Исследование пространственного взаимодействия между астроцитами и нейронами в очищенном мозге

Резюме

Сочетание вирусной векторной трансдукции и очистки мозга с помощью метода CLARITY позволяет исследовать большое количество нейронов и астроцитов одновременно.

Аннотация

Сочетание вирусной векторной трансдукции и очистки тканей с помощью метода CLARITY позволяет одновременно исследовать несколько типов клеток головного мозга и их взаимодействия. Вирусная векторная трансдукция позволяет маркировать различные типы клеток различными цветами флуоресценции в одной и той же ткани. Клетки могут быть идентифицированы генетически по активности или проекции. Используя модифицированный протокол CLARITY, потенциальный размер выборки астроцитов и нейронов вырос на 2-3 порядка. Использование CLARITY позволяет визуализировать полные астроциты, которые слишком велики, чтобы поместиться в них целиком в срезы, и исследовать соматы со всеми их процессами. Кроме того, он дает возможность исследовать пространственное взаимодействие между астроцитами и различными типами нейрональных клеток, а именно количество пирамидных нейронов в каждом астроцитарном домене или близость между астроцитами и специфическими ингибирующими популяциями нейронов. В настоящем документе подробно описывается, как должны применяться эти методы.

Введение

В последние годы знания о функции астроцитов и о том, как они взаимодействуют с нейронными цепями, резко возросли. Астроциты могут влиять на пластичность ^1,2, помогать в восстановлении нейронов после травмы ^3,4 и даже индуцировать de novo нейрональное потенцирование, причем недавние исследования демонстрируют важность астроцитов в приобретении памяти и вознаграждении, ранее рассматриваемых как чисто нейронные функции ^5,6,7 . Особенностью, представляющей особый интерес в исследованиях астроцитов, является пространственное расположение клеток, которые поддерживают уникальные пространственные организации в гиппокампе и других структурах мозга ^8,9,10. В отличие от нейрональных дендритов, которые переплетаются между клеточными соматами, астроциты гиппокампа населяют визуально различимые территории с небольшим перекрытием между их процессами, создавая отчетливые домены 8,11,12,13. Доказательства, подтверждающие участие астроцитов в нейронных цепях, не подтверждают отсутствие подробного анатомического описания таких популяций и нейронов в их доменах¹⁴.

Процедуры трансдукции вирусных векторов, наряду с трансгенными животными (ТГ), были популяризированы в качестве набора инструментов для исследования структур, функций и клеточных взаимодействий мозга^15,16. Использование различных промоторов позволяет нацеливаться на конкретные клетки в соответствии с их генетическими свойствами, уровнями активации^17,18 или проекционными мишенями. Различные вирусы могут экспрессировать различные цветные флуорофоры в разных популяциях. Вирус может сочетаться с эндогенной экспрессией флуорофоров в ТГ, или ТГ животных можно использовать без необходимости в вирусах. Эти методы широко используются для маркировки нейронов, и некоторые лаборатории начали использовать их с модификациями, специализированными для нацеливания на другие типы клеток, такие как астроциты ^5,9,19.

Метод CLARITY, впервые описанный в 2013 году^20,21, позволяет изучать толстые срезы мозга, делая весь мозг прозрачным, оставляя микроскопические структуры нетронутыми. Объединив два метода — вирусную векторную трансдукцию и очистку тканей — теперь доступен вариант изучения пространственных взаимодействий между различными популяциями клеточных типов. Большинство исследований взаимодействия астроцитов и нейронов проводились на тонких срезах мозга, что приводило к изображениям неполных астроцитов из-за их больших доменов, тем самым радикально ограничивая количество анализируемых клеток. Использование метода CLARITY позволяет одновременно характеризовать одноклеточные популяции клеток в крупномасштабных объемах. Визуализация флуоресцентно помеченных клеточных популяций в чистом мозге не обеспечивает синаптического разрешения, но позволяет тщательно охарактеризовать пространственные взаимодействия между астроцитами и различными типами нейрональных клеток.

