JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Terapötiklerin doğrudan merkezi sinir sistemine verilmesi, kan-beyin bariyerini aşmanın bir yoludur. Bu protokol, beyin omurilik sıvısı ve vücut organlarının daha sonra toplanması için intraserebroventriküler enjeksiyonu göstermektedir. Bu, yeni tedaviler geliştirmek için hayvan modellerinde ilaç farmakokinetiği ve farmakodinamiğinin araştırılmasını kolaylaştırır.

Özet

Kan-beyin bariyeri (BBB) beyni yabancı cisimlerden korusa da, bazı terapötiklerin hastalıkları veya enfeksiyonları iyileştirmek için merkezi sinir sistemine (CNS) geçmesini de önler. İlaçlar, BBB'yi atlatmak için hayvanlarda ve insanlarda doğrudan CNS'ye uygulanır. Mevcut protokol, antibiyotiklerin, yani polimiksinlerin, çoklu ilaca dirençli Gram-negatif bakterileri tedavi etmek için son basamak antibiyotiklerin intraventriküler verilmesi yoluyla beyin enfeksiyonlarını tedavi etmenin benzersiz bir yolunu açıklamaktadır. Sıçanlarda lateral ventriküle ulaşan bir kılavuz kanül implante etmek için basit bir stereotaksik cerrahi protokolü geliştirilmiştir. 24 saatlik bir iyileşme periyodundan sonra, sıçanlara kılavuza takılan bir kanül aracılığıyla bilinçli ve tekrar tekrar enjekte edilebilir. Enjeksiyonlar, yavaş ve kontrollü bir akış hızı elde etmek için bir mikroenjeksiyon pompası kullanılarak bolus veya infüzyon olarak manuel olarak verilebilir. İntraventriküler enjeksiyon Evans Blue boyası ile başarılı bir şekilde doğrulandı. Beyin omurilik sıvısı (BOS) boşaltılabilir, beyin ve diğer organlar toplanabilir. Bu yaklaşım, CNS'ye ilaç dağıtımını ve daha sonra farmakokinetik ve farmakodinamik aktivitenin değerlendirilmesini içeren çalışmalar için oldukça uygundur.

Giriş

Kan-beyin bariyeri (BBB), merkezi sinir sistemi (CNS) için çok önemli bir koruyucu mekanizmadır. Seçici olarak geçirgen, anatomik bariyer, dolaşımdaki kanı ve çözünen maddelerini beynin hücre dışı sıvısından ayırır, böylece çoğu molekülün beynegirmesini önler 1,2,3,4, boyutlarına, lipofiliksitelerine5 ve aktif bir taşıma mekanizmasınınmevcudiyetine bağlı olarak 2.

Bu koruyucu bariyer, karmaşık beyin homeostazının ve CNS sağlığının etkili bir şekilde düzenlenmesi için faydalıdır 4,6. Bununla birlikte, beyindeki enfeksiyonları veya diğer CNS hastalıklarını tedavi etmek için ilaçların verilmesini de zorlaştırır 4,7. Çeşitli yöntemler kullanarak BBB'yi bozmanınyanı sıra 8,9, BBB'yi atlatmak için birincil yaklaşım, bir ilacı beyin omurilik sıvısına (BOS) salarak doğrudan beyne vermektir4. Nispeten invaziv bir uygulama olmasına rağmen, hastalara ve laboratuvar hayvanlarına hedefe yönelik terapötikler sunmak için başarıyla kullanılmıştır. İnsanlarda, ilaçlar intraventriküler sisteme veya BOS'a verilebilir ve daha sonra lateral ventriküle yerleştirilen bir katetere bağlı, kafa derisinin altında bulunan bir rezervuar olan Ommaya rezervuarı kullanılarak örneklenebilir10,11. Eşdeğer hedeflere ulaşmak için kemirgenler gibi laboratuvar hayvanlarında da benzer teknikler kurulmuştur. Mikro-ozmotik pompalar, ventriküler sisteme veya beyin parankimine sürekli ilaç verilmesi için farelere 12,13,14,15 ve sıçanlara16,17 implante edildi. Ek olarak, anestezi uygulanmış farelerde tek kullanımlık bir iğne18,19 ve bilinçli sıçanlarda cerrahi olarak implante edilmiş bir kanül20,21,22,23 kullanılarak doğrudan intraserebroventriküler enjeksiyonlar gerçekleştirildi. CNS'ye ilaç dağıtımı, çeşitli alanlarda anlayışı geliştirmek için paha biçilmez bir yöntem olmuştur 20,24,25,26,27,28.

CNS enfeksiyonları, acilen yeni terapötiklere ve mevcut anti-enfektif tedavilerin daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç duyan bir alandır. Çoklu ilaca dirençli Gram-negatif bakterilerin neden olduğu CNS Enfeksiyonları özellikle7 ile ilgilidir. Polimiksinler, bu 'süper böcekler' nedeniyle enfeksiyonları tedavi etmek için giderek daha fazla kullanılan son basamak antibiyotiklerdir29. Polimiksinler mevcut dozlama kılavuzlarına30 göre intravenöz olarak uygulandığında, CNS'ye penetrasyonları çok düşüktür, daha yüksek dozlar nefrotoksisite riskini artırır. Bu nedenle, intravenöz polimiksin tedavisi, CNS enfeksiyonlarını tedavi etmek için çok az kullanılır7. Polimiksinlerin CNS'ye verilmesi için güvenli ve etkili bir dozaj rejimi oluşturmak, karşılanmamış acil bir tıbbi ihtiyaçtır 31,32,33. Bu nedenle, mevcut protokol oluşturulmuştur ve antibiyotiklerin doğrudan sıçanların BOS'una enjekte edilmesine odaklanarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, nörotoksik olmayan ve terapötik konsantrasyonların küçük hacimlerde uygulanabildiği herhangi bir ilacı uygulamak için kullanılabilir (ör., sıçanlarda 10 μL'ye kadar). Açıklanan teknikler, farklı beyin bölgelerini hedeflemek ve çoklu enjeksiyonlar yapmak için de değiştirilebilir.

