맑은 뇌에서 성상세포와 뉴런 사이의 공간적 상호작용 조사

요약

CLARITY 방법을 사용하여 바이러스 벡터 형질도입과 뇌 제거를 결합하면 많은 수의 뉴런과 성상세포를 동시에 조사할 수 있습니다.

초록

CLARITY 방법을 사용하여 바이러스 벡터 형질도입과 조직 제거를 결합하면 여러 유형의 뇌 세포와 그 상호 작용을 동시에 조사 할 수 있습니다. 바이러스 벡터 형질도입은 동일한 조직 내에서 상이한 형광 색상으로 다양한 세포 유형의 마킹을 가능하게 한다. 세포는 활성 또는 돌출에 의해 유전적으로 확인될 수 있다. 변형된 CLARITY 프로토콜을 사용하여, 성상세포 및 뉴런의 잠재적 표본 크기는 2-3배 정도 성장하였다. CLARITY의 사용은 조각에 전체적으로 들어가기에는 너무 큰 완전한 성상 세포의 이미징과 모든 과정으로 소마타를 검사 할 수있게합니다. 또한, 성상세포와 상이한 뉴런 세포 유형 사이의 공간적 상호작용, 즉 각 성상세포 도메인에서 피라미드형 뉴런의 수 또는 성상세포와 특정 억제 뉴런 집단 사이의 근접성을 조사할 수 있는 기회를 제공한다. 이 백서에서는 이러한 방법을 어떻게 적용해야 하는지 자세히 설명합니다.

서문

최근 몇 년 동안, 성상 세포 기능에 대한 지식과 그들이 신경 회로와 상호 작용하는 방법이 극적으로 증가했습니다. 성상세포는 가소성^1,2에 영향을 미치고, 신경 손상 후 회복을 돕고, ^3,4를 돕고, 심지어 드노보 뉴런 강화를 유도할 수 있으며, 최근 연구들은 기억 획득 및 보상에서 성상세포의 중요성을 보여주었으며, 이전에는 순전히 신경 기능으로 간주되었다 5,6,7 . 성상세포 연구에 특히 관심을 갖는 특징은 해마 및 기타 뇌 구조^8,9,10에서 독특한 공간 조직을 유지하는 세포의 공간 배열입니다. 세포 소마타 사이에 얽혀있는 뉴런 수상 돌기와는 달리, 해마 성상 세포는 시각적으로 구별 가능한 영역에 서식하며 과정 사이에 약간의 겹침이 생겨 별개의 도메인 ^8,11,12,13을 만듭니다. 뉴런 회로에서 성상세포의 참여를 뒷받침하는 증거는 그러한 집단 및 뉴런의 도메인¹⁴에 대한 상세한 해부학적 설명의 부족을 지지하지 않는다.

바이러스 벡터 형질도입 절차는 형질전환 동물(TG)과 함께 뇌 구조, 기능 및 세포 상호작용을 조사하기 위한 도구 세트로서 대중화되었다^(15,16). 상이한 프로모터의 이용은 그들의 유전적 특성, 활성화 수준^17,18, 또는 프로젝션 표적에 따라 특정 세포의 표적화를 허용한다. 다른 바이러스는 다른 집단에서 다른 색깔의 형광단을 발현할 수 있다. 바이러스는 TG에서 형광단의 내인성 발현과 조합될 수 있거나, 또는 TG 동물은 바이러스를 필요로 하지 않고 사용될 수 있다. 이러한 기술은 뉴런 마킹에 널리 사용되며, 일부 실험실에서는 성상 세포 ^5,9,19와 같은 다른 세포 유형을 타겟팅하는 데 특화된 변형과 함께 사용하기 시작했습니다.