По этой причине мы использовали эти современные методы для исследования свойств астроцитов по всему дорсальному CA1, визуализируя всю пластинку (Stratum Radiatum, пирамидальный слой и Stratum Oriens). Мы измерили десятки тысяч астроцитов (с вирусной пенетрантностью >96%⁵), тем самым проанализировав информацию всей астроцитарной популяции вокруг CA1. При эффективном проникновении нейронных маркеров мы могли бы регистрировать взаимодействия между всей популяцией астроцитов CA1 и четырьмя типами нейронных клеток — парвальбумином (PV), соматостатином (SST), VIP-тормозными нейронами и возбуждающими пирамидальными клетками⁹.

Несколько экспериментов были проведены с использованием комбинации флуоресценции животных ТГ и разноцветных вирусных векторов (все ингибирующие клетки), в то время как другие (возбуждающие) использовали два вирусных вектора, экспрессирующих разные флуорофоры под разными промоторами⁹. В этой статье представлен подробный протокол, включая маркировку желаемых клеток в мозге, обеспечение прозрачности мозга с помощью модифицированной процедуры CLARITY, а также визуализацию и анализ полных структур мозга с использованием различных процедур и программного обеспечения.

протокол

Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Еврейским университетом и соответствовали руководящим принципам Руководства Национального института здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию.

1. Вирусная векторная трансдукция

ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусная векторная трансдукция используется для экспрессии флуорофоров в головном мозге.

1. Используйте атлас (например, Allen Brain Atlas) для определения соответствующей координации целевой области.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-атласы можно найти в Интернете (например, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
2. Используя стереотаксическую хирургию, вводите вирусные векторы в соответствующую структуру мозга. Подробный протокол см. в^{разделе 9} .
3. Подождите 3-6 недель для выражения флуорофора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Короткого периода времени достаточно, если необходимо отметить только тела клеток. Потребуется длительный период времени, если аксональные проекции имеют отношение к вопросу, так как флуорофорам требуется больше времени для экспрессии в аксонах, которые могут иметь длину в несколько миллиметров.
4. Заранее проверьте специфичность и пенетрантность экспрессии флуорофоров (как вирусной экспрессии, так и ТГ животных) (рисунок 1А). Прежде чем приступить к процедуре CLARITY, назначьте по крайней мере один мозг для тонких срезов и убедитесь, что экспрессия флуорофора является сильной и специфичной для особенности клетки-мишени.

2. ЯСНОСТЬ

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод делает мозг прозрачным в течение 2-6 недель.

1. Выполняйте транскраниальную перфузию на животных с использованием холодного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) с последующим 4% параформальдегидом (PFA) в PBS. Удалите мозг и храните его в PFA на ночь при 4 °C в трубке 50 мл или аналогичном контейнере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением транскраниальной перфузии животное должно быть глубоко обезболено. В примерах, представленных в этом протоколе, всех животных анестезировали с использованием кетамина и ксилазина (90% и 10% соответственно).
2. Заменить PFA раствором гидрогеля (HS; см. таблицу 1) в течение 48 ч при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте материалам стать теплее, чем температура охлаждения (4-8 ° C) на этом этапе, иначе гидрогель полимеризуется. HS, используемый в этом протоколе, содержит 2% акриламида, в отличие от предыдущих протоколов, предполагающих 4% ²² или 1% ¹⁷. Выгода в 2% подробно описана в разделе обсуждения. При подготовке ТН ВЭД работают на ледяной поверхности. Храните при -20 °C.
3. Дегазация
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого этапа является удаление всего свободного кислорода из ткани, поскольку O₂ препятствует процессу полимеризации. Может быть использован любой газ, не_{относящийся к О2} (например, N₂, CO₂); Рекомендуется N₂ .
   1. Перенесите N₂ из резервуара через 5 мм (внутреннюю) гибкую трубку, соединенную с иглой 19 G на ее конце (рисунок 1B).
   2. Сделайте два небольших отверстия (шириной от иглы) в крышке трубки: одно для введения газа, а другое, чтобы позволить воздуху покинуть трубку (рисунок 1C).
   3. Прикрепите трубу от газа N₂ к трубке и замените газы примерно на 30 мин при комнатной температуре (RT).
   4. Снимите трубу и немедленно запечатайте отверстия с помощью моделирующей глины на каждой трубке (рисунок 1D).
4. Переместите дегазированные герметичные трубки в ванну с температурой 37 °C в течение 3,5 ч для полимеризации HS, который станет гелем. Будьте осторожны, чтобы не встряхнуть трубки (рисунок 1E).
5. Извлеките мозг из трубки и аккуратно удалите полимеризованный гель вокруг нее с помощью лабораторных салфеток. Убедитесь, что к поверхности ткани не осталось остаточного геля, так как он может вступить в реакцию с раствором на следующих этапах, ингибируя процесс очистки тканей (рисунок 1F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку гель содержал PFA, экстракция должна производиться под вытяжным кожухом.
6. Нарежьте мозг, если рассматриваемый вопрос требует только его части. Разделите его пополам или на очень толстые срезы, которые содержат все интересующие области (рисунок 1G).
7. Поместите ломтики в первый очищающий раствор (CS1, см. таблицу 2) в новый контейнер и встряхните при 70 об/мин в течение 24 ч при 37 °C.
8. Выполните описанные ниже шаги, чтобы перевести мозг из CS1 во второе очищающее решение (CS2, см. таблицу 2).
   1. Заранее подготовьте перфорированную трубку для мозга (рисунок 1Н).
   2. Разогрейте CS2 до 40-45 °C в стакане, достаточно большом, чтобы вместить трубку. Делайте это на конфорке с мешалкой. Убедитесь, что температура не достигает 55 °C, чтобы предотвратить отбеливание экспрессированных белков.
   3. Поместите стакан, заполненный CS2, и перфорированную трубку на перемешивающее устройство (стакан объемом 2 л на рисунке 1I). Установите умеренную скорость перемешивания, которая заставит жидкость течь, не искажая ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 2-6 недель ткань станет прозрачной (процесс начинается на периферии и движется внутрь к центральным структурам мозга). Решение о том, когда ткань «достаточно чистая», зависит от личного суждения. Мозг должен быть достаточно прозрачным для визуализации под микроскопом без помех (рисунок 1J недостаточно четкий; Рисунок 1K достаточно четкий). Превышение точки, в которой ткань достаточно прозрачна, может привести к потере жесткости ткани.
9. Перевести из CS2 в PBST (0,5% Triton X-100 в PBS, см. Таблицу 2) в новом контейнере при 37 °C с легким встряхиванием (70 об/мин) в течение 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В PBST ткань станет беловатой (рисунок 1L). Ясность вернется (и улучшится) при внедрении в решение для согласования показателей преломления (RIMS, см. шаг 2.14).
10. Замените PBST новым PBST. Хранить в тех же условиях (37 °C при легком встряхивании) еще 24 ч.
11. Замените PBST снова на новый PBST и держите на RT в течение 24 часов.
12. Перевод в PBS на RT в течение 24 ч.
13. Замените PBS и оставьте в RT еще на 24 часа.
14. Извлеките мозг из PBS и перенесите его в RIMS при 37 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально рябь в RIMS может окружать мозг. Этот протокол был разработан и проверен с использованием двух конкретных коммерческих RIMS (см. таблицу 3). Однако протокол не должен отличаться при использовании других RIMS (коммерческих или самодельных).
15. Держите ткань на RT еще 24 ч или до тех пор, пока раствор не достигнет полного равновесия, т. е. когда ткань станет прозрачной, и раствор больше не будет содержать видимой ряби (рисунок 1M).
16. Если ткань прозрачная, приступайте к камерной подготовке. Если в этот момент ткань становится белой, а не прозрачной (из-за агрегатов остаточных молекул SDS), снова очистите образец, повторив шаги 2.9 и 2.10, и перенесите ткань в CS2 (шаг 2.8) в течение нескольких дней, а затем все этапы до шага 2.15.

3. Подготовка камеры

ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется слайд с камерой визуализации, в которую будет помещен образец.

1. Поместите образец в середину слайда.
2. Используя горячий клеевой пистолет, создайте стенки по краям затвора, почти такие же высокие, как ткань. Обязательно оставьте небольшой зазор (примерно 5 мм) в одном из углов (рисунок 2A,B).
3. Нанесите 1-2 капли RIMS на образец, чтобы сохранить верхнюю поверхность влажной и предотвратить образование пузырьков между покровным листом и тканью.
4. Сразу после нанесения капель RIMS добавьте последний слой горячего клея к стенкам (чтобы они достигли высоты мозга/среза) и сразу же прогрессируйте (пока горячий клей еще жидкий) к шагу 3.5.
5. Запечатайте верхнюю часть чехлом, поместив его как можно более равномерно поверх еще теплого слоя горячего клея (рисунок 2C).
6. Заполните камеру RIMS через зазор, оставленный в стенках горячего клея (рисунок 2D,E).
7. Закройте зазор горячим клеем. Не оставляйте воздуха внутри (рисунок 2F).
8. Если стенки горячего клея выходят за границы горки, вырежьте расширяющиеся края (рисунок 2G).
9. Если объектив, используемый для визуализации, погружен, добавьте еще 2-3 мм клея к стенам над крышкой, чтобы погружной раствор прослужил более длительный период (рисунок 2H).

4. Визуализация (конфокальная или двухфотонная)

1. Проверьте, может ли ступень удерживать камеру, так как толщина камеры может достигать нескольких миллиметров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, конфокальный микроскоп (см. Таблицу материалов), используемый в этом протоколе, оснащен несколькими ступенями (например, круговой, прямоугольной). Какая бы ступень ни была выбрана для хранения камеры, она не имеет значения, если ее параметры соответствуют размерам камеры.
2. Работа с объективом с достаточным рабочим расстоянием, т.е. минимальным рабочим расстоянием ≥3 мм, так как интересующая область мозга может быть несколько миллиметров в глубину, а крышка может быть не совсем прямой, как это было размещено вручную.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве демонстрации результаты, представленные на рисунке 1, видео 1 и видео 2 , были получены под двухфотонным микроскопом с использованием объектива погружения в воду 16x с рабочим расстоянием 3 мм и увеличением 2,4 для получения поля зрения 652 x 483 мкм и z-стека с интервалами 0,937 мкм между плоскостями.
3. Выполните многозонную визуализацию, которая может занять несколько часов или даже дней. Убедитесь, что на компьютере достаточно свободного места, так как размер каждого изображения может достигать десятков гигабит.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация CLARITY может привести к значительно большему количеству участков изображения в глубине. Поэтому интенсивности, используемые для захвата выражения, должны быть относительно низкими, чтобы предотвратить чрезмерную экспрессию во время суммирования изображения.
4. Для целей погружения регулярно проверяйте жидкость во время визуализации и при необходимости добавляйте дополнительную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время визуализации данных, представленных в Видео 3, вода добавлялась на поверхность камеры каждые 6-8 ч для борьбы с испарением.
5. После получения изображения просмотрите и проанализируйте его с помощью нескольких различных пакетов программного обеспечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое программное обеспечение включает Imaris и SyGlass как для визуализации, так и для анализа. Точный конвейер для оптимизированной реконструкции астроцитов с использованием программного обеспечения Imaris был описан ранее⁹. Короче говоря, особенностями Имариса, используемыми в этом исследовании, были нити для полной реконструкции клеточных структур и пятна для извлечения положения в пространстве всех сомат.

Результаты

Успешная очистка толстых срезов мозговой ткани приводит к новому кругу вопросов, которые можно задать относительно свойств больших клеточных популяций в отличие от свойств отдельных клеток или соседних групп клеток. Для достижения успешных результатов следует строго придерживаться ...

Обсуждение

Методы очистки тканей представляют собой революционный инструмент в исследованиях мозга, вызывая вопросы, которые ранее не могли быть заданы. Нацеливаясь на свойства небольшой группы клеток, одной клетки или даже одного синапса, CLARITY теперь позволяет нацеливаться на общие популяции к?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect astrocytes
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neuronal nuclei
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
Acrylamide (40%)	Bio-rad	#161-0140
Bisacrylamide (2%)	Bio-rad	#161-0142
Boric acid	Sigma	#B7901	Molecular weight - 61.83 g/mol
Confocal microscope, scanning, FV1000	Olympus		4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)
Imaris software	Bitplane, UK		A software that allows 3D analysis of images
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4%	EMS	#15710
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
SyGlass software			A software that allows 3D analysis of images using virtual reality
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	Molecular weight - 121.14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
Two photon microscope	Neurolabware		Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365