Mevcut protokol, ilaçların ICV uygulaması sonrası etkili farmakokinetiği ve dağıtımına izin veren basit bir cerrahi ve enjeksiyon tekniği sunmaktadır. Ameliyat, bir kılavuz kanülün implante edilmesini içerir. Mikro-ozmotik pompa 12,13,14,15,16,17 implantasyonundan daha az invaziv bir prosedür olduğundan, bu, ilaçların BOS'a kısa süreli uygulanması için uygun gelişmiş bir seçenektir. Bu protokol basitleştirilmiştir ve ameliyattan 24 saat sonra çok yüksek sağkalım oranları ve stabil vücut ağırlıkları üretebilir, bu da mevcut yöntemlere kıyasla bir gelişmedir34. Ameliyattan sonra, bilinçli sıçanlara ya manuel bolus ICV enjeksiyonu yapıldı ya da pik plazma konsantrasyonlarını düşürmek için bir mikropompa kullanılarak daha yavaş doğum yapıldı. Aynı zamanda kafeslerinde özgürce hareket edebiliyorlardı. Güvenli ve etkili ilaç dozaj rejimleri oluşturmak için, daha sonra intraserebroventriküler (ICV) uygulamayı takiben farmakokinetiği ve ilaç dağılımını incelemek için BOS, beyin, omurilik, böbrek, plazma vb. örnekleri kullanıldı. İlaç dağılımı, örneğin immünohistokimya veya matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon kütle spektrometresi görüntüleme (MALDI-MSI) kullanılarak görsel olarak da araştırılabilir. Gerekirse, örneğin her iki hemisfere tek taraflı olarak dağıtılacak ilaçları enjekte etmek için iki taraflı bir kanül implante edilebilir.

Protokol

Tüm deneyler, hayvanların bilimsel amaçlarla bakımı ve kullanımı için Avustralya yasasına uygun olarak yapılmıştır. Deneyler Melbourne Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylandı (uygulama #1914890). Deneyler için 8-14 haftalık erkek ve dişi Sprague-Dawley cinsi sıçanlar kullanıldı.