2013 ^20,21에서 처음 설명 된 CLARITY 기술은 미세한 구조를 그대로 유지하면서 전체 뇌를 투명하게 만들어 두꺼운 뇌 조각을 연구 할 수있게합니다. 바이러스 벡터 형질도입과 조직 제거라는 두 가지 방법을 조합함으로써 서로 다른 세포 유형 집단 간의 공간적 상호작용을 조사하는 옵션이 이제 이용가능하다. 대부분의 성상세포-뉴런 상호작용 연구는 얇은 뇌 조각에 대해 수행되었으며, 그 결과 큰 도메인으로 인해 불완전한 성상세포의 이미지가 생성되어 분석된 세포의 수가 근본적으로 제한되었다. CLARITY 기술을 사용하면 대규모 부피의 세포 집단의 단일 세포 분해능 특성화를 동시에 수행할 수 있습니다. 맑은 뇌에서 형광으로 태그가 붙은 세포 집단을 이미징하는 것은 시냅스 분해능을 전달하지 않지만 성상세포와 다양한 신경 세포 유형 사이의 공간적 상호 작용을 철저히 특성화할 수 있습니다.

이러한 이유로 우리는 이러한 최첨단 기술을 활용하여 등쪽 CA1 전체에 걸친 성상 세포의 특성을 조사하고 모든 라미나 (Stratum Radiatum, pyramidal layer 및 Stratum Oriens)를 이미징했습니다. 우리는 수만 개의 성상 세포 (바이러스 침투율 >96 % ⁵)를 측정하여 CA1 주변의 전체 성상 세포 집단의 정보를 분석했습니다. 뉴런 마커의 효율적인 침투를 통해, 우리는 CA1 성상세포의 전체 집단과 네 가지 유형의 뉴런 세포 - 파브알부민 (PV), 소마토스타틴 (SST), VIP 억제 뉴런 및 흥분성 피라미드 세포⁹ 사이의 상호 작용을 기록 할 수있었습니다.

몇몇 실험은 TG 동물로부터의 형광과 상이한 착색된 바이러스 벡터 (모든 억제 세포)의 조합을 사용하여 수행되었고, 다른 것들 (흥분성)은 상이한 프로모터⁹ 하에서 상이한 형광단을 발현하는 두 개의 바이러스 벡터를 이용하였다. 이 논문은 뇌에서 원하는 세포의 태깅, 수정 된 CLARITY 절차를 사용하여 뇌를 투명하게 만드는 것, 다양한 절차와 소프트웨어를 사용하여 완전한 뇌 구조를 이미징 및 분석하는 등 상세한 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

실험 프로토콜은 히브리 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건 연구소 가이드의 지침을 충족했습니다.

1. 바이러스 벡터 형질도입

참고: 바이러스 벡터 형질도입은 뇌에서 형광단을 발현하는 데 사용됩니다.

1. 아틀라스 (예 : Allen Brain Atlas)를 사용하여 대상 영역의 관련 조정을 찾으십시오.
   참고: 3D 아틀라스는 온라인에서 찾을 수 있습니다(예: http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
2. 입체 수술을 사용하여 바이러스 벡터를 관련 뇌 구조에 주입하십시오. 자세한 프로토콜^{은 9} 를 참조하십시오.
3. 형광단 발현을 위해 3-6 주 동안 기다리십시오.
   참고 : 세포체 만 표시해야하는 경우 짧은 시간이면 충분합니다. 축삭 투영이 문제와 관련이 있다면 형광단이 축삭으로 표현되는 데 더 오래 걸리기 때문에 오랜 시간이 필요할 것입니다.이 길이는 수 밀리미터 일 수 있습니다.
4. 형광단 발현(바이러스 발현 및 TG 동물 둘 다)의 특이성 및 침투성을 미리 검증한다(도 1A). CLARITY 절차를 진행하기 전에 적어도 하나의 뇌를 얇은 조각으로 지정하고 형광단 발현이 표적 세포 기능에 강하고 특이적인지 확인하십시오.

2. 명확성

참고 :이 방법은 2-6 주 이내에 뇌를 투명하게 만듭니다.

1. 차가운 인산완충식염수(PBS)를 사용하여 동물에 대해 경두개 관류를 수행하고, PBS 중의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용한다. 뇌를 제거하고 50 mL 튜브 또는 유사한 용기에서 4°C에서 하룻밤 동안 PFA에 보관한다.
   참고 : 경두개 관류가 수행되기 전에 동물은 깊이 마취되어야합니다. 이 프로토콜에 제시된 실시예에서, 모든 동물은 케타민 및 자일라진(각각 90% 및 10%)을 사용하여 마취되었다.
2. PFA를 4°C에서 48시간 동안 하이드로겔 용액(HS; 표 1 참조)으로 교체한다.
   참고: 이 단계에서 재료가 냉동 온도 (4-8 °C)보다 따뜻해지지 않도록하십시오. 이 프로토콜에 사용 된 HS는 4 % 22 또는 1 % ¹⁷을 제안하는 이전 프로토콜과 달리 2 % 아크릴 아미드^를 포함합니다. 2 %의 이점은 토론 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. HS를 준비 할 때 얼음처럼 차가운 표면에서 작업하십시오. -20 °C에서 보관하십시오.
3. 탈기
   참고: 이 단계의 목적은_O2가 중합 과정을 방해하므로 조직으로부터 모든 자유 산소를 제거하는 것입니다. 임의의 nonO2 가스(예를 들어, N2,_CO2)가 사용될 수 있고; _N2를 사용하는 것이 좋습니다.
   1. 탱크에서_N2 를 5mm(내부) 유연한 튜브를 통해 전달하고, 끝에 있는 19G 바늘에 연결합니다(그림 1B).
   2. 튜브의 뚜껑에 두 개의 작은 구멍(바늘 넓이)을 만듭니다: 하나는 가스를 도입하고 다른 하나는 공기가 튜브를 떠날 수 있도록 합니다(그림 1C).
   3. N2 가스의 파이프를 튜브에 부착하고 상온(RT)에서 약 30분 동안 가스를 교체합니다.
   4. 파이프를 제거하고 모든 튜브에 모델링 점토로 구멍을 즉시 밀봉합니다(그림 1D).
4. 탈기된 밀봉된 튜브를 3.5 h 동안 37°C 배쓰로 이송하여 HS를 중합하고, 이는 겔이 될 것이다. 튜브가 흔들리지 않도록 주의하십시오(그림 1E).
5. 튜브에서 뇌를 추출하고 실험실 물티슈를 사용하여 중합 된 젤을 주변에서 부드럽게 제거하십시오. 다음 단계에서 용액과 반응할 수 있으므로 조직 표면에 잔류 겔이 부착되어 있지 않은지 확인하여 조직 제거 과정을 억제합니다(그림 1F).
   참고 : 젤에는 PFA가 포함되어 있기 때문에 추출은 흄 후드 아래에서 수행되어야합니다.
6. 당면한 질문에 그것의 일부만 필요한 경우 뇌를 슬라이스하십시오. 반으로 나누거나 관심 있는 모든 영역을 포함하는 매우 두꺼운 조각으로 나눕니다(그림 1G).
7. 슬라이스를 새로운 용기에 제1 클리어링 용액 (CS1, 표 2 참조)에 넣고 37°C에서 24시간 동안 70 rpm에서 진탕한다.
8. 아래 설명 된 단계에 따라 CS1에서 두 번째 클리어링 솔루션 (CS2, 표 2 참조)으로 뇌를 옮깁니다.
   1. 뇌용 천공 튜브를 미리 준비합니다(그림 1H).
   2. CS2를 튜브를 담을만큼 충분히 큰 비이커에서 40-45 °C로 예열하십시오. 교반기가있는 핫 플레이트에서이 작업을 수행하십시오. 발현된 단백질의 표백을 방지하기 위해 온도가 55°C에 도달하지 않도록 보장한다.
   3. CS2로 채워진 비이커 및 천공된 튜브를 교반 장치 상에 놓는다( 도 1I의 2 L 비이커). 조직을 왜곡하지 않고 액체가 흐르게하는 적당한 교반 속도를 설정하십시오.
      참고 : 2-6 주 이내에 조직이 투명해질 것입니다 (과정은 주변에서 시작하여 중앙 뇌 구조를 향해 안쪽으로 움직입니다). 조직이 "충분히 명확한"시기에 대한 결정은 개인적인 판단에 달려 있습니다. 뇌는 간섭없이 현미경으로 이미징하기에 충분히 투명해야합니다 (그림 1J는 충분히 명확하지 않습니다. 그림 1K는 충분히 명확합니다). 조직이 충분히 맑은 지점을 능가하면 조직 강성이 손실 될 수 있습니다.
9. CS2로부터 PBST (PBS 중 0.5% 트리톤 X-100, 표 2 참조)로 새로운 용기에서 37°C에서 24시간 동안 가볍게 진탕(70 rpm)하면서 전사하였다.
   참고: PBST에서는 조직이 희끄무레하게 됩니다(그림 1L). 굴절률 정합 용액에 내장될 때 선명도는 복귀(및 개선)됩니다(RIMS, 단계 2.14 참조).
10. PBST를 새 PBST로 바꿉니다. 동일한 조건(경미한 흔들림으로 37°C)에서 24시간 동안 유지하십시오.
11. PBST를 새 PBST로 다시 교체하고 24시간 동안 RT를 유지하십시오.
12. 24 시간 동안 RT에서 PBS로 전송하십시오.
13. PBS를 교체하고 추가 24시간 동안 RT에 둡니다.
14. PBS로부터 뇌를 제거하고 하룻밤 사이에 37°C에서 RIMS로 옮긴다.
    참고 : 처음에는 RIMS의 파문이 뇌를 둘러싸고 있습니다. 이 프로토콜은 두 개의 특정 상용 RIMS를 사용하여 설계되고 검증되었습니다 ( 표 3 참조). 그러나 다른 RIMS (상업용 또는 자체 제작)를 사용할 때 프로토콜이 다르지 않아야합니다.
15. 조직을 또 다른 24시간 동안 또는 용액이 완전한 평형에 도달할 때까지, 즉 조직이 투명해지고 용액에 더 이상 가시적인 리플이 없을 때까지 RT에 보관하십시오(그림 1M).
16. 조직이 투명하면 챔버 준비를 진행하십시오. 이 시점에서, 조직이 투명해지는 대신에 (잔류 SDS 분자의 응집체로 인해) 백색이 되면, 단계 2.9 및 2.10을 반복함으로써 샘플을 다시 세척하고, 조직을 며칠 동안 CS2로 옮기고(단계 2.8), 이어서 단계 2.15까지의 모든 단계를 수행하였다.

