Investigación de la interacción espacial entre astrocitos y neuronas en cerebros despejados

Resumen

La combinación de la transducción de vectores virales y la limpieza cerebral utilizando el método CLARITY permite la investigación de un gran número de neuronas y astrocitos simultáneamente.

Resumen

La combinación de la transducción de vectores virales y la limpieza de tejidos utilizando el método CLARITY permite investigar simultáneamente varios tipos de células cerebrales y sus interacciones. La transducción de vectores virales permite el marcado de diversos tipos de células en diferentes colores de fluorescencia dentro del mismo tejido. Las células pueden ser identificadas genéticamente por actividad o proyección. Utilizando un protocolo CLARITY modificado, el tamaño potencial de la muestra de astrocitos y neuronas ha crecido en 2-3 órdenes de magnitud. El uso de CLARITY permite la obtención de imágenes de astrocitos completos, que son demasiado grandes para caber en su totalidad en rodajas, y el examen de los somata con todos sus procesos. Además, brinda la oportunidad de investigar la interacción espacial entre los astrocitos y los diferentes tipos de células neuronales, a saber, el número de neuronas piramidales en cada dominio astrocítico o la proximidad entre los astrocitos y las poblaciones específicas de neuronas inhibitorias. Este documento describe, en detalle, cómo se deben aplicar estos métodos.

Introducción

En los últimos años, el conocimiento de la función de los astrocitos y cómo interactúan con los circuitos neuronales ha aumentado dramáticamente. Los astrocitos pueden influir en la plasticidad ^1,2, ayudar en la recuperación neuronal postinjuria ^3,4 e incluso inducir la potenciación neuronal de novo, con estudios recientes que muestran la importancia de los astrocitos en la adquisición y recompensa de la memoria, anteriormente consideradas como funciones puramente neuronales ^5,6,7 . Una característica de particular interés en la investigación de astrocitos es la disposición espacial de las células, que mantienen organizaciones espaciales únicas en el hipocampo y otras estructuras cerebrales ^8,9,10. A diferencia de las dendritas neuronales que se entrelazan entre los somata celulares, los astrocitos del hipocampo habitan territorios visualmente distinguibles con ligera superposición entre sus procesos, creando dominios distintos ^8,11,12,13. La evidencia que apoya la participación de los astrocitos en los circuitos neuronales no apoya la falta de una descripción anatómica detallada de tales poblaciones y las neuronas en sus dominios¹⁴.

Los procedimientos de transducción de vectores virales, junto con los animales transgénicos (TG), se han popularizado como un conjunto de herramientas para investigar las estructuras cerebrales, las funciones y las interacciones celulares^15,16. La utilización de diferentes promotores permite la focalización de células específicas según sus propiedades genéticas, niveles de activación^17,18 u objetivos de proyección. Diferentes virus pueden expresar fluoróforos de diferentes colores en diferentes poblaciones. Un virus se puede combinar con la expresión endógena de fluoróforos en TG, o se pueden usar animales TG sin la necesidad de virus. Estas técnicas son ampliamente utilizadas para el marcado neuronal, y algunos laboratorios han comenzado a utilizarlas con modificaciones especializadas para dirigirse a otros tipos de células, como los astrocitos ^5,9,19.

La técnica CLARITY, descrita por primera vez en 2013^20,21, permite el estudio de rebanadas gruesas de cerebro al hacer que todo el cerebro sea transparente mientras deja intactas las estructuras microscópicas. Al combinar los dos métodos, la transducción de vectores virales y la limpieza de tejidos, ahora está disponible la opción de examinar las interacciones espaciales entre diferentes poblaciones de tipos celulares. La mayoría de los estudios de interacción astrocito-neurona se realizaron en rebanadas delgadas de cerebro, lo que resultó en imágenes de astrocitos incompletos debido a sus grandes dominios, lo que restringió radicalmente el número de células analizadas. El uso de la técnica CLARITY permite la caracterización de resolución de una sola célula de poblaciones celulares en volúmenes a gran escala simultáneamente. La obtención de imágenes de poblaciones celulares marcadas fluorescentemente en cerebros claros no proporciona resolución sináptica, pero permite una caracterización exhaustiva de las interacciones espaciales entre los astrocitos y una variedad de tipos de células neuronales.

Por esa razón, aprovechamos estas técnicas de vanguardia para investigar las propiedades de los astrocitos en todo el CA1 dorsal, obteniendo imágenes de toda la lámina (Estrato Radiatum, capa piramidal y Estrato Oriens). Medimos decenas de miles de astrocitos (con penetrancia viral de >96%⁵), analizando así la información de toda la población astrocítica alrededor de CA1. Con una penetrancia eficiente de los marcadores neuronales, pudimos registrar las interacciones entre toda la población de astrocitos CA1 y los cuatro tipos de células neuronales: parvalbúmina (PV), somatostatina (SST), neuronas inhibidoras VIP y células piramidales excitatorias⁹.

