מחקר אספקה ודגימה של תרופות תוך חדריות למחקר פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה

Summary

העברת תרופות ישירות למערכת העצבים המרכזית היא אחת הדרכים לעקוף את מחסום הדם-מוח. הפרוטוקול הנוכחי מדגים הזרקה תוך מוחית לאיסוף עוקב של נוזל המוח ואיברי הגוף. זה מקל על חקירת פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה של תרופות במודלים של בעלי חיים לפיתוח טיפולים חדשים.

Abstract

למרות שמחסום הדם-מוח (BBB) מגן על המוח מפני ישויות זרות, הוא גם מונע מחלק מהטיפולים לעבור למערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי לשפר מחלות או זיהומים. תרופות ניתנות ישירות למערכת העצבים המרכזית בבעלי חיים ובבני אדם כדי לעקוף את ה-BBB. הפרוטוקול הנוכחי מתאר דרך ייחודית לטיפול בזיהומים במוח באמצעות אספקה תוך חדרית של אנטיביוטיקה, כלומר, פולימיקסין, אנטיביוטיקה קו אחרון לטיפול בחיידקים גראם-שליליים עמידים לתרופות מרובות. פרוטוקול ניתוח סטריאוטקסי פשוט פותח להשתלת צינורית מנחה המגיעה לחדר הצדדי בחולדות. לאחר תקופת החלמה של 24 שעות, ניתן להזריק חולדות באופן מודע וחוזר דרך צינורית המותקנת למדריך. ניתן לתת זריקות באופן ידני כבולוס או עירוי באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה כדי להשיג קצב זרימה איטי ומבוקר. ההזרקה התוך חדרית אושרה בהצלחה עם צבע כחול אוונס. ניתן לנקז נוזל מוחי שדרתי (CSF), ולאסוף את המוח ואיברים אחרים. גישה זו מתאימה מאוד למחקרים הכוללים אספקת תרופות למערכת העצבים המרכזית והערכה לאחר מכן של פעילות פרמקוקינטית ופרמקודינמית.

Introduction

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מנגנון הגנה חיוני למערכת העצבים המרכזית (CNS). המחסום האנטומי החדיר באופן סלקטיבי מפריד בין הדם הזורם והמומסים שלו לבין הנוזל החוץ-תאי של המוח, ובכך מונע מרוב המולקולות להיכנס למוח ^1,2,3,4, תלוי בגודלן, ליפופיליות⁵ וזמינות מנגנון הובלה פעיל².

מחסום מגן זה מועיל לוויסות יעיל של הומאוסטזיס מורכב במוח ובריאות מערכת העצבים המרכזית ^4,6. עם זאת, זה גם מקשה על מתן תרופות לטיפול בזיהומים במוח או במחלות אחרות של מערכת העצבים המרכזית ^4,7. מלבד שיבוש ה-BBB באמצעות מגוון שיטות ^8,9, הגישה העיקרית לעקיפת ה-BBB היא העברת תרופה ישירות למוח על ידי שחרורה לנוזל המוח השדרתי (CSF)⁴. למרות שמדובר בפרקטיקה פולשנית יחסית, היא שימשה בהצלחה למתן טיפולים ממוקדים לחולים וחיות מעבדה. בבני אדם, ניתן להעביר תרופות למערכת התוך חדרית או CSF ולאחר מכן לדגום אותן באמצעות מאגר אומאיה, מאגר השוכן מתחת לקרקפת, המחובר לצנתר המוחדר לחדר הצדדי^10,11. טכניקות דומות הוקמו בחיות מעבדה כמו מכרסמים כדי להשיג מטרות שוות ערך. משאבות מיקרו-אוסמוטיות הושתלו בעכברים 12,13,14,15 ובחולדות^16,17 להעברת תרופות רציפה למערכת החדרים או לפרנכימה המוחית. בנוסף, הזרקות תוך מוחיות ישירות בוצעו בעכברים מורדמים באמצעות מחט חד פעמית^18,19 ובחולדות בהכרה באמצעות צינורית שהושתלה בניתוח 20,21,22,23. העברת תרופות למערכת העצבים המרכזית הייתה שיטה שלא תסולא בפז לשיפור ההבנה בתחומים שונים 20,24,25,26,27,28.

זיהומים במערכת העצבים המרכזית הם תחום כזה שזקוק בדחיפות לטיפולים חדשים ולהבנה משופרת של טיפולים אנטי-זיהומיים קיימים. זיהומים במערכת העצבים המרכזית הנגרמים על ידי חיידקים גראם-שליליים עמידים לתרופות מדאיגות במיוחד⁷. פולימיקסינים הם אנטיביוטיקה קו אחרון המשמשת יותר ויותר לטיפול בזיהומים עקב 'חיידקי העל' ^הללו29. כאשר פולימיקסינים ניתנים תוך ורידי בהתאם להנחיות המינון הנוכחיות³⁰, חדירתם למערכת העצבים המרכזית נמוכה מאוד, בעוד שמינונים גבוהים יותר מגבירים את הסיכון לרעילות כליות. לכן, טיפול בפולימיקסין תוך ורידי אינו מועיל לטיפול בזיהומים במערכת העצבים המרכזית⁷. קביעת משטר מינון בטוח ויעיל לאספקת פולימיקסינים למערכת העצבים המרכזית היא צורך רפואי דחוף שלא נענה 31,32,33. לכן, הפרוטוקול הנוכחי נקבע ומתואר תוך התמקדות בהזרקת אנטיביוטיקה ישירות ל-CSF של חולדות. עם זאת, ניתן להשתמש בו למתן כל תרופה שאינה נוירוטוקסית ושבה ניתן לתת ריכוזים טיפוליים בכמויות קטנות (למשל, עד 10 מיקרוליטר בחולדות). ניתן גם לשנות את הטכניקות המתוארות כדי להתמקד באזורים שונים במוח ולספק זריקות מרובות.

הפרוטוקול הנוכחי מציג ניתוח פשוט וטכניקת הזרקה המאפשרת פרמקוקינטיקה יעילה והפצה לאחר מתן תרופות ICV. הניתוח כולל השתלת צינורית מנחה. מכיוון שמדובר בהליך פחות פולשני מהשתלת משאבה מיקרו-אוסמוטית 12,13,14,15,16,17, זוהי אפשרות מתקדמת המתאימה למתן תרופות לטווח קצר ל-CSF. פרוטוקול זה מפושט ויכול לייצר שיעורי הישרדות גבוהים מאוד ומשקל גוף יציב 24 שעות לאחר הניתוח, המהווה שיפור בהשוואה לשיטות הקיימות³⁴. לאחר הניתוח, חולדות בהכרה קיבלו זריקת בולוס ICV ידנית או אספקה איטית יותר באמצעות מיקרו-משאבה כדי להוריד את ריכוזי השיא של הפלזמה. באותו הזמן, הם יכלו לנוע בחופשיות בכלוב שלהם. כדי לבסס משטרי מינון תרופות בטוחים ויעילים, דגימות של CSF, מוח, חוט שדרה, כליות, פלזמה וכו', שימשו לאחר מכן לחקר פרמקוקינטיקה והפצת תרופות לאחר מתן תוך מוחי (ICV). ניתן לחקור את הפצת התרופות גם באופן ויזואלי, למשל, באמצעות אימונוהיסטוכימיה או הדמיית ספקטרומטריית מסה בלייזר בעזרת מטריצה (MALDI-MSI). במידת הצורך, ניתן להשתיל צינורית דו-צדדית, למשל, להזרקת תרופות שאחרת היו מתפשטות באופן חד צדדי לשתי ההמיספרות.

Protocol

כל הניסויים נערכו על פי הקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות. הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מלבורן (יישום #1914890). חולדות ספראג-דולי בנות 8-14 שבועות שימשו לניסויים.

