם אנטיביוטיקה קו אחרון המשמשת יותר ויותר לטיפול בזיהומים עקב 'חיידקי העל' הללו29. כאשר פולימיקסינים ניתנים תוך ורידי בהתאם להנחיות המינון הנוכחיות30, חדירתם למערכת העצבים המרכזית נמוכה מאוד, בעוד שמינונים גבוהים יותר מגבירים את הסיכון לרעילות כליות. לכן, טיפול בפולימיקסין תוך ורידי אינו מועיל לטיפול בזיהומים במערכת העצבים המרכזית7. קביעת משטר מינון בטוח ויעיל לאספקת פולימיקסינים למערכת העצבים המרכזית היא צורך רפואי דחוף שלא נענה 31,32,33. לכן, הפרוטוקול הנוכחי נקבע ומתואר תוך התמקדות בהזרקת אנטיביוטיקה ישירות ל-CSF של חולדות. עם זאת, ניתן להשתמש בו למתן כל תרופה שאינה נוירוטוקסית ושבה ניתן לתת ריכוזים טיפוליים בכמויות קטנות (למשל, עד 10 מיקרוליטר בחולדות). ניתן גם לשנות את הטכניקות המתוארות כדי להתמקד באזורים שונים במוח ולספק זריקות מרובות.
הפרוטוקול הנוכחי מציג ניתוח פשוט וטכניקת הזרקה המאפשרת פרמקוקינטיקה יעילה והפצה לאחר מתן תרופות ICV. הניתוח כולל השתלת צינורית מנחה. מכיוון שמדובר בהליך פחות פולשני מהשתלת משאבה מיקרו-אוסמוטית 12,13,14,15,16,17, זוהי אפשרות מתקדמת המתאימה למתן תרופות לטווח קצר ל-CSF. פרוטוקול זה מפושט ויכול לייצר שיעורי הישרדות גבוהים מאוד ומשקל גוף יציב 24 שעות לאחר הניתוח, המהווה שיפור בהשוואה לשיטות הקיימות34. לאחר הניתוח, חולדות בהכרה קיבלו זריקת בולוס ICV ידנית או אספקה איטית יותר באמצעות מיקרו-משאבה כדי להוריד את ריכוזי השיא של הפלזמה. באותו הזמן, הם יכלו לנוע בחופשיות בכלוב שלהם. כדי לבסס משטרי מינון תרופות בטוחים ויעילים, דגימות של CSF, מוח, חוט שדרה, כליות, פלזמה וכו', שימשו לאחר מכן לחקר פרמקוקינטיקה והפצת תרופות לאחר מתן תוך מוחי (ICV). ניתן לחקור את הפצת התרופות גם באופן ויזואלי, למשל, באמצעות אימונוהיסטוכימיה או הדמיית ספקטרומטריית מסה בלייזר בעזרת מטריצה (MALDI-MSI). במידת הצורך, ניתן להשתיל צינורית דו-צדדית, למשל, להזרקת תרופות שאחרת היו מתפשטות באופן חד צדדי לשתי ההמיספרות.
כל הניסויים נערכו על פי הקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מלבורן (יישום #1914890). חולדות ספראג-דולי בנות 8-14 שבועות שימשו לניסויים.
1. ניתוח סטריאוטקסי לקנולציה של חדר לרוחב
2. זריקות ICV
3. CSF ודגימת רקמות
הפרוטוקול הניתוחי שהוצג מוצלח ביותר, כאשר מנתחים מיומנים הגיעו לשיעור הישרדות של >99.8% ובעלי חיים הראו משקל גוף יציב לאחר הניתוח ביום הראשון, בהשוואה למשקל שלהם לפני הניתוח ביום 0 (ממוצע ± SD של 315.8 גרם ±-42.1 גרם ליום 0 ו-314.1 גרם ±-43.0 גרם ליום הראשון, איור 3).
חוקרים וקלינאים משתמשים בזריקות ICV כדי לעקוף את מנגנון ההגנה של ה-BBB ולהעביר תרופות ישירות למערכת העצבים המרכזית 12,18,19,21,24. העבודה הנוכחית היא פרוטוקול ICV שלם להעברת תרופות ביעילות ל?...