Se realizaron varios experimentos utilizando una combinación de fluorescencia de animales TG y vectores virales de diferentes colores (todas células inhibitorias), mientras que otros (excitatorios) utilizaron dos vectores virales que expresan diferentes fluoróforos bajo diferentes promotores⁹. Este artículo presenta un protocolo detallado, que incluye el etiquetado de las células deseadas en el cerebro, haciendo que el cerebro sea transparente utilizando un procedimiento CLARITY modificado, así como imágenes y análisis de estructuras cerebrales completas, utilizando varios procedimientos y software.

Protocolo

Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Hebrea y cumplieron con las pautas de la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Transducción de vectores virales

NOTA: La transducción de vectores virales se utiliza para expresar fluoróforos en el cerebro.

1. Utilice un atlas (por ejemplo, Allen Brain Atlas) para localizar la coordinación relevante del área objetivo.
   NOTA: Los atlas 3D se pueden encontrar en línea (por ejemplo, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
2. Usando cirugía estereotáctica, inyecte los vectores virales en la estructura cerebral relevante. Véase⁹ para un protocolo detallado.
3. Espere de 3 a 6 semanas para la expresión de fluoróforos.
   NOTA: Un corto período de tiempo es suficiente si solo es necesario marcar los cuerpos celulares. Se necesitará un largo período de tiempo si las proyecciones axonales son relevantes para la pregunta, ya que los fluoróforos tardan más en expresarse en axones, que pueden tener varios milímetros de largo.
4. Validar previamente la especificidad y penetrancia de la expresión de fluoróforos (tanto de la expresión viral como de los animales TG) (Figura 1A). Antes de continuar con el procedimiento CLARITY, designe al menos un cerebro para rebanadas delgadas y asegúrese de que la expresión del fluoróforo sea fuerte y específica para la característica de la célula objetivo.

2. CLARIDAD

NOTA: Este método hace que el cerebro sea transparente dentro de 2-6 semanas.

1. Realizar perfusión transcraneal en animales utilizando solución salina tamponada con fosfato en frío (PBS) seguida de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS. Retire el cerebro y manténgalo en PFA durante la noche a 4 ° C en un tubo de 50 ml o un recipiente similar.
   NOTA: Antes de realizar la perfusión transcraneal, el animal debe ser anestesiado profundamente. En los ejemplos presentados en este protocolo, todos los animales fueron anestesiados usando ketamina y xilazina (90% y 10%, respectivamente).
2. Sustituir el PFA por una solución de hidrogel (SA; véase el cuadro 1) durante 48 h a 4 °C.
   NOTA: No permita que los materiales se calienten más que la temperatura de refrigeración (4-8 ° C) en esta etapa, o el hidrogel se polimerizará. El HS utilizado en este protocolo contiene 2% de acrilamida, a diferencia de los protocolos anteriores que sugieren 4%²² o 1%¹⁷. El beneficio del 2% se detalla en la sección de discusión. Al preparar el HS, trabaje en una superficie helada. Guárdelo a -20 °C.
3. Desgasificación
   NOTA: El propósito de esta etapa es eliminar todo el oxígeno libre del tejido, ya que el O₂ interfiere con el proceso de polimerización. Se puede utilizar cualquier gas nonO₂ (por ejemplo, N₂, CO₂); Se recomienda N₂ .
   1. Transfiera el N₂ desde el tanque a través de un tubo flexible de 5 mm (interno), conectado a una aguja de 19 G en su extremo (Figura 1B).
   2. Haga dos pequeños orificios (anchos con aguja) en la tapa del tubo: uno para introducir el gas y el otro para permitir que el aire salga del tubo (Figura 1C).
   3. Conecte la tubería del gas N₂ al tubo y reemplace los gases durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
   4. Retire la tubería e inmediatamente selle los orificios con arcilla de modelado en cada tubo (Figura 1D).
4. Transfiera los tubos sellados desgasificados a un baño de 37 °C durante 3,5 h para polimerizar el HS, que se convertirá en un gel. Tenga cuidado de no agitar los tubos (Figura 1E).
5. Extraiga el cerebro del tubo y retire suavemente el gel polimerizado de su alrededor usando toallitas de laboratorio. Asegúrese de que no quede gel residual adherido a la superficie del tejido, ya que podría reaccionar con la solución en los siguientes pasos, inhibiendo el proceso de limpieza del tejido (Figura 1F).
   NOTA: Debido a que el gel contenía PFA, la extracción debe realizarse bajo una campana de humos.
6. Corta el cerebro si la pregunta en cuestión requiere solo una parte de él. Divídalo por la mitad o en rodajas muy gruesas que contengan todas las áreas de interés (Figura 1G).
7. Coloque las rodajas en la Primera Solución de Limpieza (CS1, ver Tabla 2) en un recipiente nuevo y agite a 70 rpm durante 24 h a 37 °C.
8. Siga los pasos que se describen a continuación para transferir el cerebro de CS1 a la segunda solución de compensación (CS2, consulte la Tabla 2).
   1. Prepare un tubo perforado para el cerebro con anticipación (Figura 1H).
   2. Precaliente CS2 a 40-45 °C en un vaso de precipitados lo suficientemente grande como para contener el tubo. Haga esto en una placa caliente con un agitador. Asegúrese de que la temperatura no alcance los 55 °C para evitar el blanqueamiento de las proteínas expresadas.
   3. Coloque el vaso de precipitados lleno de CS2 y el tubo perforado en un dispositivo de agitación (un vaso de precipitados de 2 L en la Figura 1I). Establezca una velocidad de agitación moderada que hará que el líquido fluya sin distorsionar el tejido.
      NOTA: Dentro de 2-6 semanas, el tejido se volverá transparente (el proceso comienza en la periferia y se mueve hacia adentro hacia las estructuras centrales del cerebro). La decisión de cuándo el tejido es "lo suficientemente claro" depende del juicio personal. El cerebro debe ser lo suficientemente transparente para obtener imágenes bajo el microscopio sin interferencia (la Figura 1J no es lo suficientemente clara; Figura 1K suficientemente clara). Superar el punto en el que el tejido es lo suficientemente claro puede causar pérdida de rigidez tisular.
9. Transferencia de CS2 a PBST (0,5% Triton X-100 en PBS, ver Tabla 2) en un nuevo recipiente a 37 °C con agitación leve (70 rpm) durante 24 h.
   NOTA: En el PBST, el tejido se volverá blanquecino (Figura 1L). La claridad volverá (y mejorará) cuando se integre en la solución de coincidencia de índice de refracción (RIMS, consulte el paso 2.14).
10. Reemplace el PBST por el nuevo PBST. Mantener en las mismas condiciones (37 °C con agitación leve) durante otras 24 h.
11. Reemplace PBST nuevamente con PBST nuevo y manténgalo en RT durante 24 h.
12. Transferencia a PBS en RT durante 24 h.
13. Reemplace el PBS y déjelo en RT durante 24 horas adicionales.
14. Retire el cerebro de PBS y transfiéralo a RIMS a 37 ° C durante la noche.
    NOTA: Inicialmente, las ondas en el RIMS pueden rodear el cerebro. Este protocolo fue diseñado y validado utilizando dos RIMS comerciales específicos (ver Tabla 3). Sin embargo, el protocolo no debe diferir cuando se utilizan otros RIMS (comerciales o de fabricación propia).
15. Mantenga el tejido en RT durante otras 24 h o hasta que la solución alcance el equilibrio total, es decir, cuando el tejido se vuelva transparente y la solución ya no contenga ondulaciones visibles (Figura 1M).
16. Si el tejido es transparente, proceda a la preparación de la cámara. Si en este punto, el tejido se vuelve blanco en lugar de transparente (debido a agregados de moléculas residuales de SDS), limpie la muestra nuevamente repitiendo los pasos 2.9 y 2.10, y transfiera el tejido a CS2 (paso 2.8) durante unos días, seguido de todos los pasos hasta el paso 2.15.

3. Preparación de la Cámara

NOTA: Cada muestra requiere una diapositiva con una cámara de imagen en la que se colocará la muestra.

1. Coloque la muestra en el centro de la diapositiva.
2. Usando una pistola de pegamento caliente, cree paredes en los bordes de la diapositiva, casi tan altas como el tejido. Asegúrese de dejar un pequeño espacio (aproximadamente 5 mm) en una de las esquinas (Figura 2A, B).
3. Aplique 1-2 gotas del RIMS en la muestra para mantener la superficie superior húmeda y evitar que se formen burbujas entre la cubierta y el tejido.
4. Inmediatamente después de aplicar las gotas RIMS, agregue la última capa de pegamento caliente a las paredes (para que alcancen la altura del cerebro / rebanada) y progrese inmediatamente (mientras el pegamento caliente todavía está líquido) al paso 3.5.
5. Selle la parte superior con una funda, colocándola de la manera más uniforme posible en la parte superior de la capa de pegamento caliente aún caliente (Figura 2C).
6. Llene la cámara con el RIMS a través del espacio dejado en las paredes de pegamento caliente (Figura 2D, E).
7. Cierre el espacio con pegamento caliente. No dejar aire en el interior (Figura 2F).
8. Si las paredes de pegamento caliente se extienden más allá de los bordes de la diapositiva, corte los bordes extensibles (Figura 2G).
9. Si el objetivo utilizado para la obtención de imágenes está sumergido, agregue otros 2-3 mm de pegamento a las paredes sobre el deslizamiento para que la solución de inmersión dure un período más largo (Figura 2H).

4. Imágenes (confocales o de dos fotones)

1. Compruebe si el escenario puede contener la cámara, ya que el grosor de la cámara puede alcanzar varios milímetros.
   NOTA: Por ejemplo, el microscopio confocal (ver la Tabla de Materiales) utilizado en este protocolo está equipado con varias etapas (por ejemplo, circular, rectangular). Cualquiera que sea la etapa elegida para sostener la cámara es irrelevante siempre que sus parámetros se ajusten a los tamaños de la cámara.
2. Trabaje con un objetivo con una distancia de trabajo suficiente, es decir, una distancia de trabajo mínima ≥3 mm, ya que la región cerebral de interés puede tener unos pocos milímetros de profundidad, y el cobertor puede no ser completamente recto ya que se colocó manualmente.
   NOTA: Como demostración, los resultados presentados en la Figura 1, Video 1 y Video 2 se obtuvieron bajo un microscopio de dos fotones utilizando un objetivo de inmersión en agua 16x con una distancia de trabajo de 3 mm y un aumento de 2.4 para obtener un campo de visión de 652 x 483 μm y una pila z con intervalos de 0.937 μm entre los planos.
3. Realice imágenes de áreas múltiples, que pueden tardar unas horas o incluso días. Asegúrese de que haya un amplio almacenamiento gratuito en la computadora, ya que el tamaño de cada imagen puede alcanzar hasta decenas de gigabits.
   NOTA: Las imágenes CLARITY pueden dar lugar a un número significativamente mayor de secciones de imagen en profundidad. Por lo tanto, las intensidades utilizadas para capturar la expresión deben ser relativamente bajas para evitar la sobreexpresión durante la suma de la imagen.
4. Para los objetivos de inmersión, revise el líquido de forma rutinaria mientras toma imágenes y complemente con líquido adicional si es necesario.
   NOTA: Durante la toma de imágenes de los datos presentados en el Video 3, se agregó agua a la superficie de la cámara cada 6-8 h para combatir la evaporación.
5. Una vez adquirida la imagen, visualícela y analícela utilizando varios paquetes de software diferentes.
   NOTA: El software recomendado incluye Imaris y SyGlass tanto para visualización como para análisis. La tubería precisa para la reconstrucción optimizada de astrocitos utilizando el software Imaris se ha descrito anteriormente⁹. En resumen, las características de Imaris utilizadas en este estudio fueron Filamentos para reconstruir completamente las estructuras celulares y Manchas para extraer la posición en el espacio de todos los somata.

Resultados

La limpieza exitosa de rebanadas gruesas de tejido cerebral da como resultado una nueva gama de preguntas que se pueden hacer con respecto a las propiedades de las poblaciones de células grandes en comparación con las propiedades de las células individuales o grupos vecinos de células. Para lograr resultados exitosos, uno debe adherirse estrictamente al protocolo CLARITY, ya que hay una amplia gama de parámetros que deben considerarse para reducir la varianza entre muestras (por ejemplo, porcentaje de claridad, info...

Discusión

Los métodos de limpieza de tejidos presentan una herramienta revolucionaria en la investigación del cerebro, invitando a preguntas que antes no se podrían haber hecho. A partir de apuntar a las propiedades de un pequeño grupo de células, una sola célula o incluso una sola sinapsis, CLARITY ahora permite la orientación de poblaciones celulares totales o características de conectividad de largo alcance mediante el uso de fluoróforos relevantes.

El resultado de la combinación de la expr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect astrocytes
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neuronal nuclei
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
Acrylamide (40%)	Bio-rad	#161-0140
Bisacrylamide (2%)	Bio-rad	#161-0142
Boric acid	Sigma	#B7901	Molecular weight - 61.83 g/mol
Confocal microscope, scanning, FV1000	Olympus		4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)
Imaris software	Bitplane, UK		A software that allows 3D analysis of images
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4%	EMS	#15710
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
SyGlass software			A software that allows 3D analysis of images using virtual reality
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	Molecular weight - 121.14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
Two photon microscope	Neurolabware		Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365