1. Lateral ventrikül kanülasyonu için stereotaksik cerrahi

  1. Ameliyat sırasında otoklavlanmış pamuklu uçlar ve cerrahi örtüler kullanın.
  2. Ameliyat için aşağıdakileri ayarlayın.
    1. Stereotaksik çerçeve, anestezi uygulama sistemi, ilaçlar, kimyasallar ve yardımcı malzemeler kurun (Malzeme Tablosuna bakınız). Stereotaksik çerçeveyi, fiber optik ışık kaynağını, el matkabını vb. %80 etanol ile temizleyin.
    2. 22 G kılavuz kanülü ve ilgili sahte kanülü ( Malzeme Tablosuna bakınız) sterilizasyon için %80 etanole batırın.
      NOT: Üretici, 22 G kılavuzu ve kukla kanülü kaidenin altında ~4 mm uzunluğa kadar önceden kesti.
    3. Cerrahi aletleri ( Malzeme Tablosuna bakınız) ısı boncuklu sterilizatörü kullanarak 20 saniye sterilize edin ve ardından %80 etanol püskürtün. Sterilize edilmiş aletleri steril örtünün üzerine yerleştirin.
    4. Kutunun yarısı bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirilmiş bir kurtarma kutusu (bir alt ped ile kaplı bir sıçan muhafaza kutusu) hazırlayın.
  3. Ameliyatı gerçekleştirin.
    1. Etanol ile temizlenmiş 22 G kılavuz kanülü stereotaksik çerçeve üzerindeki kanül tutucusuna vidalayın.
    2. Fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin (300 mm x 200 mm, Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 L / dk oksijende% 5 izofluran ile anestezi indükleyin.
    3. Sıçan derin bir şekilde uyuşturulduktan sonra (pedal refleksi yok), sıçanı stereotaksik çerçeveye getirin ve burun konisi boyunca bakım için izofluranı 1 L / dk oksijende% 2 -% 3'e düşürün. Dişleri ısırma çubuğuna asın ve burun konisini dikkatlice burnun üzerine çekin - güvenli olup olmadığını kontrol etmek için fareyi nazikçe geri çekin.
    4. Kurumasını önlemek için her iki gözünüze de koruyucu göz yağı sürün.
    5. Ağrı yönetimi ve ameliyat sonrası iyileşmeye yardımcı olmak için salin içinde Carprofen (5 mg / kg), Buprenorfin (0.05 mg / kg) ve deri altına 3 mL salin (sc) enjekte edin.
    6. Pedal refleksini kontrol etmek için ayak parmaklarınızı sıkıştırın. Bir kez yokken, farenin kafatasını çerçeveye sabitleyin. Bir kulak çubuğunu kulak kanalına yerleştirin ve sıkın. Diğer tarafta tekrarlayın.
    7. Kulak çubuklarında verilen numaraların her iki tarafta da eşit olduğundan emin olmak için kulak çubuklarını yanlamasına hareket ettirin. Kafatasına bastırırken baş hareket etmemelidir.
    8. Başın üst kısmını bir makasla tıraş edin. Saçı bir mendil ve tuzlu su ile silin. Gerekirse, kurumasını önlemek için her iki göze de göz yağını yeniden uygulayın.
    9. Her adım için steril pamuklu çubuklar kullanarak kafa derisini% 4 klorheksidin ve alkollü cilt hazırlama solüsyonu ile temizleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Kafatasının ortasından başlayın ve tüm yüzey temizlenene kadar dışa doğru daireler çizerek hareket edin.
    10. Amaçlanan insizyon bölgesi boyunca ~ 150 μL Ropivakain (% 1) sc (Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte edin.
    11. Başın orta hattı boyunca, gözlerin arasından kafatasının tabanına kadar 10-15 mm'lik bir kesi yapmak için neşter bıçağını kullanın.
    12. Bağ dokusunu kazımak ve kafatasını ortaya çıkarmak için pamuk uçları ve neşteri kullanın.
    13. Steril bir pamuk ucunu% 3'lük bir hidrojen peroksit çözeltisine batırın ve kafatasının yüzeyine uygulayın. Kimyasalın cilt ile reaksiyona girmesi için 5 saniye bekleyin ve ardından alanı kuru bir pamuklu uçla temizleyin.
    14. İkinci kez% 3 hidrojen peroksit uygulayın. Bu, kafatasının dikiş hatlarının daha net görünmesini sağlayacaktır. Kimyasalın cilt ile reaksiyona girmesi için 10 saniye bekleyin ve ardından alanı kuru bir pamuklu uçla temizleyin. Tuzlu su ile yıkayın ve temiz bir pamuk uçla kurulayın.
    15. Pamuklu bir uca az miktarda Süper aşındırma jeli dikkatlice uygulayın ve ardından kafatasının yüzeyine uygulayın. Bu, diş çimentosunun yapışması için daha gözenekli bir yüzey oluşturur.
    16. Süper aşındırıcıyı yıkamak için kafatasına bol miktarda salin uygulayın ve temiz bir pamuklu uçla kurulayın.
    17. Bregma'yı tanımlayın ve keçeli kalemi kullanarak işaretleyin.
    18. Ankraj vidası için kılavuz kanülün yerleştirilmesini engellemeyecek bir noktaya bir girinti delin.
      NOT: Sağ lateral ventrikül kanüllü ise, sol hemisferde ve ventriküle göre arkada delin.
    19. Matkabı kafatasına ~ 75 ° -80 ° açıyla tutun ve kafatasının kalınlığının yaklaşık yarısı kadar bir derinliğe sahip bir girintiyi yavaşça delin. Kemik tozunu silmek için pamuklu bir uçta tuzlu su kullanın.
    20. Vidayı, forseps ile girintiden sıkıca tutarak ve tornavidayla kafatasına vidalayarak, kafatasının kırılmasını önleyerek dikkatlice yerleştirin. Her tam dönüşten sonra vidanın sıkıca oturup oturmadığını test edin.
    21. Kafatasının düz olduğunu onaylayın. Çerçevenin hareketli kollarını kullanarak, kılavuz kanülü bregmada kafatasına dokunacak şekilde konumlandırın. Çerçeve kontrol monitöründeki düğmeye basarak Z düzlemi koordinatlarını temsil eden DV'yi (dorsal-ventral) sıfırlayın.
    22. Çerçevenin hareketli kollarını kullanarak kılavuz kanülü (22 G ve 4 mm uzunluğunda) kaldırın ve lambdaya hareket ettirin. Kafatasının yüzeyine değecek şekilde indirin ve DV ekranına tekrar dikkat edin.
      NOT: Bregma'daki DV ile lambda'daki DV arasındaki fark 0,2 mm'den az olmalıdır. Gerekirse, burun konisini buna göre ayarlayın, yani farenin kafasını gerektiği gibi yukarı veya aşağı hareket ettirin ve ölçümleri tekrarlayın.
    23. Monitördeki düğmelere basarak bregmaya dokunmak ve üç koordinatı da yeniden sıfırlamak için kılavuz kanülü geri hareket ettirin: DV, AP (ön-arka) ve ML (medial-yanal).
    24. Kılavuz kanülü önceden belirlenmiş tercih edilen koordinatlara taşıyın.
      NOT: 300-350 g yetişkin bir sıçanda sağ lateral ventrikülün kanülasyonu için aşağıdaki koordinatlar kullanıldı: -0.7 mm AP, -1.4 mm ML ve -4.00 mm DV (kılavuz kanül ile aynı uzunlukta).
    25. Marker kalemi kullanarak kanülün ucunu renklendirerek ve ardından pozisyona dokunmak ve işaretlemek için kafatası yüzeyine indirerek son kanül pozisyonunu işaretleyin.
    26. Matkap milini düz bir dikey konumda, yani kürekçiye 2.3°'lik bir açıyla tutarak 22 G kılavuz kanül için 90 mm çapında bir delik açın. Kafatasının içine yavaş ve aşamalı olarak daha derine inmeye dikkat edin, yani beyin dokusunu delmekten kaçının.
      NOT: Gerekirse, kanülün başarılı bir şekilde yerleştirilip yerleştirilemeyeceğini veya daha fazla delme gerekip gerekmediğini test etmek için mobil stereotaksik kolu kullanarak kanülü deliğe indirin.
    27. Kanül beyne indirildikten sonra, tekrar yukarı kaldırın, kanülün plastik kaidesinin alt tarafına dikkatlice süper yapıştırıcı uygulayın ve stereotaksik çerçevenin hareketli kolunu kullanarak kanülü tekrar deliğe indirin.
    28. Yapıştırıcının sertleşmesine izin vermek için yerinde bırakın.
    29. Beklerken, diş çözücüsü ve tozu ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir tartı teknesinde karıştırın. Diş çimentosu tozunu tartı teknesine dökün, ~ 300 μL çözücü eklemek için 1 mL'lik bir şırınga kullanın ve aynı şırıngayı koyulaşana ve kullanılabilir bir kıvama gelene kadar karıştırın. Gerekirse, viskoziteyi artırmak için daha fazla toz veya viskoziteyi azaltmak için daha fazla çözücü ekleyin.
    30. Özel vidayı kullanarak kanülü kanül tutucusundan çıkarın ve kolu dikkatlice kaldırın.
      NOT: Kanül kafatasına 90° açıyla yapıştırılmalıdır.
    31. Taze diş çimentosunu tek kullanımlık 1 mL şırıngaya çekerek ve kanülün etrafına uygulayarak açıkta kalan kafatasına uygulayın. Ciltte veya kanül açıklığında herhangi bir diş çimentosundan kaçının. Kıvamına bağlı olarak birkaç saniye kurumasına izin verin.
    32. Diş çimentosu kalınlaştığında, daha fazla diş çimentosu uygulamak için bir spatula kullanın ve vidayı tamamen kaplayan son kafa montajını oluşturun.
      NOT: Kukla kanülün hala vidalanabilmesi için kanülün çok fazla kaplamamasına dikkat edin. Ciltteki fazla diş çimentosunu çıkarın.
    33. Diş çimentosu kuruduktan ve sertleştikten sonra steril bir kukla kanül yerleştirin.
    34. İzofluranı kapatın, kulak çubuklarını serbest bırakın, fareyi çerçeveden çıkarın ve kurtarma kutusuna yerleştirin.
    35. Hayvan ~ 15-30 dakika iyileştikten sonra, temiz bir muhafaza kutusuna koyun.
      NOT: Ameliyattan sonra, farelerin tek evde olması gerekir. Kafa montajına müdahale riskini en aza indirmek için, yiyecek hunisinin kafese indiği standart ızgara kafes üstlerini, özel yüksek yükseltilmiş ızgara kafes üstleriyle değiştirmeyi düşünün. Alternatif olarak, kafesin hayvanın yetiştirme yüksekliğinden çok daha düşük olan kısımlarını kapatın.
    36. İzleme kontrol listesini doldurun ve protokolde belirtilen izleme yönergelerine göre izleyin.
      NOT: Daha kolay ulaşmak için yere bazı yiyecek peletleri koymayı düşünün. Deneye müdahale etmezse, ameliyat sonrası ek sc enjeksiyonlarının yerini almak için tatlı yiyeceklerde ek ağrı kesici sağlanabilir, örneğin, tatlı fındıklı çikolata macunu 35,36,37 ile karıştırılmış Buprenorfin. Bu durumda, ağrı kesici sunarken gıda neofobisini önlemek için ameliyattan önce ve sonra aynı tatlının bir kısmı ödül olarak sağlandı. Somun macunu, kafes duvarına tutturulmuş bant üzerinde sağlanabilir.
    37. Kılavuz kanüllerden veya enjeksiyon kanüllerinden daha fazla sahte kanül stoklayın, çünkü yanlışlıkla çıkarlarsa hayvan kafesi yatakları arasında kaybolabilirler. Böyle bir durumda, kanülü yeni, steril bir kukla kanül ile değiştirin.