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
המחברים מודים למתקן המדע הביו-רפואי לבעלי חיים באוניברסיטת מלבורן על האספקה והטיפול בבעלי חיים. מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכון הלאומי לבריאות (R01 AI146241, GR ו-TV). JL הוא עמית מחקר ראשי במועצה הלאומית למחקר רפואי לבריאות (NHMRC). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות או המכון הלאומי לבריאות.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetone | Terumo, Japan | SS+01T | |
5 mL syringes | Terumo, Japan | SS+05S | |
Acetone | Merck, Germany | 67641 | |
Bench protector sheets | Halyard, USA | 2765-C | |
Betadine | Mundipharma, Netherlands | 1015695 | |
Buprenorphine; Temgesic | Clifford Hallam Healthcare, Australia | 1238366 | |
Carprofen | Zoetis, Australia | 10001132 | |
Chlorhexidine | Tasman Chemicals, Australia | 890401 | |
Chux superwipes (or equivalent) | Chux, Australia | n/a | autoclaved |
Clippers | n/a | n/a | |
Cotton swabs | LP Italiana, Italy | 112191 | autoclaved |
Dental cement powder (Vertex Self cure powder) | Henry Schein, USA | VX-SC500GVD5 | |
Dental cement solvent (Vertex Self cure liquid) | Henry Schein, USA | VX-SC250MLLQ | |
Disposable needles: 18 G, 26 G, 30 G | Terumo, Japan | NN+2525RL | |
Disposable surgical blades | Westlab, Australia | 663-255 | |
Dissector scissors | F.S.T. | 14082-09 | |
Dummy cannulas | Bio Scientific, Australia | C313DC/SPC | cut to 4.05 to fit the guide cannula |
Ethanol 80% | Merck, Australia | 10107 | |
Evan's blue dye | Sigma | E2129 - 50G | |
Eye lube | Clifford Hallam Healthcare, Australia | 2070491 | |
Felt tip pen | Sharpie, USA | D-4236 | |
Fibre optic light source | n/a | n/a | |
Flattened needle (18 G) or similar to apply superglue | n/a | n/a | |
Glass pipettes, pulled | Hirschmann Laborgeraete, Germany | 9100175 | |
Glass syringe 10 uL | Hamilton, USA | 701 LT and 1701 LT | |
Guide cannulas | Bio Scientific, Australia | C313G/SPC | 22 G, cut 4 mm below the pedestal for lateral ventricle cannulation in adult Sprague Dawley rats |
Haemostat | |||
Heat bead steriliser | Inotech, Switzerland | IS-250 | |
Heat pad | n/a | n/a | |
Hydrogen peroxide 3% | Perrigo, Australia | 11383 | |
Induction chamber (Perspex 300 mm x 200 mm) | n/a | n/a | |
Injector cannula | Bio Scientific, Australia | C313I/SPC | cut to fit the 4 mm cannula + 0.5 mm projection |
Isoflurane | Clifford Hallam Healthcare, Australia | 2093803 | |
Isoflurane vaporiser and appropriate scavenging system | n/a | n/a | |
Medium size weighing boats | n/a | n/a | |
Metal spatula | Met-App, Australia | n/a | |
Micro syringe pump | New Era, USA | NE-300 | |
Microdrill | RWD Life Science Co, China | 87001 | |
Polymyxin B | Beta Pharma, China | 86-40302 | |
Protein LoBind tubes, 0.5 mL | Eppendorf, Germany | Z666491 | |
Ropivacaine 1%; Naropin | AstraZeneca, UK | PS09634 | |
Scissors, large | F.S.T. | 14511-15 | |
Scissors, small | F.S.T. | 14079-10 | |
Screwdriver | n/a | n/a | |
Screws | Mr. Specs, Australia | n/a | |
Stereotaxic frame | RWD Life Science Co, China | n/a | Necessary components: rat ear bars, tooth bar, anaesthesia nose cone, arm with digital readout (X, Y, Z) and cannula holder |
Sterile saline 0.9% | Baxter, USA | AHB1323 | |
Super etch (37% phosphoric acid) gel | SDI Limited, Australia | 8100045 | |
Superglue | UHU, Germany | n/a | |
Tissue forceps with hooks | F.S.T. | 11027-12 | |
Tubing, PE-50 | Bio Scientific, Australia | C313CT |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved