Visualizando a motilidade bacteriana com base em uma reação de cor

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar motilidade bacteriana baseado em uma reação de cor. As principais vantagens deste método são que é fácil de avaliar e mais preciso, e não requer equipamentos especializados.

Resumo

A motilidade bacteriana é crucial para a patogenicidade bacteriana, formação de biofilme e resistência a drogas. A motilidade bacteriana é crucial para a invasão e/ou disseminação de muitas espécies patogênicas. Portanto, é importante detectar a motilidade bacteriana. Condições de crescimento bacteriano, como oxigênio, pH e temperatura, podem afetar o crescimento bacteriano e a expressão de flagelos bacterianos. Isso pode levar à redução da motilidade ou mesmo à perda da motilidade, resultando na avaliação imprecisa da motilidade bacteriana. Com base na reação de cor do cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) por desidrogenases intracelulares de bactérias vivas, o TTC foi adicionado ao ágar semissólido tradicional para detecção da motilidade bacteriana. Os resultados mostraram que este método de ágar semissólido TTC para detecção de motilidade bacteriana é simples, fácil de operar e não envolve instrumentos grandes e caros. Os resultados também mostraram que a maior motilidade foi observada em meio semissólido preparado com 0,3% de ágar. Em comparação com o meio semissólido tradicional, os resultados são mais fáceis de avaliar e mais precisos.

Introdução

A motilidade bacteriana desempenha um papel crítico na patogenicidade bacteriana, na formação de biofilme e na resistência a drogas¹. A motilidade bacteriana está intimamente associada à patogenicidade e é necessária para a colonização bacteriana durante a infecção precoce das células do^hospedeiro2. A formação de biofilme está intimamente relacionada à motilidade bacteriana, onde as bactérias aderem à superfície do meio sólido através da motilidade. A motilidade bacteriana tem sido considerada positivamente correlacionada com a formação de biofilme. Um alto grau de resistência bacteriana a drogas devido ao biofilme pode levar a infecções persistentes que são uma ameaça à saúde humana ^3,4,5. Portanto, é importante detectar a motilidade bacteriana. O teste de motilidade bacteriana é usado principalmente para examinar a motilidade de diferentes formas de bactérias no estado vivo, que podem determinar indiretamente a presença ou ausência de flagelos e, portanto, tem um papel importante na identificação de bactérias.

Existem métodos diretos e indiretos para detectar a motilidade bacteriana⁶. Como as bactérias com flagelos apresentam motilidade, é possível detectar se as bactérias são móveis indiretamente, detectando a presença ou ausência de flagelos. Por exemplo, é possível detectar a motilidade indiretamente por microscopia eletrônica e coloração flagelar para indicar que as bactérias são móveis. Também é possível detectar por métodos diretos, como queda de suspensão e punção semissólida.

O método de punção semissólido comumente utilizado em laboratórios de microbiologia de graduação para detectar motilidade bacteriana inocula a bactéria na punção em meio ágar semissólido contendo 0,4-0,8% de ágar, de acordo com a direção do crescimento bacteriano. Se a bactéria crescer ao longo da linha de punção para se espalhar, aparecem vestígios de crescimento semelhantes a nuvens (semelhantes a escovas), indicando a presença de flagelos e, portanto, motilidade. Se não houver vestígios de crescimento na linha de punção, a bactéria não é flagelada nem móvel.

No entanto, este método tem suas desvantagens: as bactérias são incolores e transparentes, a atividade flagelar é afetada pelas características fisiológicas das bactérias vivas e outros fatores, e a concentração de ágar e o pequeno diâmetro do tubo de ensaio. Além disso, bactérias aeróbias são adequadas apenas para o crescimento na superfície do ágar, afetando a observação da motilidade bacteriana. Assim, para aprimorar este experimento, o cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) (incolor) foi adicionado ao meio para estabelecer um método mais confiável e intuitivo de determinação da motilidade bacteriana do que o método atual de punção direta, utilizando desidrogenases intracelulares para catalisar a formação de um produto vermelho do TTC 7,8,9,10.

Protocolo

1. Preparo do meio semissólido

1. Ágar semissólido tradicional
   1. Preparar o ágar semissólido tradicional de acordo com a receita do meio teste de motilidade bacteriana utilizando os ingredientes básicos¹¹. Dissolver 10 g de triptose, 15 g de NaCl, 4 g de ágar em água destilada suficiente, ajustar o pH para 7,2 ± 0,2 e perfazer o volume final para 1.000 mL.
   2. Autoclavar o ágar a 121 °C por 20 min e distribuí-lo em tubos de ensaio de 10 mL como meio semissólido de 3 cm de altura.
2. Ágar semissólido tradicional com TTC
   1. Após a autoclavagem do meio semissólido convencional, resfriá-lo a 50 °C, adicionar 5 mL de solução TTC 1% estéril a 100 mL de meio, misturar e dispensá-lo em tubos de ensaio de 10 mL para formar um meio semissólido de 3 cm de altura.

2. Cepas bacterianas

NOTA: Oitenta cepas foram isoladas do ambiente aquático e identificadas usando um instrumento automatizado de identificação bacteriana (ver Tabela de Materiais), incluindo Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp. , Klebsiella pneumoniae e Aeromonas hydrophila (Tabela 1). Staphylococcus aureus (ver Tabela de Materiais) foi utilizado como controle negativo não móvel; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium (ver Tabela de Materiais) foram utilizadas como cepas controle positivas.

1. Identificar cepas bacterianas de teste a serem usadas para análise de motilidade.
2. Inclua controles negativos não móveis e cepas de controle positivo móveis.

3. Observação da motilidade bacteriana reforçada pelo TTC

1. Seleccionar colónias únicas de bactérias de ensaio a partir de placas de ágar e inocular-as nos dois meios semissólidos acima referidos (passos 1.1.2 e 1.2.1) por punção utilizando agulhas inoculantes.
2. Cultivar os tubos a 37 °C na incubadora por 24-48 h para observar os resultados.
3. Observe o estado de crescimento: caracterize as bactérias como não móveis (-) se apenas a linha de punção for vermelha. Caracterizar as bactérias como móveis (+) se a cor vermelha se espalhar levemente para fora ao longo da linha de punção¹².

4. Efeito de diferentes concentrações de ágar sobre a motilidade bacteriana

1. Preparar meios semissólidos contendo 0,3%, 0,5% e 0,8% de ágar e inocular-os por punção, conforme descrito acima. Observe os resultados após 24-48 h de incubação.

Resultados

Tanto as cepas padrão quanto as isoladas foram comparadas para detecção da motilidade, e os resultados são mostrados na Tabela 1. Devido à ausência de flagelos, Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae cresceram apenas ao longo da linha inoculada em ambos os meios semissólido tradicional e TTC. Em contraste, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Salmonella typhimurium apresentaram crescimento em todas as direções ao redor da linhagem inocula...

Discussão

A detecção da motilidade bacteriana pelo método do meio semissólido é afetada por vários^fatores13,14. Condições de crescimento bacteriano, como oxigênio (aeróbio na superfície do ágar, não aeróbio no fundo do tubo com o meio semissólido), pH e temperatura, podem afetar a viabilidade dos flagelos bacterianos, o que pode levar à redução da motilidade ou mesmo à perda da motilidade¹⁵. Além disso, algumas bactérias do tipo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Difco
Escherichia coli	ATCC	ATCC25922	Positive control
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC27853	Positive control
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028	Positive control
Staphylococcus aureus	ATCC	ATCC25923	Negative nonmotile control
Tryptose	OXOID
TTC	Sigma	298-96-4
VITEK 2 automated microbial identification system	Bio Mérieux