Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen in geräumten Gehirnen

Zusammenfassung

Die Kombination von viraler Vektortransduktion und Gehirn-Clearing mit der CLARITY-Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung einer großen Anzahl von Neuronen und Astrozyten.

Zusammenfassung

Die Kombination von viraler Vektortransduktion und Gewebereinigung mit der CLARITY-Methode ermöglicht es, mehrere Arten von Gehirnzellen und deren Wechselwirkungen gleichzeitig zu untersuchen. Die virale Vektortransduktion ermöglicht die Markierung verschiedener Zelltypen in verschiedenen Fluoreszenzfarben innerhalb desselben Gewebes. Zellen können genetisch durch Aktivität oder Projektion identifiziert werden. Unter Verwendung eines modifizierten CLARITY-Protokolls ist die potenzielle Stichprobengröße von Astrozyten und Neuronen um 2-3 Größenordnungen gewachsen. Der Einsatz von CLARITY ermöglicht die Abbildung kompletter Astrozyten, die zu groß sind, um in ihrer Gesamtheit in Scheiben zu passen, und die Untersuchung der Somata mit all ihren Prozessen. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, die räumliche Interaktion zwischen Astrozyten und verschiedenen neuronalen Zelltypen zu untersuchen, nämlich die Anzahl der pyramidenförmigen Neuronen in jeder astrozytischen Domäne oder die Nähe zwischen Astrozyten und spezifischen inhibitorischen Neuronenpopulationen. In diesem Beitrag wird ausführlich beschrieben, wie diese Methoden anzuwenden sind.

Einleitung

In den letzten Jahren hat das Wissen über die Funktion von Astrozyten und wie sie mit neuronalen Schaltkreisen interagieren, dramatisch zugenommen. Astrozyten können die Plastizität beeinflussen ^1,2, die neuronale Erholung nach einer Verletzung^{unterstützen 3,4} und sogar eine de novo neuronale Potenzierung induzieren, wobei neuere Studien die Bedeutung von Astrozyten für den Gedächtniserwerb und die Belohnung zeigen, die bisher als rein neuronale Funktionen angesehen wurden ^5,6,7 . Ein Merkmal von besonderem Interesse in der Astrozytenforschung ist die räumliche Anordnung der Zellen, die einzigartige räumliche Organisationen im Hippocampus und anderen Gehirnstrukturen aufrechterhalten ^8,9,10. Im Gegensatz zu den neuronalen Dendriten, die sich zwischen den Zellsomata verflechten, bewohnen Hippocampus-Astrozyten visuell unterscheidbare Territorien mit leichten Überlappungen zwischen ihren Prozessen, wodurch unterschiedliche Domänen^entstehen 8,11,12,13. Die Beweise, die die Teilnahme von Astrozyten an neuronalen Schaltkreisen unterstützen, unterstützen nicht das Fehlen einer detaillierten anatomischen Beschreibung solcher Populationen und der Neuronen in ihren Domänen¹⁴.

Virale Vektortransduktionsverfahren wurden zusammen mit transgenen Tieren (TG) als Werkzeugset zur Untersuchung von Gehirnstrukturen, -funktionen und Zellinteraktionen^{populär gemacht 15,16}. Die Verwendung verschiedener Promotoren ermöglicht das Targeting spezifischer Zellen entsprechend ihren genetischen Eigenschaften, Aktivierungsstufen^17,18 oder Projektionszielen. Verschiedene Viren können in verschiedenen Populationen verschiedenfarbige Fluorophore exprimieren. Ein Virus kann mit der endogenen Expression von Fluorophoren in TG kombiniert werden, oder TG-Tiere können ohne Viren verwendet werden. Diese Techniken werden häufig für die neuronale Markierung verwendet, und einige Labore haben begonnen, sie mit Modifikationen zu verwenden, die auf andere Zelltypen wie Astrozyten ^5,9,19 spezialisiert sind.

Die CLARITY-Technik, die erstmals ^{2013 20,21} beschrieben wurde, ermöglicht die Untersuchung dicker Hirnschnitte, indem sie das gesamte Gehirn transparent macht und gleichzeitig die mikroskopischen Strukturen intakt lässt. Durch die Kombination der beiden Methoden - virale Vektortransduktion und Gewebereinigung - steht nun die Möglichkeit zur Verfügung, die räumlichen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltyppopulationen zu untersuchen. Die meisten Astrozyten-Neuronen-Interaktionsstudien wurden an dünnen Gehirnschnitten durchgeführt, was zu Bildern unvollständiger Astrozyten aufgrund ihrer großen Domänen führte, wodurch die Anzahl der analysierten Zellen radikal eingeschränkt wurde. Die Verwendung der CLARITY-Technik ermöglicht die gleichzeitige Charakterisierung von Zellpopulationen in großflächigen Volumina mit Einzelzellauflösung. Die Abbildung fluoreszierend markierter Zellpopulationen in klaren Gehirnen liefert keine synaptische Auflösung, sondern ermöglicht eine gründliche Charakterisierung der räumlichen Wechselwirkungen zwischen Astrozyten und einer Vielzahl von neuronalen Zelltypen.

Aus diesem Grund nutzten wir diese hochmodernen Techniken, um die Eigenschaften von Astrozyten im gesamten dorsalen CA1 zu untersuchen und alle Lamina (Stratum Radiatum, Pyramidenschicht und Stratum Oriens) abzubilden. Wir haben Zehntausende von Astrozyten (mit einer Viruspenetranz von >96%⁵) gemessen und dabei die Informationen der gesamten astrozytischen Population um CA1 analysiert. Mit effizienter Penetranz der neuronalen Marker konnten wir die Wechselwirkungen zwischen der gesamten Population von CA1-Astrozyten und den vier Arten von neuronalen Zellen - Parvalbumin (PV), Somatostatin (SST), VIP-hemmenden Neuronen und exzitatorischen Pyramidenzellen⁹ - aufzeichnen.

Mehrere Experimente wurden mit einer Kombination aus Fluoreszenz von TG-Tieren und verschiedenfarbigen viralen Vektoren (alle inhibitorischen Zellen) durchgeführt, während andere (exzitatorisch) zwei virale Vektoren verwendeten, die verschiedene Fluorophore unter verschiedenen Promotoren exprimierten⁹. Dieses Papier stellt ein detailliertes Protokoll vor, einschließlich der Markierung der gewünschten Zellen im Gehirn, der Transparentmachung des Gehirns mit einem modifizierten CLARITY-Verfahren sowie der Bildgebung und Analyse kompletter Gehirnstrukturen mit verschiedenen Verfahren und Software.

Protokoll

Die Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der Hebrew University genehmigt und entsprachen den Richtlinien des National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Virale Vektortransduktion

HINWEIS: Virale Vektortransduktion wird verwendet, um Fluorophore im Gehirn zu exprimieren.

1. Verwenden Sie einen Atlas (z. B. Allen Brain Atlas), um die relevante Koordination des Zielbereichs zu lokalisieren.
   HINWEIS: 3D-Atlanten können online gefunden werden (z. B. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
2. Injizieren Sie mittels stereotaktischer Chirurgie die viralen Vektoren in die relevante Gehirnstruktur. Siehe⁹ für ein detailliertes Protokoll.
3. Warten Sie 3-6 Wochen auf die Fluorophorexpression.
   HINWEIS: Eine kurze Zeitspanne reicht aus, wenn nur Zellkörper markiert werden müssen. Wenn die axonalen Projektionen für die Fragestellung relevant sind, wird ein langer Zeitraum benötigt, da es länger dauert, bis sich die Fluorophore in Axonen exprimieren, die mehrere Millimeter lang sein können.
4. Validieren Sie die Spezifität und Penetranz der Fluorophorexpression (sowohl der viralen Expression als auch der TG-Tiere) im Voraus (Abbildung 1A). Bevor Sie mit dem CLARITY-Verfahren fortfahren, bestimmen Sie mindestens ein Gehirn für dünne Scheiben und stellen Sie sicher, dass die Fluorophorexpression sowohl stark als auch spezifisch für das Zielzellmerkmal ist.

2. KLARHEIT

HINWEIS: Diese Methode macht das Gehirn innerhalb von 2-6 Wochen transparent.