1. ניתוח סטריאוטקסי לקנולציה של חדר לרוחב

1. השתמש בקצות כותנה חיטוי ווילונות כירורגיים במהלך הניתוח.
2. הגדר את הדברים הבאים עבור הניתוח.
   1. הגדר מסגרת סטריאוטקסית, מערכת אספקת הרדמה, תרופות, כימיקלים וחומרים מסייעים (ראה טבלת חומרים). נקה את המסגרת הסטריאוטקסית, מקור אור סיבים אופטיים, מקדחה כף יד וכו', עם 80% אתנול.
   2. השרו את צינורית ההנחיה 22 גרם ואת צינורית הדמה הנלווית (ראה טבלת חומרים) באתנול 80% לעיקור.
      הערה: היצרן חתך מראש את מוביל ה-22 G ואת צינורית הדמה לאורך ~4 מ"מ מתחת לכן.
   3. עקר את מכשירי הניתוח (ראה טבלת חומרים) באמצעות מעקר חרוזי החום למשך 20 שניות ולאחר מכן רסס באתנול 80%. הניחו את המכשירים המעוקרים על הווילון הסטרילי.
   4. הכן קופסת התאוששות (קופסת דיור חולדה מרופדת בכרית תחתונה) עם מחצית מהקופסה מונחת מעל כרית חימום.
3. בצע את הניתוח.
   1. הברג את צינורית ההנחיה 22 G המנוקה באתנול לתוך מחזיק הצינורית על המסגרת הסטריאוטקסית.
   2. הכניסו את החולדה לתא אינדוקציה (300 מ"מ על 200 מ"מ, ראו טבלת חומרים) והשרו הרדמה עם איזופלורן 5% ב-1 ליטר לדקה של חמצן.
   3. לאחר שהחולדה מורדמת עמוק (ללא רפלקס דוושה), העבירו את החולדה למסגרת הסטריאוטקסית והפחיתו את האיזופלורן ל-2%-3% ב-1 ליטר לדקה של חמצן לתחזוקה דרך חרוט האף. חבר שיניים למוט הנשיכה ומשוך בזהירות את חרוט האף מעל האף - משוך לאחור בעדינות על החולדה כדי לבדוק שהיא מאובטחת.
   4. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
   5. יש להזריק קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג), בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) במי מלח ו-3 מ"ל מי מלח תת עורי (s.c.) לטיפול בכאב ולסייע בהתאוששות לאחר הניתוח.
   6. צבט את אצבעות הרגליים כדי לבדוק אם יש רפלקס דוושה. לאחר היעדרות, קבע את גולגולת החולדה במסגרת. הנח מוט אוזן אחד לתוך תעלת האוזן והדק. חזור על הפעולה בצד השני.
   7. הזז את מוטות האוזניים לרוחב כדי להבטיח שהמספרים המופיעים על מוטות האוזניים שווים משני הצדדים. הראש לא אמור לזוז בעת לחיצה כלפי מטה על הגולגולת.
   8. לגלח את החלק העליון של הראש בעזרת קוצץ. נגב את השיער עם טישו ותמיסת מלח. במידת הצורך, יש למרוח שוב חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
   9. יש לספוג את הקרקפת עם כלורהקסידין 4% ותמיסת תכשיר אלכוהולי, באמצעות צמר גפן סטרילי לכל שלב (ראו טבלת חומרים). התחל במרכז הגולגולת ונע במעגלים החוצה עד שכל המשטח נקי.
   10. הזרקו ~150 מיקרוליטר של Ropivacaine (1%) s.c. (ראה טבלת חומרים) לאורך אתר החתך המיועד.
   11. השתמש בלהב האזמל כדי לבצע חתך של 10-15 מ"מ לאורך קו האמצע של הראש, בין העיניים לבסיס הגולגולת.
   12. השתמש בקצות הכותנה ובאזמל כדי לגרד את רקמת החיבור ולחשוף את הגולגולת.
   13. טובלים קצה כותנה סטרילי בתמיסת מי חמצן 3% ומורחים אותו על פני הגולגולת. המתן 5 שניות עד שהכימיקל יגיב עם העור, ולאחר מכן נקה את האזור עם קצה כותנה יבש.
   14. מרחו 3% מי חמצן בפעם השנייה. זה יגרום לקווי התפרים של הגולגולת להופיע בצורה ברורה יותר. המתן 10 שניות עד שהכימיקל יגיב עם העור, ולאחר מכן נקה את האזור בעזרת קצה כותנה יבש. שוטפים במי מלח ומייבשים עם קצה כותנה נקי.
   15. מרחו בזהירות כמות קטנה של ג'ל Super Etch על קצה כותנה ולאחר מכן מרחו אותו על פני הגולגולת. זה יוצר משטח נקבובי יותר שהמלט הדנטלי יכול להיצמד אליו.
   16. מרחו כמות נדיבה של מי מלח על הגולגולת כדי לשטוף את תחריט העל ולייבש אותו עם קצה כותנה נקי.
   17. זהה ברגמה וסמן אותה באמצעות עט קצה הלבד.
   18. קדחו שקע לבורג העיגון במקום שלא יחסום את מיקום צינורית המנחה.
       הערה: אם החדר הצדדי הימני הוא קנולטי, קדחו בהמיספרה השמאלית ואחורית ביחס לחדר.
   19. החזק את המקדחה בזווית של ~75°-80° לגולגולת וקדח לאט שקע בעומק של כמחצית מעובי הגולגולת. יש להשתמש במי מלח על קצה כותנה כדי לנגב אבק עצמות.
   20. הכנס בזהירות את הבורג על ידי אחיזתו בחוזקה בשקע בעזרת מלקחיים והברגתו לתוך הגולגולת בעזרת המברג, הימנע משבירה בגולגולת. לאחר כל סיבוב שלם, בדוק אם הבורג יושב בחוזקה.
   21. ודא שהגולגולת שטוחה. בעזרת הזרועות הניידות של המסגרת, מקם את צינורית ההנחיה כדי לגעת בגולגולת בברגמה. אפס את ה-DV (גבי-גחון) המייצג את קואורדינטות מישור Z על ידי לחיצה על הכפתור בצג השולט על המסגרת.
   22. הרם את צינורית ההנחיה (22 G ו-4 מ"מ אורך) באמצעות הזרועות הניידות של המסגרת והעבר אותה ללמבדה. הורד אותו כך שייגע במשטח הגולגולת ושים לב שוב לתצוגת ה- DV.
       הערה: ההבדל בין DV בברגמה ל-DV בלמבדה צריך להיות פחות מ-0.2 מ"מ. במידת הצורך, כוונו את חרוט האף בהתאם, כלומר הזיזו את ראש החולדה למעלה או למטה לפי הצורך, וחזרו על המדידות.
   23. הזז את צינורית ההנחיה לאחור כדי לגעת ברגמה ואפס מחדש את כל שלוש הקואורדינטות: DV, AP (קדמי-אחורי) ו-ML (מדיאלי-לרוחבי) על ידי לחיצה על הכפתורים בצג.
   24. העבר את צינורית ההנחיה לקואורדינטות שנקבעו מראש.
       הערה: עבור קנולציה של החדר הצדדי הימני בחולדה בוגרת של 300-350 גרם, נעשה שימוש בקואורדינטות הבאות: -0.7 מ"מ AP, -1.4 מ"מ ML ו-4.00 מ"מ DV (באורך זהה לצינורית המנחה).
   25. סמן את מיקום הצינורית הסופי על ידי צביעת קצה הצינורית באמצעות עט הסימון ולאחר מכן הורדתו למשטח הגולגולת כדי לגעת ולסמן את המיקום.
   26. קדחו חור בקוטר 2.3 מ"מ עבור צינורית ההנחיה 22 G על ידי החזקת פיר המקדחה במצב אנכי ישר, כלומר בזווית של 90° לגולל. היזהר לנוע לאט ובהדרגה עמוק יותר לתוך הגולגולת, כלומר הימנע מקידוח ברקמת המוח.
       הערה: במידת הצורך, הורד את הצינורית לתוך החור באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית הניידת כדי לבדוק אם ניתן למקם את הצינורית בהצלחה או אם נדרש קידוח נוסף.
   27. לאחר שהצינורית הונמכה למוח, הרם אותה בחזרה למעלה, מרח בזהירות דבק סופר על החלק התחתון של הדום הפלסטי של הצינורית והורד את הצינורית בחזרה לתוך החור באמצעות הזרוע הניידת של המסגרת הסטריאוטקסית.
   28. השאירו במקום כדי לאפשר לדבק להתייצב.
   29. בזמן ההמתנה, מערבבים ממס דנטלי ואבקה (ראה טבלת חומרים) בסירת שקילה. יוצקים אבקת מלט דנטלי לתוך סירת השקילה, השתמשו במזרק של 1 מ"ל כדי להוסיף ~300 מיקרוליטר של ממס, וערבבו באמצעות אותו מזרק עד שהוא מסמיך ובעל עקביות שמישה. במידת הצורך, הוסף עוד אבקה כדי להגביר את הצמיגות או יותר ממס כדי להפחית את הצמיגות.
   30. שחרר את הצינורית ממחזיק הצינורית באמצעות הבורג הייעודי והרם בזהירות את הזרוע.
       הערה: יש להדביק את הצינורית לגולגולת בזווית של 90 מעלות.
   31. מרחו את המלט הדנטלי הטרי על הגולגולת החשופה על ידי משיכתו למזרק חד פעמי של 1 מ"ל ומריחתו סביב הצינורית. הימנע מכל מלט דנטלי על העור או פתח הצינורית. תן לו להתייצב למספר שניות, תלוי בעקביותו.
   32. כאשר המלט הדנטלי הופך עבה יותר, השתמש במרית כדי למרוח יותר מלט דנטלי וליצור את תושבת הראש הסופית המכסה את הבורג לחלוטין.
       הערה: היזהר לא לכסות יותר מדי מהצינורית כך שעדיין ניתן יהיה להבריג את צינורית הדמה. הסר עודפי מלט דנטלי מהעור.
   33. הכנס צינורית דמה סטרילית לאחר שהמלט הדנטלי יבש ומוצק.
   34. כבה את האיזופלורן, שחרר את מוטות האוזניים, הסר את החולדה מהמסגרת והנח אותה בתיבת ההתאוששות.
   35. לאחר שהחיה התאוששה ~15-30 דקות, אחסנו אותה בקופסת דיור נקייה.
       הערה: לאחר הניתוח, חולדות צריכות להיות בבית יחיד. שקול להחליף צמרות כלוב רשת סטנדרטיות שבהן קופסת המזון יורדת לתוך הכלוב בצמרות כלובי רשת ייעודיות מוגבהות כדי למזער את הסיכון להפרעה לתושבת הראש. לחלופין, חסום את כל חלקי הכלוב הנמוכים בהרבה מגובה הגידול של החיה.
   36. מלא את רשימת הניטור ונטר בהתאם להנחיות הניטור המפורטות בפרוטוקול.
       הערה: שקול להניח כמה כדורי מזון על הרצפה להגעה קלה יותר. אם זה לא מפריע לניסוי, ניתן לספק הקלה נוספת בכאב במזון מתוק כדי להחליף זריקות נוספות לאחר הניתוח, למשל, בופרנורפין מעורבב עם רסק שוקולד אגוזים מתוק 35,36,37. במקרה זה, חלק מאותו מתוק ניתן כפרס לפני ואחרי הניתוח כדי למנוע ניאופוביה ממזון בעת הצעת שיכוך כאבים. ניתן לספק את משחת האגוזים על סרט המחובר לקיר הכלוב.
   37. הצטיידו יותר צינוריות דמה מאשר צינוריות מנחות או צינוריות הזרקה, מכיוון שהן עלולות ללכת לאיבוד בין מצעי כלוב החיות אם הן נופלות בטעות. במקרה של אירוע כזה, החלף את הצינורית בצינורית דמה חדשה וסטרילית.

2. זריקות ICV

1. הכן את התרופה והרכב, למשל, 30 מ"ג/מ"ל של פולימיקסין B (ראה טבלת חומרים) בתמיסת מלח סטרילית של 0.9%. שמור על נפח ההזרקה בין 5-10 מיקרוליטר בחולדות בוגרות עם משקל גוף שנע בין 300-400 גרם.
2. לפחות 24 שעות לאחר הניתוח, שקלו את החולדה והעבירו אותה לחדר ההליכים.
3. חשב את נפח ההזרקה באמצעות משקל גוף החולדה.
4. הסר את מכסה הכלוב ופתח את צינורית הדמה.
   הערה: חולדות בדרך כלל יושבות בשקט כאשר הן מחזיקות אותן בעדינות בכלוב שלהן ואינן זקוקות לריסון. ניתן להשתמש במגבת תה לחולדה סקרנית או עצבנית או לדגדוג של עצמות הלחיים.
5. להזרקת בולוס, חבר צינורות PE-50 (ראה טבלת חומרים) באורך של לפחות 40 ס"מ למזרק אטום לגז של 10 מיקרוליטר על ידי משיכת קצה אחד של הצינור מעל המחט הקבועה או הניתנת להסרה במזרק והקפדה על אטימה הדוקה. חבר את צינורית המזרק המותאמת בקצה השני של הצינור.
   1. ערוך את הכמות הנדרשת דרך הצינורית. הכנס את הצינורית למכוון עד להתקנה והזרק. לאחר הזרקת כל הנוזלים, החזק את בוכנת המזרק במקומה למשך דקה נוספת לפחות כדי למנוע זרימה חוזרת.
6. לקצב אספקה איטי יותר, הזריק את התרופות באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה (ראה טבלת חומרים).
   1. ראשית, השתמש במים מסוננים ובמזרק חד פעמי של 1 מ"ל עם מחט משיכה של 23 גרם כדי למלא את צינור PE-50 במלואו. לאחר מכן הסר את המזרק החד פעמי ממחט הציור והחלף אותו במיקרו-מזרק.
   2. משוך לאחור 1-3 מיקרוליטר כדי ליצור בועת אוויר קטנה אך גלויה. לאחר מכן, ערכו את הכמות הנדרשת של תרופות. לחלופין, סמן את בועת האוויר בטוש כדי לסייע בנראות זרימת התרופות. נעל את המזרק במקומו על המשאבה.
      הערה: ודא הגדרות נכונות עבור התרופה והציוד המשמשים, כלומר הגדר את מהירות האספקה ואת הקוטר הפנימי של המזרק המשמש בהתאם למדריך למשתמש.
7. לאחר הזרקת כל הנוזל, עצור את המשאבה אם היא לא נעצרת אוטומטית. השאר את המחט מוכנסת לפחות לדקה נוספת כדי למנוע זרימה חוזרת.
8. הסר לאט את צינורית המזרק והברג את צינורית המנחה.
9. נקה את הציוד על ידי משיכה ופליטה של אתנול ומי DI שלוש פעמים כל אחד.

3. CSF ודגימת רקמות

1. העבר את החולדה לחדר פרוצדורה.
2. הנח את החולדה בתא האינדוקציה וגרם להרדמה עם איזופלורן 5% בחמצן של 2 ליטר לדקה עד להאטה בנשימה (~ 5 דקות).
3. העבירו את החולדה למסגרת הסטריאוטקסית ושמרו על אותה רמה של הרדמה עמוקה דרך חרוט האף.
4. בדוק אם יש רפלקס דוושה. לאחר היעדרות, תקן את הגולגולת במסגרת באמצעות מוטות האוזניים.
   הערה: זו יכולה להיות מסגרת סטריאוטקסית פשוטה יותר ללא תצוגה, מוטות אוזניים מעוגלים או זרועות ניתנות להזזה. זהו הליך שאינו התאוששות; התכונה ההכרחית היחידה היא כל מוטות אוזניים של חולדה.
5. בעזרת חרוט האף, הטה את אף החולדה כלפי מטה בכ-45 מעלות כדי לחשוף את הצוואר למצב עבודה טוב.
6. בעזרת מספריים קטנים, קהים ומעוקלים, מיששו את הגולגולת ועברו לאחור לקצה הגולגולת. במצב זה, חותכים את שכבת השריר החיצונית ביותר ממש דרך קו האמצע של הצוואר, באורך של כ-2-3 ס"מ. חותכים בזהירות את כל שאר שכבות השרירים.
   1. השתמש במחזיר קפיץ קטן כדי להחזיק את הפצע פתוח ולאפשר ראות טובה. חותכים עד שקרום הבור נראה לעין. השתמש בקצה כותנה כדי לסייע בהסרה עדינה של עור נוסף.
7. אם מתרחש דימום, השתמש בגזה כדי לנקות ולעצור את הדימום.
8. במידת הצורך, השתמש ברצועות קטנות של רקמה מגולגלת והנח אותה סביב בור המים כדי למנוע מדם לזהם את ה-CSF.
   הערה: כדי לאשר את הצלחת ההזרקה באמצעות צבע, יש להזריק 2-3 מיקרוליטר של 1.1% צבע כחול אוונס (ראה טבלת חומרים) לחולדה המורדמת לפני איסוף CSF באמצעות הצינורית המותאמת ומזרק חד פעמי של 1 מ"ל.
9. כדי להכין את הכלי לחילוץ CSF, מלאו את המזרק ב~500 מיקרוליטר מים מסוננים, חברו מחט ציור של 23 גרם ומשכו את הצינור מעל המחט. חבר פיפטת זכוכית משוכה לקצה השני של הצינור.
10. כדי לחלץ CSF, הכנס לאט את הפיפטה הנמשכת לתוך בור המים החשוף.
    הערה: CSF יזרום לאט ופסיבי לתוך הפיפטה ויימשך באופן פעיל באמצעות המזרק. אם הצבע מוזרק, ה-CSF יהיה בצבע כחול (איור 1).
11. הוסף את ה- CSF לתוך צינור מסומן והניח אותו מיד על קרח יבש. לאחר מכן ניתן לאחסן CSF בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
12. אסוף כל רקמה אחרת מעניינת לניתוח. עבור פלזמה, אסוף לפחות 3 מ"ל דם לבבי.
    1. הניחו את החולדה המורדמת עמוק על גבה ופתחו את חלל החזה כדי לחשוף את הלב. השתמש בהמוסטט כדי להדק את כלוב הצלעות ולהניח אותו על גרונו של בעל החיים כדי לסייע בנראות. השתמש במלקחיים עם ווים כדי להחזיק את החדר הימני והכנס מזרק חד פעמי של 5 מ"ל עם מחט 18 גרם לחדר השמאלי במקביל למחיצה. משוך לאט את הדם למזרק. לאחר שנאספו 3-5 מ"ל דם, הוציאו את המחט מהלב.
13. מוציאים את המחט מהמזרק ומניחים אותה בכלי חד. העבירו את הדם לצינורות הפריניים וסובבו בטמפרטורה של 2,739 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני איסוף הסופרנטנט עם פיפטה של 200 מיקרוליטר והקפאה מהירה על קרח יבש.
14. המתת חסד של החולדה על ידי הסרת הלב במספריים. כבה את אספקת האיזופלורן.
15. אסוף כל איבר בטני אחר שמעניין אותו, כגון הכליה או הטחול. זהה את האיבר, החזק את האיבר המעניין בעזרת מלקחיים רקמות עם ווים, הרם אותו וחתוך את כל החיבורים. הנח את האיבר בצינור מסומן והקפיא בהצמדה על קרח יבש.
16. כדי להסיר את המוח, ערפו את ראשו של בעל החיים בעזרת מספריים חדים וגדולים על ידי חיתוך בבסיס הגולגולת. משוך את תושבת הראש ביד. חותכים את העור שנותר המכסה את הגולגולת.
17. בעזרת מספריים דיסקטור, חותכים את הגולגולת בקו האמצע מהבסיס ללמבדה, כלומר חותכים את העצם העל-עורפית לשניים. השתמש בהמוסטט כדי לתפוס חצי ולהרחיק אותו. חזור על הצד השני כדי לחשוף את המוח הקטן במלואו.
18. המשך לחתוך לאורך התפר הסגיטלי עד לעצם הקדמית. השתמש בהמוסטט כדי לסלק כל אחת מהעצמות הקודקודיות. במידת הצורך, חתוך עוד יותר את העצם הקדמית והסר עוד עצם כדי לחשוף את נורות הריח.
19. החזיקו את הראש הפוך וחטטו בזהירות את המוח בעזרת מרית, ונתקו אותו מהעצבים האופטיים והטריגמינליים על ידי ניתוקם עם המרית. אספו את המוח לתוך שפופרת והקפיא על קרח יבש.
20. חדרי המוח יוכתמו בכחול אם הצבע מוזרק. השתמשו בלהב חד-פעמי כדי לחתוך את המוח באתר ההזרקה (איור 2A,B) ו~1 ס"מ אחורי (איור 2C) כדי לחקור את התפלגות הצבע בחדרים.
21. כדי להסיר את חוט השדרה, חשוף את עמוד השדרה על ידי חיתוך העור לאורך קו האמצע של פני הגב של החולדה. כרתו את עמוד החוליות על ידי ביצוע חתך דו צדדי סביבו וחיתוך רוחבי בקצה הזנב של חוט השדרה המותני.
22. חותכים את הלמינה דו צדדית לאורך העמוד בעזרת מספריים עד לחשיפת חוט השדרה כולו. הרם את חוט השדרה מקצה אחד, למשל, הקצה הרוסטרלי, וחלץ אותו על ידי פיצול עצבי עמוד השדרה בכיוון זנב עד שכל העצבים נחתכים. אסוף את חוט השדרה לתוך צינור והקפיא על קרח יבש.
    הערה: שקלו את כל הצינורות לפני ואחרי איסוף האיברים לניתוח נתונים. במידת הצורך והמתאים, ניתן לשטוף את מערכת החדרים לאחר איסוף CSF ולפני איסוף המוח כדי להסיר שאריות תרופות בתאי החדר. השתמש במזרק של 1 מ"ל מלא במי מלח המחוברים לצינור ובצינורית מזרק והכנס אותו לתוך צינורית ההנחיה. יש להזריק 2-3 מ"ל מי מלח. מי המלח צריכים לצאת מהפתח בבור המים. ניתן לעשות שימוש חוזר בצינוריות מדריך, צינוריות דמה וברגים על ידי השרייתם באצטון למשך 24 שעות, ולאחר מכן השרייה וניקוי עם חומר ניקוי רפואי ומים. לאחר הייבוש, ניתן להסיר שאריות מלט דנטלי באמצעות מלקחיים עדינים.

תוצאות

הפרוטוקול הניתוחי שהוצג מוצלח ביותר, כאשר מנתחים מיומנים הגיעו לשיעור הישרדות של >99.8% ובעלי חיים הראו משקל גוף יציב לאחר הניתוח ביום הראשון, בהשוואה למשקל שלהם לפני הניתוח ביום 0 (ממוצע ± SD של 315.8 גרם ±-42.1 גרם ליום 0 ו-314.1 גרם ±-43.0 גרם ליום הראשון, איור 3).

Discussion

חוקרים וקלינאים משתמשים בזריקות ICV כדי לעקוף את מנגנון ההגנה של ה-BBB ולהעביר תרופות ישירות למערכת העצבים המרכזית 12,18,19,21,24. העבודה הנוכחית היא פרוטוקול ICV שלם להעברת תרופות ביעילות ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Terumo, Japan	SS+01T
5 mL syringes	Terumo, Japan	SS+05S
Acetone	Merck, Germany	67641
Bench protector sheets	Halyard, USA	2765-C
Betadine	Mundipharma, Netherlands	1015695
Buprenorphine; Temgesic	Clifford Hallam Healthcare, Australia	1238366
Carprofen	Zoetis, Australia	10001132
Chlorhexidine	Tasman Chemicals, Australia	890401
Chux superwipes (or equivalent)	Chux, Australia	n/a	autoclaved
Clippers	n/a	n/a
Cotton swabs	LP Italiana, Italy	112191	autoclaved
Dental cement powder (Vertex Self cure powder)	Henry Schein, USA	VX-SC500GVD5
Dental cement solvent (Vertex Self cure liquid)	Henry Schein, USA	VX-SC250MLLQ
Disposable needles: 18 G, 26 G, 30 G	Terumo, Japan	NN+2525RL
Disposable surgical blades	Westlab, Australia	663-255
Dissector scissors	F.S.T.	14082-09
Dummy cannulas	Bio Scientific, Australia	C313DC/SPC	cut to 4.05 to fit the guide cannula
Ethanol 80%	Merck, Australia	10107
Evan's blue dye	Sigma	E2129 - 50G
Eye lube	Clifford Hallam Healthcare, Australia	2070491
Felt tip pen	Sharpie, USA	D-4236
Fibre optic light source	n/a	n/a
Flattened needle (18 G) or similar to apply superglue	n/a	n/a
Glass pipettes, pulled	Hirschmann Laborgeraete, Germany	9100175
Glass syringe 10 uL	Hamilton, USA	701 LT and 1701 LT
Guide cannulas	Bio Scientific, Australia	C313G/SPC	22 G, cut 4 mm below the pedestal for lateral ventricle cannulation in adult Sprague Dawley rats
Haemostat
Heat bead steriliser	Inotech, Switzerland	IS-250
Heat pad	n/a	n/a
Hydrogen peroxide 3%	Perrigo, Australia	11383
Induction chamber (Perspex 300 mm x 200 mm)	n/a	n/a
Injector cannula	Bio Scientific, Australia	C313I/SPC	cut to fit the 4 mm cannula + 0.5 mm projection
Isoflurane	Clifford Hallam Healthcare, Australia	2093803
Isoflurane vaporiser and appropriate scavenging system	n/a	n/a
Medium size weighing boats	n/a	n/a
Metal spatula	Met-App, Australia	n/a
Micro syringe pump	New Era, USA	NE-300
Microdrill	RWD Life Science Co, China	87001
Polymyxin B	Beta Pharma, China	86-40302
Protein LoBind tubes, 0.5 mL	Eppendorf, Germany	Z666491
Ropivacaine 1%; Naropin	AstraZeneca, UK	PS09634
Scissors, large	F.S.T.	14511-15
Scissors, small	F.S.T.	14079-10
Screwdriver	n/a	n/a
Screws	Mr. Specs, Australia	n/a
Stereotaxic frame	RWD Life Science Co, China	n/a	Necessary components: rat ear bars, tooth bar, anaesthesia nose cone, arm with digital readout (X, Y, Z) and cannula holder
Sterile saline 0.9%	Baxter, USA	AHB1323
Super etch (37% phosphoric acid) gel	SDI Limited, Australia	8100045
Superglue	UHU, Germany	n/a
Tissue forceps with hooks	F.S.T.	11027-12
Tubing, PE-50	Bio Scientific, Australia	C313CT