2. ICV enjeksiyonları

  1. İlacı ve aracı hazırlayın, ör.% 0.9 steril salin içinde 30 mg / mL Polimiksin B ( Malzeme Tablosuna bakınız). Vücut ağırlığı 300-400 g arasında değişen yetişkin sıçanlarda enjeksiyon hacmini 5-10 μL arasında tutun.
  2. Ameliyattan en az 24 saat sonra, fareyi tartın ve işlem odasına taşıyın.
  3. Sıçan vücut ağırlığını kullanarak enjeksiyon hacmini hesaplayın.
  4. Kafes kapağını çıkarın ve kukla kanülü sökün.
    NOT: Sıçanlar genellikle onları kafeslerinde nazikçe tutarken hareketsiz otururlar ve kısıtlamaya ihtiyaç duymazlar. Meraklı veya gergin bir sıçan veya elmacık kemiklerinin gıdıklanması için bir çay havlusu kullanılabilir.
  5. Bolus enjeksiyonu için, en az 40 cm uzunluğundaki PE-50 borusunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 10 μL'lik gaz geçirmez bir mikroşırıngaya, borunun bir ucunu şırınga üzerindeki sabit veya çıkarılabilir iğnenin üzerinden çekerek ve sıkı bir sızdırmazlık sağlayarak takın. Takılı enjektör kanülünü borunun diğer ucuna takın.
    1. Kanül ile gerekli miktarı çizin. Kanülü takılana kadar kılavuza yerleştirin ve enjekte edin. Tüm sıvı enjekte edildikten sonra, geri akışı önlemek için şırınga pistonunu en az bir dakika daha yerinde tutun.
  6. Daha yavaş bir teslimat oranı için, ilaçları bir mikroenjeksiyon pompası kullanarak enjekte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. İlk olarak, PE-50 hortumunu tamamen doldurmak için filtrelenmiş su ve 23 G'lık çekme iğneli tek kullanımlık 1 mL şırınga kullanın. Daha sonra tek kullanımlık şırıngayı çekme iğnesinden çıkarın ve mikroşırınga ile değiştirin.
    2. Küçük ama görünür bir hava kabarcığı oluşturmak için 1-3 μL geri çekin. Ardından, gerekli miktarda ilaç hazırlayın. İsteğe bağlı olarak, ilaç akışının görünürlüğüne yardımcı olmak için hava kabarcığını bir işaretleyici ile işaretleyin. Şırıngayı pompadaki yerine kilitleyin.
      NOT: Kullanılan ilaç ve ekipman için ayarların doğru olduğundan emin olun, yani kullanım kılavuzuna göre kullanılan şırınganın uygulama hızını ve iç çapını ayarlayın.
  7. Tüm sıvı enjekte edildikten sonra, otomatik olarak durmazsa pompayı durdurun. Geri akışı önlemek için iğneyi en az bir dakika daha takılı bırakın.
  8. Enjektör kanülünü yavaşça çıkarın ve kılavuz kanülü vidalayın.
  9. Etanol ve DI suyunu her biri üç kez çekip çıkararak ekipmanı temizleyin.

3. BOS ve doku örneklemesi

  1. Fareyi bir prosedür odasına taşıyın.
  2. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve solunum yavaşlayana kadar (~ 5 dakika) 2 L / dk oksijende% 5 izofluran ile anestezi indükleyin.
  3. Fareyi stereotaksik çerçeveye taşıyın ve burun konisi boyunca aynı derin anestezi seviyesini koruyun.
  4. Pedal refleksini kontrol edin. Yoksa, kulak çubuklarını kullanarak kafatasını çerçeveye sabitleyin.
    NOT: Bu, ekranı, yuvarlak kulak çubukları veya hareketli kolları olmayan daha basit bir stereotaksik çerçeve olabilir. Bu bir kurtarma dışı prosedürdür; Gerekli olan tek özellik, herhangi bir sıçan kulak çubuğudur.
  5. Burun konisini kullanarak, boynu iyi bir çalışma pozisyonuna getirmek için farenin burnunu yaklaşık 45° aşağı doğru eğin.
  6. Küçük, künt, kavisli makas kullanarak kafatasını hissedin ve kafatasının sonuna doğru arkaya doğru hareket edin. Bu pozisyonda, en dıştaki kas tabakasını boynun orta hattından yaklaşık 2-3 cm uzunluğunda kesin. Diğer tüm kas katmanlarını dikkatlice kesin.
    1. Yarayı açık tutmak ve iyi bir görüş sağlamak için küçük bir yaylı ekartör kullanın. Cisterna magna zarı görünene kadar kesin. Daha fazla cildi nazikçe çıkarmaya yardımcı olması için pamuklu bir uç kullanın.
  7. Kanama olursa, kanamayı temizlemek ve durdurmak için gazlı bez kullanın.
  8. Gerekirse, herhangi bir kanın BOS'u kirletmesini önlemek için küçük rulo doku şeritleri kullanın ve cisterna magna'nın etrafına yerleştirin.
    NOT: Boya kullanılarak enjeksiyonun başarısını doğrulamak için, takılı kanül ve tek kullanımlık 1 mL şırınga kullanarak BOS toplamadan önce anestezi uygulanmış sıçana 2-3 μL% 1.1 Evans Blue boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte edin.
  9. Aleti CSF'yi çıkarmaya hazırlamak için, şırıngayı ~ 500 μL filtrelenmiş su ile doldurun, 23 G'lik bir çekme iğnesi takın ve boruyu iğnenin üzerine çekin. Borunun diğer ucuna çekilmiş bir cam pipet takın.
  10. BOS'u çıkarmak için, çekilen pipeti yavaşça açıkta kalan cisterna magna'ya yerleştirin.
    NOT: BOS yavaş ve pasif bir şekilde pipete akacak ve şırınga kullanılarak aktif olarak çekilecektir. Boya enjekte edilirse, BOS mavi renkte olacaktır (Şekil 1).
  11. BOS'u etiketli bir tüpe ekleyin ve hemen kuru buzun üzerine yerleştirin. BOS daha sonra -80 °C'de saklanabilir.
  12. Analiz için ilgilenilen diğer dokuları toplayın. Plazma için en az 3 mL kardiyak kan toplayın.
    1. Derin anestezi uygulanmış fareyi sırt üstü yatırın ve kalbi ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunu açın. Göğüs kafesini klemplemek için bir kanama durdurucu kullanın ve görünürlüğe yardımcı olmak için hayvanın boğazına yerleştirin. Sağ ventrikülü tutmak için kancalı doku forsepsleri kullanın ve septuma paralel olarak sol ventriküle 18 G iğneli 5 mL tek kullanımlık bir şırınga yerleştirin. Şırınganın içine yavaşça kan çekin. 3-5 mL kan toplandıktan sonra, iğneyi kalpten çıkarın.
  13. İğneyi şırıngadan çıkarın ve keskin bir kaba koyun. Kanı heparinize tüplere aktarın ve süpernatanı 200 μL'lik bir pipetle toplamadan önce 2.739 x g ve 4 ° C'de 15 dakika döndürün ve kuru buz üzerinde dondurun.
  14. Kalbi makasla çıkararak fareyi ötenazi yapın. İzofluran beslemesini kapatın.
  15. Böbrek veya dalak gibi ilgilenilen diğer karın organlarını toplayın. Organı tanımlayın, ilgilenilen organı kancalı doku forsepsleriyle tutun, kaldırın ve tüm ekleri kesin. Organı etiketli bir tüpe yerleştirin ve kuru buz üzerine dondurun.
  16. Beyni çıkarmak için, kafatasının tabanını keserek bir çift keskin, büyük makasla hayvanın kafasını kesin. Kafa montajını elinizle çekin. Kafatasını kaplayan kalan deriyi kesin.
  17. Dissektör makası kullanarak, kafatasını orta hatta tabandan lambdaya kadar kesin, yani supraoksipital kemiği ikiye bölün. Yarısını kavramak için bir hemostat kullanın ve katlayın. Beyinciğin tam olarak ortaya çıkması için diğer tarafta tekrarlayın.
  18. Sagital sütür boyunca frontal kemiğe kadar kesmeye devam edin. Parietal kemiklerin her birini katlamak için bir hemostat kullanın. Gerekirse, ön kemiği daha fazla kesin ve koku alma ampullerini ortaya çıkarmak için daha fazla kemik çıkarın.
  19. Kafayı baş aşağı tutun ve beyni bir spatula ile dikkatlice kaldırın, spatula ile keserek optik ve trigeminal sinirlerden ayırın. Beyni bir tüpe toplayın ve kuru buzun üzerine dondurun.
  20. Boya enjekte edilirse beyin ventrikülleri mavi renkte boyanır. Beyni enjeksiyon bölgesinde (Şekil 2A,B) ve ventriküllerdeki boya dağılımını araştırmak için ~ 1 cm posterior (Şekil 2C) kesmek için tek kullanımlık bir bıçak kullanın.
  21. Omuriliği çıkarmak için, cildi sıçanın sırt yüzeyinin orta hattı boyunca keserek vertebral sütunu açığa çıkarın. Omurgalı kolonunu, etrafında iki taraflı bir kesi yaparak ve lomber omuriliğin kaudal ucunda enine keserek çıkarın.
  22. Tüm omurilik açığa çıkana kadar laminayı makas kullanarak kolon boyunca iki taraflı olarak kesin. Omuriliği bir ucundan, örneğin rostral ucundan kaldırın ve tüm sinirler kesilene kadar omurilik sinirlerini kaudal yönde parçalayarak çıkarın. Omuriliği bir tüpe toplayın ve kuru buz üzerinde dondurun.
    NOT: Veri analizi için organ toplamadan önce ve sonra tüm tüpleri tartın. Gerekirse ve uygunsa, ventriküler bölmelerde kalan ilaçları çıkarmak için BOS toplandıktan sonra ve beyin toplanmasından önce ventriküler sistem yıkanabilir. Tüpe bağlı salinle dolu 1 mL'lik bir şırınga ve bir enjektör kanülü kullanın ve kılavuz kanüle yerleştirin. 2-3 mL salin enjekte edin. Salin, cisterna magna'daki açıklıktan çıkmalıdır. Kılavuz kanüller, sahte kanüller ve vidalar 24 saat asetonda bekletilerek tekrar kullanılabilir, ardından ıslatılıp tıbbi deterjan ve su ile temizlenebilir. Kuruduktan sonra, artık diş çimentosu ince forsepsler kullanılarak çıkarılabilir.