1. Führen Sie eine transkranielle Perfusion an Tieren mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch, gefolgt von 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Entfernen Sie das Gehirn und halten Sie es in PFA über Nacht bei 4 ° C in einem 50 ml Röhrchen oder einem ähnlichen Behälter.
   HINWEIS: Bevor eine transkranielle Perfusion durchgeführt wird, muss das Tier tief betäubt werden. In den in diesem Protokoll vorgestellten Beispielen wurden alle Tiere mit Ketamin und Xylazin (90% bzw. 10%) betäubt.
2. Ersetzen Sie PFA durch Hydrogellösung (HS; siehe Tabelle 1) für 48 h bei 4 °C.
   HINWEIS: Lassen Sie die Materialien in diesem Stadium nicht wärmer als die Kühltemperatur (4-8 ° C) werden, da sonst das Hydrogel polymerisiert. Das in diesem Protokoll verwendete HS enthält 2% Acrylamid, im Gegensatz zu früheren Protokollen, die 4% ²² oder 1% ¹⁷ vorschlagen. Der Nutzen von 2% wird im Diskussionsabschnitt beschrieben. Arbeiten Sie bei der Vorbereitung des HS auf einer eiskalten Oberfläche. Lagern Sie es bei -20 °C.
3. Entgasung
   HINWEIS: Der Zweck dieser Phase besteht darin, den gesamten freien Sauerstoff aus dem Gewebe zu entfernen_{, da O2} den Polymerisationsprozess stört. Es kann jedes Nicht-O2-Gas verwendet werden (z. B._N2, CO₂); N 2 wird empfohlen_.
   1. Übertragen Sie den N₂ aus dem Tank über einen 5 mm (internen) flexiblen Schlauch, der an seinem Ende mit einer 19-G-Nadel verbunden ist (Abbildung 1B).
   2. Machen Sie zwei kleine Löcher (nadelbreit) in die Kappe des Rohres: eines, um das Gas einzuführen, und das andere, damit die Luft das Rohr verlassen kann (Abbildung 1C).
   3. Befestigen Sie das Rohr aus dem_N2-Gas am Rohr und ersetzen Sie die Gase für ca. 30 min bei Raumtemperatur (RT).
   4. Entfernen Sie das Rohr und schließen Sie die Löcher sofort mit Modelliermasse auf jedem Rohr ab (Abbildung 1D).
4. Die entgasten versiegelten Rohre für 3,5 h in ein 37 °C warmes Bad geben, um das HS zu polymerisieren, das zu einem Gel wird. Achten Sie darauf, die Röhren nicht zu schütteln (Abbildung 1E).
5. Extrahieren Sie das Gehirn aus der Tube und entfernen Sie das polymerisierte Gel vorsichtig mit Labortüchern aus der Umgebung. Stellen Sie sicher, dass kein Restgel an der Oberfläche des Gewebes haftet, da es in den folgenden Schritten mit der Lösung reagieren und den Gewebereinigungsprozess hemmen könnte (Abbildung 1F).
   HINWEIS: Da das Gel PFA enthielt, sollte die Extraktion unter einem Abzug erfolgen.
6. Schneiden Sie das Gehirn auf, wenn die vorliegende Frage nur einen Teil davon benötigt. Teilen Sie es in zwei Hälften oder in sehr dicke Scheiben, die alle Bereiche von Interesse enthalten (Abbildung 1G).
7. Legen Sie die Scheiben in der First Clearing Solution (CS1, siehe Tabelle 2) in einen neuen Behälter und schütteln Sie sie bei 70 U/min für 24 h bei 37 °C.
8. Führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus, um das Gehirn von CS1 auf die zweite Clearing-Lösung (CS2, siehe Tabelle 2) zu übertragen.
   1. Bereiten Sie im Voraus einen perforierten Schlauch für das Gehirn vor (Abbildung 1H).
   2. CS2 in einem Becherglas, das groß genug ist, um das Röhrchen aufzunehmen, auf 40-45 °C vorheizen. Tun Sie dies auf einer Kochplatte mit einem Rührer. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur nicht 55 ° C erreicht, um das Ausbleichen der exprimierten Proteine zu verhindern.
   3. Legen Sie das mit CS2 gefüllte Becherglas und das perforierte Rohr auf eine Rührvorrichtung (ein 2-Liter-Becherglas in Abbildung 1I). Stellen Sie eine moderate Rührrate ein, die dazu führt, dass die Flüssigkeit fließt, ohne das Gewebe zu verzerren.
      HINWEIS: Innerhalb von 2-6 Wochen wird das Gewebe transparent (der Prozess beginnt an der Peripherie und bewegt sich nach innen in Richtung der zentralen Gehirnstrukturen). Die Entscheidung, wann das Gewebe "klar genug" ist, liegt im persönlichen Urteil. Das Gehirn sollte ausreichend transparent sein, um unter dem Mikroskop ohne Interferenz abbilden zu können (Abbildung 1J nicht klar genug; Abbildung 1K klar genug). Das Überschreiten des Punktes, an dem das Gewebe klar genug ist, kann zu einem Verlust der Gewebesteifigkeit führen.
9. Transfer von CS2 in PBST (0,5% Triton X-100 in PBS, siehe Tabelle 2) in einem neuen Behälter bei 37 °C mit leichtem Schütteln (70 U/min) für 24 h.
   HINWEIS: Im PBST wird das Gewebe weißlich (Abbildung 1L). Die Klarheit kehrt zurück (und verbessert sich), wenn sie in die Refractive Index Matching Solution (RIMS, siehe Schritt 2.14) eingebettet ist.
10. Ersetzen Sie die PBST durch eine neue PBST. Unter den gleichen Bedingungen (37 °C mit leichtem Schütteln) für weitere 24 h aufbewahren.
11. Ersetzen Sie PBST wieder durch neue PBST und behalten Sie sie 24 Stunden bei RT.
12. Transfer zu PBS bei RT für 24 h.
13. Ersetzen Sie die PBS und lassen Sie sie bei RT für weitere 24 Stunden.
14. Entfernen Sie das Gehirn von PBS und übertragen Sie es über Nacht auf RIMS bei 37 ° C.
    HINWEIS: Anfangs können Wellen im RIMS das Gehirn umgeben. Dieses Protokoll wurde unter Verwendung von zwei spezifischen kommerziellen RIMS entwickelt und validiert (siehe Tabelle 3). Das Protokoll sollte sich jedoch nicht unterscheiden, wenn andere RIMS (kommerziell oder selbst hergestellt) verwendet werden.
15. Halten Sie das Gewebe bei RT für weitere 24 h oder bis die Lösung das volle Gleichgewicht erreicht, d. h. wenn das Gewebe transparent wird und die Lösung keine sichtbaren Wellen mehr enthält (Abbildung 1M).
16. Wenn das Gewebe transparent ist, fahren Sie mit der Kammervorbereitung fort. Wenn das Gewebe zu diesem Zeitpunkt weiß statt transparent wird (aufgrund von Aggregaten von verbleibenden SDS-Molekülen), reinigen Sie die Probe erneut, indem Sie die Schritte 2.9 und 2.10 wiederholen, und übertragen Sie das Gewebe für einige Tage in CS2 (Schritt 2.8), gefolgt von allen Schritten bis Schritt 2.15.

