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要約

CLARITY法を用いたウイルスベクター形質導入と脳クリアリングを組み合わせることで、多数のニューロンとアストロサイトを同時に調べることができます。

要約

CLARITY法を用いたウイルスベクター形質導入と組織クリアリングを組み合わせることで、数種類の脳細胞とその相互作用を同時に調べることができます。ウイルスベクター形質導入は、同じ組織内で異なる蛍光色の多様な細胞タイプのマーキングを可能にします。細胞は、活性または投影によって遺伝的に同定することができる。修正されたCLARITYプロトコルを使用して、アストロサイトおよびニューロンの潜在的なサンプルサイズは2〜3桁成長した。CLARITYを使用すると、スライスに全体収まるには大きすぎる完全なアストロサイトのイメージングと、すべてのプロセスによるソマタの検査が可能になります。さらに、アストロサイトと異なるニューロン細胞型との間の空間的相互作用、すなわち、各アストロサイトドメイン内の錐体ニューロンの数、またはアストロサイトと特定の阻害性ニューロン集団との間の近接性を調査する機会を提供する。このホワイト ペーパーでは、これらのメソッドをどのように適用するかを詳しく説明します。

概要

近年、アストロサイト機能とそれらがニューロン回路とどのように相互作用するかについての知識は劇的に増加しています。アストロサイトは可塑性1,2に影響を与え、ニューロンの損傷後の回復を補助し3,4、さらにはde novoニューロン増強を誘導することができ、最近の研究では、以前は純粋にニューロン機能と考えられていた記憶獲得と報酬におけるアストロサイトの重要性が示されている5,6,7.アストロサイト研究において特に興味深い特徴は、海馬および他の脳構造におけるユニークな空間組織を維持する細胞の空間配置である8,9,10。細胞体腫の間で絡み合うニューロン樹状突起とは異なり、海馬アストロサイトは、そのプロセスの間にわずかに重複して視覚的に区別可能な領域に生息し、別個のドメイン8、11、12、13を作り出す。ニューロン回路へのアストロサイトの関与を支持する証拠は、そのような集団およびそれらのドメイン内のニューロンの詳細な解剖学的記述の欠如を支持しない14。

ウイルスベクター形質導入手順は、トランスジェニック動物(TG)とともに、脳の構造、機能、および細胞相互作用を調査するためのツールセットとして普及している15,16。異なるプロモーターの利用は、それらの遺伝的特性、活性化レベル17、18、または投影標的に応じた特定の細胞の標的化を可能にする。異なるウイルスは、異なる集団で異なる色の蛍光色素を発現することができる。ウイルスは、TGにおける蛍光色素の内因性発現と組み合わせることができ、またはTG動物をウイルスを必要とせずに使用することができる。これらの技術はニューロンマーキングに広く使用されており、一部の研究室では、アストロサイト5、9、19などの他の細胞型を標的とすることに特化した修飾でそれらを使用し始めています。

201320,21で最初に記述されたCLARITY技術は、微視的構造をそのまま残しながら脳全体を透明にすることによって、厚い脳スライスの研究を可能にする。ウイルスベクター形質導入と組織クリアリングの2つの方法を組み合わせることで、異なる細胞型集団間の空間的相互作用を調べるオプションが利用可能になりました。ほとんどのアストロサイト-ニューロン相互作用研究は、薄い脳スライスに対して実施され、その結果、ドメインが大きいために不完全なアストロサイトの画像が得られ、分析された細胞の数が根本的に制限された。CLARITY技術を使用することで、大規模ボリューム内の細胞集団の単一セル分解能特性評価を同時に行うことができます。明瞭な脳内の蛍光タグ付き細胞集団をイメージングしてもシナプス分解能は得られませんが、アストロサイトとさまざまなニューロン細胞タイプとの間の空間的相互作用の徹底的な特徴付けが可能になります。

そのため、これらの最先端の技術を利用して、背側CA1全体のアストロサイトの特性を調査し、すべての薄層(ラディアタム層、ピラミッド層、オリエンス層)をイメージングしました。我々は数万のアストロサイト(ウイルス浸透度>96%5)を測定し、CA1周辺のアストロサイト集団全体の情報を解析した。ニューロンマーカーの効率的な浸透により、CA1アストロサイトの集団全体と、パルブアルブミン(PV)、ソマトスタチン(SST)、VIP阻害性ニューロン、および興奮性錐体細胞の4種類のニューロン細胞との間の相互作用を記録することができました9。

TG動物からの蛍光と異なる色のウイルスベクター(すべての阻害細胞)の組み合わせを用いていくつかの実験を実施し、一方、他の実験(興奮性)は、異なるプロモーター下で異なる蛍光団を発現する2つのウイルスベクターを利用した9。この論文では、脳内の所望の細胞のタグ付け、修正されたCLARITY手順を使用して脳を透明にすること、および様々な手順およびソフトウェアを使用して完全な脳構造を画像化および分析することを含む詳細なプロトコルを提示する。

プロトコル

実験プロトコルは、ヘブライ大学動物ケアおよび使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のための国立衛生研究所ガイドのガイドラインを満たしていた。

1. ウイルスベクター形質導入

注: ウイルスベクター形質導入は、脳内で蛍光色素を発現するために使用されます。

  1. アトラス(例:Allen Brain Atlas)を使用して、ターゲット領域の関連する調整を見つけます。
    注:3Dアトラスはオンラインで見つけることができます(例:http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer)。
  2. 定位手術を使用して、ウイルスベクターを関連する脳構造に注入する。詳細なプロトコルについては、9 を参照してください。
  3. 蛍光色素分子の発現を3~6週間待ちます。
    注: 細胞体のみをマークする必要がある場合は、短い時間で十分です。軸索突起が問題に関連する場合、蛍光色素分子が軸索内で発現するのに時間がかかるため、長い期間が必要になります(長さは数ミリメートルです)。
  4. 蛍光色素分子発現(ウイルス発現とTG動物の両方)の特異性と浸透度を事前に検証します(図1A)。CLARITY手順に進む前に、薄いスライス用に少なくとも1つの脳を指定し、蛍光色素分子の発現が強く、標的細胞の特徴に特異的であることを確認してください。

2. 明快さ

注:この方法は、2〜6週間以内に脳を透明にします。

  1. 冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に続いてPBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して動物に経頭蓋灌流を行います。脳を取り出し、50mLチューブまたは同様の容器中で4°Cで一晩PFA中に保管する。
    注:経頭蓋灌流が行われる前に、動物は深く麻酔されなければなりません。このプロトコールに提示された実施例において、全ての動物を、ケタミンおよびキシラジン(それぞれ90%および10%)を用いて麻酔した。
  2. PFAをヒドロゲル溶液(HS; 表1参照)と交換し、4°Cで48時間処理する。
    注:この段階で材料が冷凍温度(4-8°C)よりも暖かくならないようにしてください、さもなければヒドロゲルは重合します。このプロトコルで使用されるHSは、4%22または1%17を示唆する以前のプロトコルとは異なり、2%アクリルアミドを含む。2%の利点については、ディスカッションセクションで詳しく説明します。HSを準備するときは、氷のように冷たい表面で作業してください。-20°Cで保管してください。
  3. 脱 ガス
    注:この段階の目的は、O2が重合プロセスを妨害するため、組織からすべての遊離酸素を除去することです。任意の非O2ガス(例えば、N2、CO2)を使用することができる。N2が推奨されます。
    1. N2を、5mm(内部)の可撓性チューブを介してタンクから移送し、その端にある19G針に接続します(図1B)。
    2. チューブのキャップに2つの小さな穴(針幅)を作ります:1つはガスを導入するため、もう1つは空気がチューブから出ることができるようにします(図1C)。
    3. N2ガスからチューブに配管を取り付け、室温(RT)で約30分間ガスを交換します。
    4. パイプを取り外し、すぐにすべてのチューブのモデリング粘土で穴を密封します(図1D)。
  4. 脱気した密閉管を37°Cの槽に3.5時間移し、HSを重合させ、ゲル状になる。チューブを振らないように注意してください(図1E)。
  5. チューブから脳を抽出し、実験室のワイプを使用して周囲から重合ゲルを静かに取り除きます。以下のステップで溶液と反応し、組織クリアリングプロセスを阻害する可能性があるため、残留ゲルが組織の表面に付着したままにならないことを確認してください(図1F)。
    注:ゲルにはPFAが含まれていたため、抽出はヒュームフードの下で行う必要があります。
  6. 目の前の質問が脳の一部だけを必要とする場合は、脳をスライスします。それを半分に分けるか、すべての関心領域を含む非常に厚いスライスに分割します(図1G)。
  7. スライスを新しい容器内の第1の透明化溶液(CS1、 表2参照)に入れ、70rpmで37°Cで24時間振とうする。
  8. 以下に説明する手順に従って、脳をCS1から2番目のクリアリングソリューション(CS2、 表2参照)に移します。
    1. 脳用の穴あきチューブを予め用意しておきます(図1H)。
    2. CS2をチューブを入れるのに十分な大きさのビーカーで40〜45°Cに予熱する。スターラー付きのホットプレートでこれを行います。発現タンパク質の漂白を防ぐために、温度が55°Cに達していないことを確認してください。
    3. CS2を充填したビーカーと有孔管とを攪拌装置( 図1Iでは2Lビーカー)の上に置く。組織を歪めることなく液体を流動させる適度な攪拌速度を設定します。
      注:2〜6週間以内に、組織は透明になります(このプロセスは末梢から始まり、中枢脳構造に向かって内側に移動します)。組織がいつ「十分に明確」になるかの決定は、個人的な判断に委ねられています。脳は、干渉なしに顕微鏡下で画像化するために十分に透明でなければならない(図1J は十分に明確ではない。 図1Kは 十分に明確である)。組織が十分に透明である点を超えると、組織の剛性が失われる可能性があります。
  9. CS2からPBST(PBS中の0.5% Triton X-100、 表2参照)に新しい容器に移し、37°Cで24時間穏やかな振とう(70rpm)した。
    注:PBSTでは、組織は白っぽくなります(図1L)。屈折率マッチングソリューション(RIMS、ステップ2.14参照)に埋め込まれると、明瞭さが戻り(そして改善)します。
  10. PBST を新しい PBST に置き換えます。同じ条件(穏やかな振とうで37°C)でさらに24時間保管してください。
  11. PBST を新しい PBST に再度交換し、RT で 24 時間待機します。
  12. RT で PBS に 24 時間転送します。
  13. PBS を交換し、RT でさらに 24 時間放置します。
  14. PBSから脳を取り出し、37°Cで一晩RIMSに移す。
    注:最初は、RIMSの波紋が脳を囲むことがあります。このプロトコルは、2つの特定の商用RIMSを使用して設計および検証されました( 表3を参照)。ただし、他のRIMS(商用または自作)を使用する場合、プロトコルは変わらないはずです。
  15. さらに24時間、または溶液が完全な平衡に達するまで、すなわち組織が透明になり、溶液に目に見える波紋が含まれなくなるまで、組織をRTに保ちます(図1M)。
  16. 組織が透明である場合は、チャンバーの準備に進みます。この時点で、組織が透明ではなく白色になった場合(残留SDS分子の凝集体による)、ステップ2.9および2.10を繰り返してサンプルを再度洗浄し、組織をCS2に数日間移し(ステップ2.8)、続いてステップ2.15までのすべてのステップを実施した。

3. チャンバーの準備

メモ:各サンプルには、サンプルが置かれるイメージングチャンバーを備えたスライドが必要です。

  1. スライドの中央にサンプルを配置します。
  2. ホットグルーガンを使用して、スライドの端に組織とほぼ同じ高さの壁を作ります。角の1つに小さな隙間(約5 mm)を残してください(図2A、B)。
  3. サンプルにRIMSを1〜2滴塗布して、上面を湿らせ、カバースリップと組織の間に気泡が形成されるのを防ぎます。
  4. RIMS滴を塗布した直後に、ホットグルーの最後の層を壁に追加し(脳/スライスの高さに達するように)、すぐに(ホットグルーがまだ液体である間)ステップ3.5に進みます。
  5. 上部をカバースリップで密封し、まだ温かいホットグルー層の上にできるだけ均等に置きます(図2C)。
  6. ホットグルー壁に残された隙間からチャンバーをRIMSで満たします(図2D、E)。
  7. 熱い接着剤で隙間を塞ぎます。内部に空気を入れないでください(図2F)。
  8. ホットグルーの壁がスライドの境界を越えて伸びている場合は、伸びているエッジをカットします(図2G)。
  9. イメージングに使用する対物レンズが浸漬されている場合は、カバースリップの上の壁にさらに2~3mmの接着剤を追加して、浸漬溶液が長期間持続するようにします(図2H)。

4. イメージング(共焦点または二光子)

  1. チャンバーの厚さが数ミリメートルに達する可能性があるため、ステージがチャンバーを保持できるかどうかを確認します。
    注:例えば、このプロトコルで使用される共焦点顕微鏡( 材料表を参照)は、いくつかの段階(例えば、円形、長方形)を備えている。チャンバを保持するためにどのステージが選択されても、そのパラメータがチャンバのサイズに適合する限り、無関係です。
  2. 十分な作動距離、すなわち最小作動距離≥3mmの対物レンズで作業し、関心領域の脳領域は数ミリメートルの深さであり、カバースリップは手動で配置されたように完全にまっすぐではない可能性がある。
    注:デモンストレーションとして、 図1、ビデオ1、および ビデオ2に提示された結果は、3mmの作動距離と2.4倍の倍率で水浸漬16倍の対物レンズを使用して 2 光子顕微鏡下で得られ、652 x 483μmの視野と平面間の間隔が0.937μmのzスタックを得た。
  3. 複数エリアイメージングを実行しますが、これには数時間から数日かかる場合があります。各イメージのサイズが最大数十ギガビットに達する可能性があるため、コンピュータに十分な空きストレージがあることを確認してください。
    注:クラリティイメージングでは、画像セクションの深さが大幅に増加する可能性があります。したがって、画像の要約中に過剰発現を防ぐために、式をキャプチャするために使用される強度は比較的低くする必要があります。
  4. 浸漬目標の場合は、イメージング中に液体を定期的にチェックし、必要に応じて追加の液体を補充します。
    注: ビデオ3に示されているデータのイメージング中、蒸発と戦うために6〜8時間ごとにチャンバの表面に水が追加されました。
  5. イメージを取得したら、いくつかの異なるソフトウェアパッケージを使用してイメージを表示および分析します。
    メモ: 推奨されるソフトウェアには、視覚化と分析の両方のための Imaris と SyGlass が含まれます。Imarisソフトウェアを使用してアストロサイトの再構成を最適化するための正確なパイプラインは、以前に説明されています9.要するに、この研究で使用されたイマリの特徴は、細胞構造を完全に再構築するためのフィラメントと、すべてのソマタの空間における位置を抽出するためのスポットでした。

結果

厚い脳組織スライスのクリアリングに成功すると、単一細胞または隣接する細胞群の特性とは対照的に、大きな細胞集団の特性に関して尋ねることができる新しい範囲の質問が生じる。成功する結果を達成するためには、サンプル間の分散を減らすために考慮する必要がある幅広いパラメータ(例えば、透明度の割合、蛍光情報、腫れ度パラメータ)があるため、CLARITYプロトコルに厳密に従う?...

ディスカッション

組織クリアリング法は、脳研究における革命的なツールを提示し、以前は尋ねられなかった質問を招きます。CLARITYは、小さな細胞群、単一細胞、さらには単一のシナプスの特性を標的にすることから、関連する蛍光色素を使用することで、全細胞集団または長距離接続性特徴の標的化を可能にしました。

蛍光色素分子発現とCLARITY手順の組み合わせの結果はバイナリでは...

開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

このプロジェクトは、欧州連合のHorizon 2020研究イノベーションプログラム(助成金契約No 803589)、イスラエル科学財団(ISF助成金No.1815/18)、カナダ-イスラエル助成金(CIHR-ISF、助成金No.2591/18)の下で、欧州研究評議会(ERC)から資金提供を受けています。原稿全体にコメントしてくれたNechama Novickに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AAV1-GFAP::TdTomatoELSC Vector Core Facility (EVCF)viral vector used to detect astrocytes
AAV5-CaMKII::eGFPELSC Vector Core Facility (EVCF)viral vector used to detect neurons
AAV5-CaMKII::H2B-eGFPELSC Vector Core Facility (EVCF)viral vector used to detect neuronal nuclei
AAV5-CaMKII::TdTomatoELSC Vector Core Facility (EVCF)viral vector used to detect neurons
Acrylamide (40%)Bio-rad#161-0140
Bisacrylamide (2%)Bio-rad#161-0142
Boric acidSigma#B7901Molecular weight - 61.83 g/mol
Confocal microscope, scanning, FV1000Olympus4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)
Imaris softwareBitplane, UKA software that allows 3D analysis of images
NaOHSigma#S5881
PBS
PFA 4%EMS#15710
RapiClearSunJin lab#RC147002
RapiClear CSSunJin lab#RCCS002
SDSSigma#L3771
SyGlass softwareA software that allows 3D analysis of images using virtual reality
Tris base 1 MBio-rad#002009239100Molecular weight - 121.14 g/mol
Triton X-100ChemCruz#sc-29112A
Two photon microscopeNeurolabwareTi:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) 
VA-044 InitiatorWako#011-19365

参考文献

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