Visualización de la motilidad bacteriana basada en una reacción de color

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para detectar la motilidad bacteriana basada en una reacción de color. Las ventajas clave de este método son que es fácil de evaluar y más preciso, y no requiere equipo especializado.

Resumen

La motilidad bacteriana es crucial para la patogenicidad bacteriana, la formación de biopelículas y la resistencia a los medicamentos. La motilidad bacteriana es crucial para la invasión y/o diseminación de muchas especies patógenas. Por lo tanto, es importante detectar la motilidad bacteriana. Las condiciones de crecimiento bacteriano, como el oxígeno, el pH y la temperatura, pueden afectar el crecimiento bacteriano y la expresión de flagelos bacterianos. Esto puede conducir a una motilidad reducida o incluso a la pérdida de motilidad, lo que resulta en la evaluación inexacta de la motilidad bacteriana. Basado en la reacción de color del cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) por deshidrogenasas intracelulares de bacterias vivas, TTC se agregó al agar semisólido tradicional para la detección de la motilidad bacteriana. Los resultados mostraron que este método de agar semisólido TTC para la detección de la motilidad bacteriana es simple, fácil de operar y no involucra instrumentos grandes y costosos. Los resultados también mostraron que la mayor motilidad se observó en medio semisólido preparado con agar 0,3%. En comparación con el medio semisólido tradicional, los resultados son más fáciles de evaluar y más precisos.

Introducción

La motilidad bacteriana juega un papel crítico en la patogenicidad bacteriana, la formación de biopelículas y la resistencia a los medicamentos¹. La motilidad bacteriana está estrechamente asociada con la patogenicidad y es necesaria para la colonización bacteriana durante la infección temprana de las células huésped². La formación de biopelículas está estrechamente relacionada con la motilidad bacteriana, donde las bacterias se adhieren a la superficie de los medios sólidos a través de la motilidad. Durante mucho tiempo se ha considerado que la motilidad bacteriana se correlaciona positivamente con la formación de biopelículas. Un alto grado de resistencia bacteriana a los medicamentos debido al biofilm puede conducir a infecciones persistentes que son una amenaza para la salud humana ^3,4,5. Por lo tanto, es importante detectar la motilidad bacteriana. La prueba de motilidad bacteriana se utiliza principalmente para examinar la motilidad de diferentes formas de bacterias en el estado vivo, lo que puede determinar indirectamente la presencia o ausencia de flagelos y, por lo tanto, tiene un papel importante en la identificación de bacterias.

Existen métodos directos e indirectos para detectar la motilidad bacteriana⁶. Como las bacterias con flagelos muestran motilidad, es posible detectar si las bacterias son móviles indirectamente detectando la presencia o ausencia de flagelos. Por ejemplo, es posible detectar la motilidad indirectamente mediante microscopía electrónica y tinción flagelar para indicar que las bacterias son móviles. También es posible detectar por métodos directos, como la caída de suspensión y los métodos de punción semisólida.

El método de punción semisólida comúnmente utilizado en los laboratorios de microbiología de pregrado para detectar la motilidad bacteriana inocula a las bacterias en la punción en el medio de agar semisólido que contiene 0.4-0.8% de agar, de acuerdo con la dirección del crecimiento bacteriano. Si las bacterias crecen a lo largo de la línea de punción para extenderse, aparecen rastros de crecimiento en forma de nube (en forma de cepillo), lo que indica la presencia de flagelos y, por lo tanto, motilidad. Si no hay rastros de crecimiento de la línea de perforación, la bacteria no es flagelada ni móvil.

Sin embargo, este método tiene sus inconvenientes: las bacterias son incoloras y transparentes, la actividad flagelar se ve afectada por las características fisiológicas de las bacterias vivas y otros factores, y la concentración de agar y el pequeño diámetro del tubo de ensayo. Además, las bacterias aeróbicas solo son adecuadas para el crecimiento en la superficie del agar, lo que afecta la observación de la motilidad bacteriana. Por lo tanto, para mejorar este experimento, se agregó cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (incoloro) al medio para establecer un método más confiable e intuitivo para determinar la motilidad bacteriana que el método actual de punción directa utilizando deshidrogenasas intracelulares para catalizar la formación de un producto rojo de TTC 7,8,9,10.