Sonuçlar

Sunulan cerrahi protokol, eğitimli cerrahların %>99.8 hayatta kalma oranına ulaşması ve hayvanların ameliyat sonrası 1. günde stabil vücut ağırlığı göstermesi, 0. gündeki ameliyat öncesi ağırlıklarına kıyasla (ortalama ± SD'si 315.8 g ± 42.1 g 0. gün için ve 314.1 g ± 1. gün için 43.0 g, Şekil 3).

BOS toplanmadan önce, implante edilen kanüle %1.1 Evans Blue boyası enjeksiyonu, enjeksiyonun amaçlan...

Tartışmalar

Araştırmacılar ve klinisyenler, BBB'nin koruyucu mekanizmasını atlatmak ve ilaçları doğrudan CNS 12,18,19,21,24'e iletmek için ICV enjeksiyonları kullanırlar. Bu çalışma, ilaçların CNS'ye verimli bir şekilde verilmesi ve farmakokinetik analiz için BOS'un çıkarılması için eksiksiz bir ICV protokolüdür. ...

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, hayvanların bakımı ve bakımı için Melbourne Üniversitesi'ndeki Biyomedikal Bilim Hayvan Tesisi'ne teşekkür eder. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü'nden (R01 AI146241, GR ve TV) bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. JL, Avustralya Ulusal Sağlık Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) Baş Araştırma Görevlisidir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneTerumo, JapanSS+01T
5 mL syringesTerumo, JapanSS+05S
AcetoneMerck, Germany67641
Bench protector sheetsHalyard, USA2765-C
BetadineMundipharma, Netherlands1015695
Buprenorphine; TemgesicClifford Hallam Healthcare, Australia1238366
CarprofenZoetis, Australia10001132
ChlorhexidineTasman Chemicals, Australia890401
Chux superwipes (or equivalent)Chux, Australian/aautoclaved
Clippersn/an/a
Cotton swabsLP Italiana, Italy112191autoclaved
Dental cement powder (Vertex Self cure powder)Henry Schein, USAVX-SC500GVD5
Dental cement solvent (Vertex Self cure liquid)Henry Schein, USAVX-SC250MLLQ
Disposable needles: 18 G, 26 G, 30 GTerumo, JapanNN+2525RL
Disposable surgical bladesWestlab, Australia663-255
Dissector scissorsF.S.T.14082-09
Dummy cannulasBio Scientific, AustraliaC313DC/SPCcut to 4.05 to fit the guide cannula
Ethanol 80%Merck, Australia10107
Evan's blue dyeSigmaE2129 - 50G
Eye lubeClifford Hallam Healthcare, Australia2070491
Felt tip penSharpie, USAD-4236
Fibre optic light sourcen/an/a
Flattened needle (18 G) or similar to apply supergluen/an/a
Glass pipettes, pulledHirschmann Laborgeraete, Germany9100175
Glass syringe 10 uLHamilton, USA701 LT and 1701 LT
Guide cannulasBio Scientific, AustraliaC313G/SPC22 G, cut 4 mm below the pedestal for lateral ventricle cannulation in adult Sprague Dawley rats
Haemostat
Heat bead steriliserInotech, SwitzerlandIS-250
Heat padn/an/a
Hydrogen peroxide 3%Perrigo, Australia11383
Induction chamber (Perspex 300 mm x 200 mm)n/an/a
Injector cannulaBio Scientific, AustraliaC313I/SPCcut to fit the 4 mm cannula + 0.5 mm projection
IsofluraneClifford Hallam Healthcare, Australia2093803
Isoflurane vaporiser and appropriate scavenging systemn/an/a
Medium size weighing boatsn/an/a
Metal spatulaMet-App, Australian/a
Micro syringe pumpNew Era, USANE-300
MicrodrillRWD Life Science Co, China87001
Polymyxin BBeta Pharma, China86-40302
Protein LoBind tubes, 0.5 mLEppendorf, GermanyZ666491
Ropivacaine 1%; NaropinAstraZeneca, UKPS09634
Scissors, largeF.S.T.14511-15
Scissors, smallF.S.T.14079-10
Screwdrivern/an/a
ScrewsMr. Specs, Australian/a
Stereotaxic frameRWD Life Science Co, Chinan/aNecessary components: rat ear bars, tooth bar, anaesthesia nose cone, arm with digital readout (X, Y, Z) and cannula holder
Sterile saline 0.9%Baxter, USAAHB1323
Super etch (37% phosphoric acid) gelSDI Limited, Australia8100045
SuperglueUHU, Germanyn/a
Tissue forceps with hooksF.S.T.11027-12
Tubing, PE-50Bio Scientific, AustraliaC313CT