3. 챔버 준비

참고: 각 샘플에는 샘플이 배치될 이미징 챔버가 있는 슬라이드가 필요합니다.

1. 샘플을 슬라이드 중간에 놓습니다.
2. 뜨거운 접착제 총을 사용하여 슬라이드의 가장자리에 조직만큼 높은 벽을 만듭니다. 모서리 중 하나에 작은 간격(약 5mm)을 남겨 두어야 합니다(그림 2A,B).
3. 시료에 RIMS를 1-2방울 떨어뜨려 윗면을 촉촉하게 유지하고 커버슬립과 조직 사이에 기포가 형성되지 않도록 합니다.
4. RIMS 방울을 적용한 직후 뜨거운 접착제의 마지막 층을 벽에 추가하고 (뇌 / 슬라이스의 높이에 도달하도록) 즉시 (뜨거운 접착제가 여전히 액체인 동안) 3.5 단계로 진행하십시오.
5. 덮개 슬립으로 상단을 밀봉하고 여전히 따뜻한 뜨거운 접착제 층 상단에 가능한 한 고르게 놓습니다(그림 2C).
6. 뜨거운 접착제 벽에 남아 있는 틈새를 통해 RIMS로 챔버를 채웁니다(그림 2D,E).
7. 뜨거운 접착제로 틈을 닫으십시오. 내부에 공기를 넣지 마십시오(그림 2F).
8. 핫 접착제 벽이 슬라이드의 테두리 너머로 확장되면 연장 모서리를 자릅니다(그림 2G).
9. 이미징에 사용된 물체가 잠겨 있는 경우 커버슬립 위의 벽에 2-3mm의 접착제를 더 추가하여 침지 용액이 더 오랜 기간 동안 지속되도록 합니다(그림 2H).

4. 이미징 (공초점 또는 이광자)

1. 챔버의 두께가 수 밀리미터에 도달 할 수 있으므로 스테이지가 챔버를 보유 할 수 있는지 확인하십시오.
   참고: 예를 들어, 이 프로토콜에 사용되는 공초점 현미경( 재료 표 참조)에는 여러 단계(예: 원형, 직사각형)가 장착되어 있습니다. 챔버를 보유하도록 선택된 단계는 매개 변수가 챔버 크기에 맞는 한 관련이 없습니다.
2. 관심있는 뇌 영역의 깊이가 수 밀리미터 일 수 있고 커버 슬립이 수동으로 배치 된 것처럼 커버 슬립이 완전히 직선적이지 않을 수 있으므로 충분한 작동 거리, 즉 최소 작동 거리 ≥3mm의 목표를 사용하여 작업하십시오.
   참고: 데모로서, 도 1, 비디오 1 및 비디오 2 에 제시된 결과는 3 mm 작동 거리 및 2.4의 배율을 갖는 물 침지 16x 대물렌즈를 사용하여 2광자 현미경 하에서 얻어졌으며, 652 x 483 μm 시야각과 평면들 사이에 0.937 μm 간격을 갖는 z-스택을 얻었다.
3. 몇 시간 또는 며칠이 걸릴 수 있는 다중 영역 이미징을 수행합니다. 각 이미지의 크기가 최대 수십 기가비트에 도달 할 수 있으므로 컴퓨터에 충분한 여유 저장 공간이 있는지 확인하십시오.
   참고: CLARITY 이미징으로 인해 이미지 섹션이 훨씬 더 깊어질 수 있습니다. 따라서 표현식을 캡처하는 데 사용되는 강도는 이미지 합산 중에 과발현을 방지하기 위해 상대적으로 낮아야 합니다.
4. 침수 목표를 위해, 이미징하는 동안 정기적으로 액체를 확인하고 필요한 경우 추가 액체로 보충하십시오.
   참고 : 비디오 3에 제시된 데이터를 이미징하는 동안 증발을 방지하기 위해 6-8 시간마다 챔버 표면에 물을 첨가했습니다.
5. 이미지를 획득한 후 여러 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 이미지를 보고 분석합니다.
   참고: 권장 소프트웨어에는 시각화와 분석을 위한 Imaris 및 SyGlass가 포함되어 있습니다. Imaris 소프트웨어를 사용하여 성상세포의 최적화된 재구성을 위한 정확한 파이프라인은 앞서⁹에 기술되었다. 요컨대, 본 연구에 사용된 이마리스의 특징은 세포 구조를 완전히 재구성하는 필라멘트와 모든 소마타의 공간에서의 위치를 추출하는 스팟이었다.

결과

두꺼운 뇌 조직 조각을 성공적으로 제거하면 단일 세포 또는 이웃 세포 그룹의 특성과는 달리 큰 세포 집단의 특성에 관해 질문 할 수있는 새로운 범위의 질문이 생깁니다. 성공적인 결과를 얻기 위해서는 샘플 간의 분산을 줄이기 위해 고려해야 할 광범위한 매개 변수 (예 : 선명도, 형광 정보, 팽윤도 매개 변수)가 있으므로 CLARITY 프로토콜을 엄격하게 준수해야합니다.

토론

조직 제거 방법은 뇌 연구에서 혁신적인 도구를 제시하여 이전에는 질문 할 수 없었던 질문을 초대합니다. 작은 세포 그룹, 단일 세포 또는 심지어 단일 시냅스의 특성을 표적화하는 것으로부터, CLARITY는 이제 관련 형광단을 사용하여 전체 세포 집단 또는 장거리 연결 특징의 표적화를 가능하게 한다.

형광단 발현 및 CLARITY 절차 조합의 결과는 바이너리가 아니며; 많은 요인들?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect astrocytes
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neuronal nuclei
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
Acrylamide (40%)	Bio-rad	#161-0140
Bisacrylamide (2%)	Bio-rad	#161-0142
Boric acid	Sigma	#B7901	Molecular weight - 61.83 g/mol
Confocal microscope, scanning, FV1000	Olympus		4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)
Imaris software	Bitplane, UK		A software that allows 3D analysis of images
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4%	EMS	#15710
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
SyGlass software			A software that allows 3D analysis of images using virtual reality
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	Molecular weight - 121.14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
Two photon microscope	Neurolabware		Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365