Protocolo

1. Preparación del medio semisólido

1. Agar semisólido tradicional
   1. Prepare el agar semisólido tradicional de acuerdo con la receta del medio de prueba de motilidad bacteriana utilizando los ingredientes básicos¹¹. Disuelva 10 g de triptosa, 15 g de NaCl, 4 g de agar en suficiente agua destilada, ajuste el pH a 7.2 ± 0.2 y enrasar el volumen final a 1,000 mL.
   2. Autoclave el agar a 121 °C durante 20 min, y dispense en tubos de ensayo de 10 ml como un medio semisólido de 3 cm de altura.
2. Agar semisólido tradicional con TTC
   1. Después de esterilizar en autoclave el medio semisólido convencional, enfriarlo a 50 °C, agregar 5 ml de solución estéril de TTC al 100 ml de medio, mezclar y dispensar en tubos de ensayo de 10 ml para formar un medio semisólido de 3 cm de altura.

2. Cepas bacterianas

NOTA: Se aislaron ochenta cepas del medio acuático y se identificaron utilizando un instrumento automatizado de identificación de bacterias (ver la Tabla de materiales), incluyendo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae y Aeromonas hydrophila (Tabla 1). Staphylococcus aureus (ver la Tabla de materiales) se utilizó como un control negativo inmóvil; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella typhimurium (ver la Tabla de materiales) se utilizaron como cepas de control positivo.

1. Identificar las cepas bacterianas de prueba que se utilizarán para el análisis de la motilidad.
2. Incluye controles negativos inmóviles y tensiones móviles de control positivo.

3. Observación de la motilidad bacteriana mejorada por TTC

1. Recoger colonias individuales de bacterias problema de las placas de agar e inocularlas en los dos medios semisólidos anteriores (pasos 1.1.2 y 1.2.1) mediante punción con agujas inoculantes.
2. Cultivar los tubos a 37 °C en la incubadora durante 24-48 h para observar los resultados.
3. Observe el estado de crecimiento: caracterice las bacterias como inmóviles (-) si solo la línea de punción es roja. Caracterizar las bacterias como móviles (+) si el color rojo se extiende ligeramente hacia afuera a lo largo de la línea de punción¹².

4. Efecto de diferentes concentraciones en agar sobre la motilidad bacteriana

1. Prepare medios semisólidos que contengan agar 0.3%, 0.5% y 0.8% e inoculos por punción, como se describió anteriormente. Observe los resultados después de 24-48 h de incubación.

Resultados

Tanto las cepas estándar como las cepas aisladas se compararon para la detección de la motilidad, y los resultados se muestran en la Tabla 1. Debido a la ausencia de flagelos, Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae solo crecieron a lo largo de la línea inoculada en medios semisólidos tradicionales y TTC. En contraste, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Salmonella typhimurium mostraron crecimiento en todas las direcciones alrededor de la lín...

Discusión

La detección de la motilidad bacteriana por el método del medio semisólido se ve afectada por muchos factores^13,14. Las condiciones de crecimiento bacteriano, como el oxígeno (aeróbico en la superficie del agar, no aeróbico en la parte inferior del tubo con el medio semisólido), el pH y la temperatura, pueden afectar la viabilidad de los flagelos bacterianos, lo que puede conducir a una motilidad reducida o incluso a la pérdida de la motilidad

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Difco
Escherichia coli	ATCC	ATCC25922	Positive control
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC27853	Positive control
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028	Positive control
Staphylococcus aureus	ATCC	ATCC25923	Negative nonmotile control
Tryptose	OXOID
TTC	Sigma	298-96-4
VITEK 2 automated microbial identification system	Bio Mérieux