Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato

Riepilogo

La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione del cervello utilizzando il metodo CLARITY consente lo studio di un gran numero di neuroni e astrociti contemporaneamente.

Abstract

La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione dei tessuti utilizzando il metodo CLARITY consente di studiare contemporaneamente diversi tipi di cellule cerebrali e le loro interazioni. La trasduzione del vettore virale consente la marcatura di diversi tipi di cellule in diversi colori di fluorescenza all'interno dello stesso tessuto. Le cellule possono essere identificate geneticamente per attività o proiezione. Utilizzando un protocollo CLARITY modificato, la dimensione potenziale del campione di astrociti e neuroni è cresciuta di 2-3 ordini di grandezza. L'uso di CLARITY consente l'imaging di astrociti completi, che sono troppo grandi per adattarsi nella loro interezza a fette, e l'esame dei somata con tutti i loro processi. Inoltre, offre l'opportunità di studiare l'interazione spaziale tra astrociti e diversi tipi di cellule neuronali, vale a dire, il numero di neuroni piramidali in ciascun dominio astrocitico o la vicinanza tra astrociti e specifiche popolazioni di neuroni inibitori. Questo documento descrive, in dettaglio, come questi metodi devono essere applicati.

Introduzione

Negli ultimi anni, la conoscenza della funzione degli astrociti e di come interagiscono con i circuiti neuronali è aumentata drasticamente. Gli astrociti possono influenzare la plasticità ^1,2, aiutare nel recupero neuronale post-infortunio ^3,4 e persino indurre un potenziamento neuronale de novo, con studi recenti che mostrano l'importanza degli astrociti nell'acquisizione e nella ricompensa della memoria, precedentemente considerate come funzioni puramente neuronali ^5,6,7 . Una caratteristica di particolare interesse nella ricerca sugli astrociti è la disposizione spaziale delle cellule, che mantengono organizzazioni spaziali uniche nell'ippocampo e in altre strutture cerebrali ^8,9,10. A differenza dei dendriti neuronali che si intrecciano tra i somata cellulari, gli astrociti ippocampali abitano territori visivamente distinguibili con una leggera sovrapposizione tra i loro processi, creando domini distinti ^8,11,12,13. Le prove a sostegno della partecipazione degli astrociti nei circuiti neuronali non supportano la mancanza di una descrizione anatomica dettagliata di tali popolazioni e dei neuroni nei loro domini¹⁴.

Le procedure di trasduzione del vettore virale, insieme agli animali transgenici (TG), sono state rese popolari come set di strumenti per studiare le strutture cerebrali, le funzioni e le interazioni cellulari^15,16. L'utilizzo di diversi promotori consente il targeting di cellule specifiche in base alle loro proprietà genetiche, ai livelli di attivazione^17,18 o agli obiettivi di proiezione. Virus diversi possono esprimere fluorofori di colore diverso in diverse popolazioni. Un virus può essere combinato con l'espressione endogena di fluorofori in TG, oppure gli animali TG possono essere utilizzati senza la necessità di virus. Queste tecniche sono ampiamente utilizzate per la marcatura neuronale e alcuni laboratori hanno iniziato a utilizzarle con modifiche specializzate per il targeting di altri tipi di cellule, come gli astrociti ^5,9,19.

La tecnica CLARITY, descritta per la prima volta nel 2013^20,21, consente lo studio di spesse fette di cervello rendendo trasparente l'intero cervello lasciando intatte le strutture microscopiche. Combinando i due metodi - trasduzione virale del vettore e pulizia dei tessuti - è ora disponibile l'opzione di esaminare le interazioni spaziali tra diverse popolazioni di tipi cellulari. La maggior parte degli studi di interazione astrociti-neuroni sono stati eseguiti su fette di cervello sottili, con conseguente immagine di astrociti incompleti a causa dei loro grandi domini, limitando così radicalmente il numero di cellule analizzate. L'uso della tecnica CLARITY consente la caratterizzazione simultanea della risoluzione di singole cellule di popolazioni cellulari in volumi su larga scala. L'imaging di popolazioni cellulari con tag fluorescenti in cervelli chiari non fornisce una risoluzione sinaptica, ma consente una caratterizzazione approfondita delle interazioni spaziali tra astrociti e una varietà di tipi di cellule neuronali.

Per questo motivo, abbiamo sfruttato queste tecniche all'avanguardia per studiare le proprietà degli astrociti in tutto il CA1 dorsale, immaginando tutte le lamina (Stratum Radiatum, strato piramidale e Stratum Oriens). Abbiamo misurato decine di migliaia di astrociti (con penetranza virale di >96%⁵), analizzando così le informazioni dell'intera popolazione astrocitica intorno a CA1. Con un'efficace penetranza dei marcatori neuronali, abbiamo potuto registrare le interazioni tra l'intera popolazione di astrociti CA1 e i quattro tipi di cellule neuronali: parvalbumina (PV), somatostatina (SST), neuroni inibitori VIP e cellule piramidali eccitatorie⁹.

Diversi esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una combinazione di fluorescenza da animali TG e vettori virali di colore diverso (tutte le cellule inibitorie), mentre altri (eccitatori) hanno utilizzato due vettori virali che esprimono diversi fluorofori sotto diversi promotori⁹. Questo documento presenta un protocollo dettagliato, che include l'etichettatura delle cellule desiderate nel cervello, rendendo il cervello trasparente utilizzando una procedura CLARITY modificata, nonché l'imaging e l'analisi di strutture cerebrali complete, utilizzando varie procedure e software.

Protocollo

I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università ebraica e hanno soddisfatto le linee guida della Guida dell'Istituto Nazionale di Salute per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Trasduzione del vettore virale

NOTA: La trasduzione del vettore virale viene utilizzata per esprimere fluorofori nel cervello.

1. Utilizzare un atlante (ad esempio, Allen Brain Atlas) per individuare il coordinamento pertinente dell'area target.
   NOTA: gli atlanti 3D possono essere trovati online (ad esempio, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
2. Utilizzando la chirurgia stereotassica, iniettare i vettori virali nella struttura cerebrale pertinente. Vedere⁹ per un protocollo dettagliato.
3. Attendere 3-6 settimane per l'espressione del fluoroforo.
   NOTA: un breve periodo di tempo è sufficiente se è necessario contrassegnare solo i corpi cellulari. Sarà necessario un lungo periodo di tempo se le proiezioni assonali sono rilevanti per la domanda, poiché ci vuole più tempo perché i fluorofori si esprimano negli assoni, che possono essere lunghi diversi millimetri.
4. Convalidare in anticipo la specificità e la penetranza dell'espressione del fluoroforo (sia di espressione virale che di animali TG) (Figura 1A). Prima di procedere con la procedura CLARITY, designare almeno un cervello per fette sottili e assicurarsi che l'espressione del fluoroforo sia forte e specifica per la caratteristica della cellula bersaglio.

2. CHIAREZZA

NOTA: Questo metodo rende il cervello trasparente entro 2-6 settimane.

1. Eseguire la perfusione transcranica su animali utilizzando soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) seguita da paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS. Rimuovere il cervello e tenerlo in PFA durante la notte a 4 °C in un tubo da 50 ml o in un contenitore simile.
   NOTA: Prima di eseguire la perfusione transcranica, l'animale deve essere profondamente anestetizzato. Negli esempi presentati in questo protocollo, tutti gli animali sono stati anestetizzati usando ketamina e xilazina (rispettivamente 90% e 10%).
2. Sostituire pfa con soluzione di idrogel (HS; vedere Tabella 1) per 48 ore a 4 °C.
   NOTA: Non lasciare che i materiali diventino più caldi della temperatura di refrigerazione (4-8 °C) in questa fase, altrimenti l'idrogel polimerizzerà. L'HS utilizzato in questo protocollo contiene il 2% di acrilammide, a differenza dei protocolli precedenti che suggerivano il 4% ²² o l'1% ¹⁷. Il vantaggio del 2% è dettagliato nella sezione di discussione. Quando si prepara l'HS, lavorare su una superficie ghiacciata. Conservare a -20 °C.
3. Degasaggio
   NOTA: Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere tutto l'ossigeno libero dal tessuto poiché O₂ interferisce con il processo di polimerizzazione. È possibile utilizzare qualsiasi gas diverso da O₂ (ad esempio, N₂, CO₂); N₂ è raccomandato.
   1. Trasferire l'N₂ dal serbatoio tramite un tubo flessibile (interno) da 5 mm, collegato a un ago da 19 G alla sua estremità (Figura 1B).
   2. Praticare due piccoli fori (larghi un ago) nel cappuccio del tubo: uno per introdurre il gas e l'altro per consentire all'aria di lasciare il tubo (Figura 1C).
   3. Collegare il tubo dal gas N₂ al tubo e sostituire i gas per circa 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
   4. Rimuovere il tubo e sigillare immediatamente i fori con argilla modellante su ogni tubo (Figura 1D).
4. Trasferire i tubi sigillati degassati in un bagno a 37 °C per 3,5 ore per polimerizzare l'HS, che diventerà un gel. Fare attenzione a non scuotere i tubi (Figura 1E).
5. Estrarre il cervello dal tubo e rimuovere delicatamente il gel polimerizzato da intorno ad esso usando salviette da laboratorio. Assicurarsi che nessun gel residuo rimanga attaccato alla superficie del tessuto, in quanto potrebbe reagire con la soluzione nei passaggi seguenti, inibendo il processo di pulizia dei tessuti (Figura 1F).
   NOTA: Poiché il gel conteneva PFA, l'estrazione deve essere effettuata sotto una cappa aspirante.
6. Taglia il cervello se la domanda a portata di mano richiede solo una parte di esso. Dividerlo a metà o in fette molto spesse che contengono tutte le aree di interesse (Figura 1G).
7. Introdurre le fette nella prima soluzione di compensazione (CS1, vedere tabella 2) in un nuovo contenitore e agitare a 70 giri/min per 24 ore a 37 °C.
8. Seguire i passaggi descritti di seguito per trasferire il cervello da CS1 alla seconda soluzione di compensazione (CS2, vedere Tabella 2).
   1. Preparare un tubo perforato per il cervello in anticipo (Figura 1H).
   2. Preriscaldare CS2 a 40-45 °C in un becher abbastanza grande da contenere il tubo. Fallo su una piastra elettrica con un agitatore. Assicurarsi che la temperatura non raggiunga i 55 °C per evitare lo sbiancamento delle proteine espresse.
   3. Posizionare il becher riempito con CS2 e il tubo perforato su un dispositivo di agitazione (un becher da 2 L nella Figura 1I). Impostare una velocità di agitazione moderata che causerà il flusso del liquido senza distorcere il tessuto.
      NOTA: Entro 2-6 settimane, il tessuto diventerà trasparente (il processo inizia alla periferia e si muove verso l'interno verso le strutture cerebrali centrali). La decisione su quando il tessuto è "abbastanza chiaro" dipende dal giudizio personale. Il cervello dovrebbe essere sufficientemente trasparente per l'imaging al microscopio senza interferenze (Figura 1J non abbastanza chiara; Figura 1K abbastanza chiaro). Superare il punto in cui il tessuto è abbastanza chiaro può causare la perdita di rigidità del tessuto.
9. Trasferimento da CS2 a PBST (0,5% Triton X-100 in PBS, vedere Tabella 2) in un nuovo contenitore a 37 °C con lieve agitazione (70 giri/min) per 24 ore.
   NOTA: Nel PBST, il tessuto diventerà biancastro (Figura 1L). La chiarezza tornerà (e migliorerà) quando incorporata nella soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RIMS, vedere il passaggio 2.14).
10. Sostituire il PBST con il nuovo PBST. Conservare nelle stesse condizioni (37 °C con lieve agitazione) per altre 24 ore.
11. Sostituire nuovamente PBST con il nuovo PBST e mantenere a RT per 24 ore.
12. Trasferimento a PBS a RT per 24 ore.
13. Sostituire il PBS e partire a RT per ulteriori 24 ore.
14. Rimuovere il cervello da PBS e trasferirlo a RIMS a 37 °C durante la notte.
    NOTA: Inizialmente, le increspature nei RIMS possono circondare il cervello. Questo protocollo è stato progettato e convalidato utilizzando due SPECIFICI RIMS commerciali (vedi Tabella 3). Tuttavia, il protocollo non dovrebbe differire quando si utilizzano altri RIMS (commerciali o autoprodotti).
15. Mantenere il tessuto a RT per altre 24 ore o fino a quando la soluzione raggiunge il pieno equilibrio, cioè quando il tessuto diventa trasparente e la soluzione non contiene più increspature visibili (Figura 1M).
16. Se il tessuto è trasparente, procedere alla preparazione della camera. Se a questo punto, il tessuto diventa bianco anziché trasparente (a causa di aggregati di molecole SDS residue), pulire nuovamente il campione ripetendo i passaggi 2.9 e 2.10 e trasferire il tessuto a CS2 (passaggio 2.8) per alcuni giorni, seguiti da tutti i passaggi fino al passaggio 2.15.

3. Preparazione della camera

NOTA: Ogni campione richiede un vetrino con una camera di imaging in cui verrà posizionato il campione.

1. Posizionare il campione al centro della diapositiva.
2. Usando una pistola per colla a caldo, crea pareti ai bordi della diapositiva, alte quasi quanto il tessuto. Assicurarsi di lasciare un piccolo spazio (circa 5 mm) in uno degli angoli (Figura 2A,B).
3. Applicare 1-2 gocce di RIMS sul campione per mantenere umida la superficie superiore ed evitare la formazione di bolle tra il coverslip e il tessuto.
4. Subito dopo aver applicato le gocce RIMS, aggiungere l'ultimo strato di colla a caldo alle pareti (in modo che raggiungano l'altezza del cervello / fetta) e procedere immediatamente (mentre la colla a caldo è ancora liquida) al punto 3.5.
5. Sigillare la parte superiore con una cartella, posizionandola nel modo più uniforme possibile sulla parte superiore dello strato di colla a caldo ancora caldo (Figura 2C).
6. Riempire la camera con il RIMS attraverso lo spazio lasciato nelle pareti della colla a caldo (Figura 2D,E).
7. Chiudere lo spazio con la colla a caldo. Non lasciare aria all'interno (Figura 2F).
8. Se le pareti di colla a caldo si estendono oltre i bordi della diapositiva, tagliare i bordi di estensione (Figura 2G).
9. Se l'obiettivo utilizzato per l'imaging è immerso, aggiungere altri 2-3 mm di colla alle pareti sopra il coperchio in modo che la soluzione di immersione duri per un periodo più lungo (Figura 2H).

4. Imaging (confocale o a due fotoni)

1. Verificare se il palco può contenere la camera, poiché lo spessore della camera può raggiungere diversi millimetri.
   NOTA: Ad esempio, il microscopio confocale (vedi la Tabella dei materiali) utilizzato in questo protocollo è dotato di diversi stadi (ad esempio, circolare, rettangolare). Qualunque stadio venga scelto per contenere la camera è irrilevante fintanto che i suoi parametri si adattano alle dimensioni della camera.
2. Lavora con un obiettivo con una distanza di lavoro sufficiente, cioè una distanza di lavoro minima ≥3 mm, poiché la regione del cervello di interesse può essere profonda pochi millimetri e il coverslip potrebbe non essere completamente dritto poiché è stato posizionato manualmente.
   NOTA: A titolo dimostrativo, i risultati presentati in Figura 1, Video 1 e Video 2 sono stati ottenuti al microscopio a due fotoni utilizzando un obiettivo 16x ad immersione in acqua con una distanza di lavoro di 3 mm e un ingrandimento di 2,4 per ottenere un campo visivo di 652 x 483 μm e una pila z con intervalli di 0,937 μm tra i piani.
3. Eseguire l'imaging multi-area, che potrebbe richiedere alcune ore o addirittura giorni. Assicurati che ci sia un ampio spazio di archiviazione libero nel computer poiché la dimensione di ogni immagine può raggiungere fino a decine di gigabit.
   NOTA: l'imaging CLARITY può comportare un numero significativamente maggiore di sezioni di immagine in profondità. Pertanto, le intensità utilizzate per acquisire l'espressione dovrebbero essere relativamente basse per evitare la sovraespressione durante la sommatoria dell'immagine.
4. Per gli obiettivi di immersione, controllare il liquido di routine durante l'imaging e integrare con liquido aggiuntivo, se necessario.
   NOTA: Durante l'imaging dei dati presentati nel Video 3, l'acqua è stata aggiunta alla superficie della camera ogni 6-8 ore per combattere l'evaporazione.
5. Dopo che l'immagine è stata acquisita, visualizzala e analizzala utilizzando diversi pacchetti software.
   NOTA: il software consigliato include Imaris e SyGlass sia per la visualizzazione che per l'analisi. La pipeline precisa per la ricostruzione ottimizzata degli astrociti utilizzando il software Imaris è stata descritta in precedenza⁹. In breve, le caratteristiche di Imaris utilizzate in questo studio erano Filamenti per ricostruire completamente le strutture cellulari e Macchie per estrarre la posizione nello spazio di tutti i somata.

Risultati

La corretta eliminazione di spesse fette di tessuto cerebrale si traduce in una nuova gamma di domande che possono essere poste riguardo alle proprietà di grandi popolazioni cellulari rispetto alle proprietà di singole cellule o gruppi vicini di cellule. Per ottenere risultati di successo, si dovrebbe rispettare rigorosamente il protocollo CLARITY, in quanto esiste una vasta gamma di parametri che devono essere considerati per ridurre la varianza tra i campioni (ad esempio, percentuale di chiarezza, informazioni sulla ...

Discussione

I metodi di compensazione dei tessuti rappresentano uno strumento rivoluzionario nella ricerca sul cervello, invitando a domande che in precedenza non avrebbero potuto essere poste. Dal targeting delle proprietà di un piccolo gruppo di cellule, una singola cellula o anche una singola sinapsi, CLARITY ora consente il targeting di popolazioni cellulari totali o funzionalità di connettività a lungo raggio utilizzando fluorofori pertinenti.

Il risultato dell'espressione del fluoroforo e della c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect astrocytes
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neuronal nuclei
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
Acrylamide (40%)	Bio-rad	#161-0140
Bisacrylamide (2%)	Bio-rad	#161-0142
Boric acid	Sigma	#B7901	Molecular weight - 61.83 g/mol
Confocal microscope, scanning, FV1000	Olympus		4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)
Imaris software	Bitplane, UK		A software that allows 3D analysis of images
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4%	EMS	#15710
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
SyGlass software			A software that allows 3D analysis of images using virtual reality
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	Molecular weight - 121.14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
Two photon microscope	Neurolabware		Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365