3. Kammervorbereitung

HINWEIS: Jede Probe benötigt einen Objektträger mit einer Bildgebungskammer, in die die Probe gelegt wird.

1. Platzieren Sie die Probe in der Mitte des Objektträgers.
2. Erstellen Sie mit einer Heißklebepistole Wände an den Rändern des Objektträgers, die fast so hoch sind wie das Gewebe. Achten Sie darauf, einen kleinen Spalt (ca. 5 mm) an einer der Ecken zu lassen (Abbildung 2A,B).
3. Tragen Sie 1-2 Tropfen des RIMS auf die Probe auf, um die Oberseite feucht zu halten und zu verhindern, dass sich Blasen zwischen dem Deckglas und dem Gewebe bilden.
4. Unmittelbar nach dem Auftragen der RIMS-Tropfen fügen Sie die letzte Schicht Heißkleber zu den Wänden hinzu (so dass sie die Höhe des Gehirns / der Scheibe erreichen) und gehen Sie sofort (während der Heißkleber noch flüssig ist) zu Schritt 3.5 fort.
5. Verschließen Sie die Oberseite mit einem Deckglas und legen Sie es so gleichmäßig wie möglich auf die Oberseite der noch warmen Heißkleberschicht (Abbildung 2C).
6. Füllen Sie die Kammer mit den RIMS durch den Spalt in den Heißklebewänden (Abbildung 2D,E).
7. Schließen Sie die Lücke mit Heißkleber. Lassen Sie keine Luft im Inneren (Abbildung 2F).
8. Wenn die Heißklebewände über die Grenzen des Objektträgers hinausragen, schneiden Sie die ausladenden Kanten ab (Abbildung 2G).
9. Wenn das für die Bildgebung verwendete Objektiv eingetaucht ist, fügen Sie weitere 2-3 mm Kleber an die Wände über dem Deckglas hinzu, damit die Tauchlösung länger hält (Abbildung 2H).

4. Bildgebung (konfokal oder Zwei-Photonen)

1. Prüfen Sie, ob der Tisch die Kammer halten kann, da die Dicke der Kammer mehrere Millimeter erreichen kann.
   HINWEIS: Zum Beispiel ist das konfokale Mikroskop (siehe Materialtabelle), das in diesem Protokoll verwendet wird, mit mehreren Stufen ausgestattet (z. B. kreisförmig, rechteckig). Welche Stufe gewählt wird, um die Kammer zu halten, ist irrelevant, solange ihre Parameter zu den Kammergrößen passen.
2. Arbeiten Sie mit einem Objektiv mit einem ausreichenden Arbeitsabstand, d.h. einem minimalen Arbeitsabstand ≥3 mm, da die interessierende Hirnregion einige Millimeter tief sein kann und das Deckglas möglicherweise nicht vollständig gerade ist, da es manuell platziert wurde.
   HINWEIS: Als Demonstration wurden die in Abbildung 1, Video 1 und Video 2 dargestellten Ergebnisse unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop unter Verwendung eines 16-fachen Wasserimmerzobjektivs mit einem Arbeitsabstand von 3 mm und einer Vergrößerung von 2,4 erhalten, um ein Sichtfeld von 652 x 483 μm und einen Z-Stack mit 0,937 μm-Intervallen zwischen den Ebenen zu erhalten.
3. Führen Sie eine mehrbereichige Bildgebung durch, die einige Stunden oder sogar Tage dauern kann. Stellen Sie sicher, dass auf dem Computer ausreichend freier Speicherplatz vorhanden ist, da die Größe jedes Bildes bis zu zehn Gigabit erreichen kann.
   HINWEIS: Die CLARITY-Bildgebung kann zu deutlich mehr Bildausschnitten in der Tiefe führen. Daher sollten die Intensitäten, die zum Erfassen des Ausdrucks verwendet werden, relativ niedrig sein, um eine Überexpression während der Bildsummierung zu verhindern.
4. Für Tauchobjektive überprüfen Sie die Flüssigkeit routinemäßig während der Bildgebung und ergänzen Sie sie bei Bedarf mit zusätzlicher Flüssigkeit.
   HINWEIS: Während der Bildgebung der in Video 3 dargestellten Daten wurde der Oberfläche der Kammer alle 6-8 h Wasser hinzugefügt, um die Verdunstung zu bekämpfen.
5. Nachdem das Bild aufgenommen wurde, können Sie es mit verschiedenen Softwarepaketen anzeigen und analysieren.
   HINWEIS: Die empfohlene Software umfasst Imaris und SyGlass für die Visualisierung und Analyse. Die genaue Pipeline zur optimierten Rekonstruktion von Astrozyten mit der Imaris-Software wurde bereits⁹ beschrieben. Kurz gesagt, die Imaris-Merkmale, die in dieser Studie verwendet wurden, waren Filamente, um Zellstrukturen vollständig zu rekonstruieren, und Spots, um die Position im Raum aller Somata zu extrahieren.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Beseitigung dicker Hirngewebeschnitte führt zu einer neuen Reihe von Fragen, die in Bezug auf die Eigenschaften von großzelligen Populationen im Gegensatz zu den Eigenschaften einzelner Zellen oder benachbarter Zellgruppen gestellt werden können. Um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen, sollte man sich strikt an das CLARITY-Protokoll halten, da es eine Vielzahl von Parametern gibt, die berücksichtigt werden müssen, um die Varianz zwischen den Proben zu reduzieren (z. B. Prozentsatz der Klarheit, Fluo...

Diskussion

Gewebe-Clearing-Methoden stellen ein revolutionäres Werkzeug in der Hirnforschung dar und laden zu Fragen ein, die bisher nicht hätten gestellt werden können. CLARITY zielt nicht mehr auf die Eigenschaften einer kleinen Gruppe von Zellen, einer einzelnen Zelle oder sogar einer einzelnen Synapse ab und ermöglicht nun das Targeting von Gesamtzellpopulationen oder langreichweitigen Konnektivitätsmerkmalen durch die Verwendung relevanter Fluorophore.

Das Ergebnis der Kombination aus Fluoropho...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect astrocytes
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neuronal nuclei
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		viral vector used to detect neurons
Acrylamide (40%)	Bio-rad	#161-0140
Bisacrylamide (2%)	Bio-rad	#161-0142
Boric acid	Sigma	#B7901	Molecular weight - 61.83 g/mol
Confocal microscope, scanning, FV1000	Olympus		4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)
Imaris software	Bitplane, UK		A software that allows 3D analysis of images
NaOH	Sigma	#S5881
PBS
PFA 4%	EMS	#15710
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SDS	Sigma	#L3771
SyGlass software			A software that allows 3D analysis of images using virtual reality
Tris base 1 M	Bio-rad	#002009239100	Molecular weight - 121.14 g/mol
Triton X-100	ChemCruz	#sc-29112A
Two photon microscope	Neurolabware		Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365