Referanslar

  1. Goldmann, E. E. Vitalfärbung am Zentralnervensystem. Beitrag zur Physio-Pathologie des Plexus chorioideus und der Hirnhäute. Königl. Akademie der Wissenschaften. , (1913).
  2. Koziara, J. M., Lockman, P. R., Allen, D. D., Mumper, R. J. The blood-brain barrier and brain drug delivery. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9-10), 2712-2735 (2006).
  3. Davson, H. Review lecture. The blood-brain barrier. The Journal of Physiology. 255 (1), 1-28 (1976).
  4. Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: Physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 165-166, 1-14 (2020).
  5. Oldendorf, W. H., Hyman, S., Braun, L., Oldendorf, S. Z. Blood-brain barrier: Penetration of morphine, codeine, heroin, and methadone after carotid injection. Science. 178 (4064), 984-986 (1972).
  6. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  7. Velkov, T., Dai, C., Ciccotosto, G. D., Cappai, R., Hoyer, D., Li, J. Polymyxins for CNS infections: Pharmacology and neurotoxicity. Pharmacology & Therapeutics. 181, 85-90 (2018).
  8. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat Model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. Journal of Visualized Experiments. (69), e50019 (2012).
  9. KrolI, R. A., Neuwelt, E. A., Neuwelt, E. A. Outwitting the blood-brain barrier for therapeutic purposes: Osmotic opening and other means. Neurosurgery. 42 (5), 1083-1099 (1998).
  10. Wei, B., Qian, C., Liu, Y., Lin, X., Wan, J., Wang, Y. Ommaya reservoir in the treatment of cryptococcal meningitis. Acta Neurologica Belgica. 117 (1), 283-287 (2017).
  11. Ommaya reservoir. StatPearls [Internet] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK559011/ (2021)
  12. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
  13. Ajoy, R., Chou, S. -. Y. Studying the hypothalamic insulin signal to peripheral glucose intolerance with a continuous drug infusion system into the mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (131), e56410 (2018).
  14. Sajadi, A., Provost, C., Pham, B., Brouillette, J. Neurodegeneration in an animal model of chronic amyloid-beta oligomer infusion is counteracted by antibody treatment infused with osmotic pumps. Journal of Visualized Experiments. (114), e54215 (2016).
  15. Rauschenberger, L., Knorr, S., Volkmann, J., Ip, C. W. Implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for DYT/PARK-ATP1A3 dystonia. Journal of Visualized Experiments. (163), e61635 (2020).
  16. Cooper, J. D., Heppert, K. E., Davies, M. I., Lunte, S. M. Evaluation of an osmotic pump for microdialysis sampling in an awake and untethered rat. Journal of Neuroscience Methods. 160 (2), 269-275 (2007).
  17. Sharma, R. K., et al. Microglial cells impact gut microbiota and gut pathology in angiotensin II-induced hypertension. Circulation Research. 124 (5), 727-736 (2019).
  18. Kim, H. Y., Lee, D. K., Chung, B. -. R., Kim, H. V., Kim, Y. Intracerebroventricular injection of amyloid-β peptides in normal mice to acutely induce alzheimer-like cognitive deficits. Journal of Visualized Experiments. (109), e53308 (2016).
  19. Fukushima, A., Fujii, M., Ono, H. Intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin and pain tests in mice. Journal of Visualized Experiments. (163), e57570 (2020).
  20. Niaz, N., et al. Intracerebroventricular injection of histamine induces the hypothalamic-pituitary-gonadal axis activation in male rats. Brain Research. 1699, 150-157 (2018).
  21. Yokoi, H., Arima, H., Murase, T., Kondo, K., Iwasaki, Y. Intracerebroventricular injection of adrenomedullin inhibits vasopressin release in conscious rats. Neuroscience Letters. 216 (1), 65-70 (1996).
  22. Savci, V., Gürün, S., Ulus, I. H., Kiran, B. K. Intracerebroventricular injection of choline increases plasma oxytocin levels in conscious rats. Brain Research. 709 (1), 97-102 (1996).
  23. Sunter, D., Hewson, A. K., Dickson, S. L. Intracerebroventricular injection of apelin-13 reduces food intake in the rat. Neuroscience Letters. 353 (1), 1-4 (2003).
  24. Moreau, C., et al. Intraventricular dopamine infusion alleviates motor symptoms in a primate model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 139, 104846 (2020).
  25. Calvo, P. M., de la Cruz, R. R., Pastor, A. M. A single intraventricular injection of VEGF leads to long-term neurotrophic effects in axotomized motoneurons. eNeuro. 7 (3), (2020).
  26. Choi, C. R., Ha, Y. S., Ahn, M. S., Lee, J. S., Song, J. U. Intraventricular or epidural injection of morphine for severe pain. Neurochirurgia. 32 (6), 180-183 (1989).
  27. Zhong, L., Shi, X. -. Z., Su, L., Liu, Z. -. F. Sequential intraventricular injection of tigecycline and polymyxin B in the treatment of intracranial Acinetobacter baumannii infection after trauma: A case report and review of the literature. Military Medical Research. 7 (1), 23 (2020).
  28. Gross, P. M., Weaver, D. F. A new experimental model of epilepsy based on the intraventricular injection of endothelin. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 22, 282-287 (1993).
  29. Nang, S. C., Azad, M. A. K., Velkov, T., Zhou, Q. Rescuing the last-line polymyxins: Achievements and challenges. Pharmacological Reviews. 73 (2), 679-728 (2021).
  30. Tsuji, B. T., et al. International Consensus Guidelines for the Optimal Use of the Polymyxins: Endorsed by the American College of Clinical Pharmacy (ACCP), European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID), Infectious Diseases Society of America (IDSA), International Society for Anti-infective Pharmacology (ISAP), Society of Critical Care Medicine (SCCM), and Society of Infectious Diseases Pharmacists (SIDP). Pharmacotherapy. 39 (1), 10-39 (2019).
  31. Velkov, T., Roberts, K. D., Nation, R. L., Thompson, P. E., Li, J. Pharmacology of polymyxins: New insights into an "old" class of antibiotics. Future Microbiology. 8 (6), 711-724 (2013).
  32. Nation, R. L., et al. Dosing guidance for intravenous colistin in critically-ill patients. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 64 (5), 565-571 (2017).
  33. Nation, R. L., Velkov, T., Li, J. Colistin and polymyxin B: Peas in a pod, or chalk and cheese. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (1), 88-94 (2014).
  34. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
  35. Molina-Cimadevila, M. J., Segura, S., Merino, C., Ruiz-Reig, N., Andrés, B., de Madaria, E. Oral self-administration of buprenorphine in the diet for analgesia in mice. Laboratory Animals. 48 (3), 216-224 (2014).
  36. Goldkuhl, R., Hau, J., Abelson, K. S. P. Effects of voluntarily-ingested Buprenorphine on plasma corticosterone levels, body weight, water intake, and behaviour in permanently catheterised rats. In Vivo. 24 (2), 131-135 (2010).
  37. Hestehave, S., Munro, G., Pedersen, T. B., Abelson, K. S. P. Antinociceptive effects of voluntarily ingested Buprenorphine in the hot-plate test in laboratory rats. Laboratory Animals. 51 (3), 264-272 (2017).
  38. Faesel, N., Schünemann, M., Koch, M., Fendt, M. Angiotensin II-induced drinking behavior as a method to verify cannula placement into the cerebral ventricles of mice: An evaluation of its accuracy. Physiology & Behavior. 232, 113339 (2021).
  39. Elsevier. Neurotoxicity. Neurotoxicity | Elsevier Enhanced Reader. , (2021).
  40. Vuillemenot, B. R., Korte, S., Wright, T. L., Adams, E. L., Boyd, R. B., Butt, M. T. Safety evaluation of CNS administered biologics-study design, data interpretation, and translation to the clinic. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 152 (1), 3-9 (2016).
  41. . Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6456952/ (2021)
  42. Nau, R., Sörgel, F., Eiffert, H. Penetration of drugs through the blood-cerebrospinal fluid/blood-brain barrier for treatment of central nervous system infections. Clinical Microbiology Reviews. 23 (4), 858-883 (2010).
  43. Quagliarello, V. J., Ma, A., Stukenbrok, H., Palade, G. E. Ultrastructural localization of albumin transport across the cerebral microvasculature during experimental meningitis in the rat. The Journal of Experimental Medicine. 174 (3), 657-672 (1991).
  44. Reinhardt, V. Common husbandry-related variables in biomedical research with animals. Laboratory Animals. 38 (3), 213-235 (2004).
  45. Morton, L. D., Sanders, M., Reagan, W. J., Crabbs, T. A., McVean, M., Funk, K. A. Confounding factors in the interpretation of preclinical studies. International Journal of Toxicology. 38 (3), 228-234 (2019).
  46. Bailey, J. Does the stress of laboratory life and experimentation on animals adversely affect research data? A critical review. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 46 (5), 291-305 (2018).
  47. Moberg, G. P., Mench, J. A. . The Biology of Animal Stress: Basic Principles and Implications for Animal Welfare. , (2000).
  48. Russel, W. M. S., Burch, R. L. . The principles of humane experimental technique principles. , (1959).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

ntraventrik ler la Da t mKan Beyin BariyeriMerkezi Sinir SistemiCNS Terap tikleriPolimiksinleroklu laca Diren li BakterilerStereotaksik CerrahiK lavuz Kan lMikroenjeksiyon PompasBolus nf zyonuEvans Mavi BoyaBeyin Omurilik S v sFarmakokinetikFarmakodinamik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır