Визуализация подвижности бактерий на основе цветовой реакции

Резюме

Здесь мы представляем протокол для обнаружения бактериальной подвижности, основанный на цветовой реакции. Ключевые преимущества этого метода заключаются в том, что он прост в оценке и более точен, и не требует специализированного оборудования.

Аннотация

Подвижность бактерий имеет решающее значение для патогенности бактерий, образования биопленки и лекарственной устойчивости. Подвижность бактерий имеет решающее значение для инвазии и/или распространения многих патогенных видов. Поэтому важно выявлять бактериальную подвижность. Условия роста бактерий, такие как кислород, рН и температура, могут влиять на рост бактерий и экспрессию бактериальных жгутиков. Это может привести к снижению подвижности или даже потере подвижности, что приводит к неточной оценке подвижности бактерий. Основываясь на цветовой реакции 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТС) внутриклеточными дегидрогеназами живых бактерий, ТТС добавляли к традиционному полутвердому агару для определения подвижности бактерий. Результаты показали, что этот метод обнаружения подвижности бактерий с полутвердым агаром TTC прост, удобен в эксплуатации и не требует больших и дорогостоящих инструментов. Результаты также показали, что наибольшая подвижность наблюдалась в полутвердой среде, приготовленной с 0,3% агара. По сравнению с традиционной полутвердой средой результаты легче оценить и они более точны.

Введение

Подвижность бактерий играет решающую роль в патогенности бактерий, образовании биопленки и лекарственной устойчивости¹. Бактериальная подвижность тесно связана с патогенностью и необходима для колонизации бактерий во время раннего инфицирования клеток-хозяев². Образование биопленки тесно связано с подвижностью бактерий, когда бактерии прилипают к поверхности твердой среды за счет подвижности. Долгое время считалось, что подвижность бактерий положительно коррелирует с образованием биопленки. Высокая степень бактериальной лекарственной устойчивости из-за биопленки может привести к персистирующим инфекциям, представляющим угрозу для здоровья человека ^3,4,5. Поэтому важно выявлять бактериальную подвижность. Тест на подвижность бактерий в основном используется для изучения подвижности различных форм бактерий в живом состоянии, которые могут косвенно определять наличие или отсутствие жгутиков и, таким образом, играют важную роль в идентификации бактерий.

Различают прямые и непрямые методы выявления бактериальной подвижности⁶. Поскольку бактерии со жгутиками проявляют подвижность, можно определить, являются ли бактерии подвижными косвенно, обнаружив наличие или отсутствие жгутиков. Например, можно косвенно обнаружить подвижность с помощью электронной микроскопии и окрашивания жгутиков, чтобы указать, что бактерии подвижны. Также возможно обнаружение прямыми методами, такими как капля суспензии и полутвердая пункция.

Метод полутвердой пункции, обычно используемый в микробиологических лабораториях бакалавриата для обнаружения подвижности бактерий, инокулирует бактерии в прокол в полутвердой агаровой среде, содержащей 0,4-0,8% агара, в зависимости от направления роста бактерий. Если бактерии растут вдоль линии прокола, чтобы распространиться вокруг, появляются облачные (кистевидные) следы роста, указывающие на наличие жгутиков и, следовательно, подвижность. Если нет следов роста на линии прокола, бактерия не является ни жгутиковой, ни подвижной.

Однако у этого метода есть свои недостатки: бактерии бесцветны и прозрачны, на жгутиковую активность влияют физиологические особенности живых бактерий и другие факторы, а также концентрация агара и малый диаметр пробирки. Более того, аэробные бактерии пригодны только для роста на поверхности агара, влияя на наблюдение за подвижностью бактерий. Следовательно, для улучшения этого эксперимента в среду был добавлен 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (TTC) (бесцветный), чтобы установить более надежный и интуитивно понятный метод определения подвижности бактерий, чем текущий метод прямой пункции с использованием внутриклеточных дегидрогеназ для катализа образования красного продукта TTC 7,8,9,10.

протокол

1. Приготовление полутвердой среды

1. Традиционный полутвердый агар
   1. Приготовьте традиционный полутвердый агар в соответствии с рецептурой среды для тестирования на подвижность бактерий, используя основные ингредиенты¹¹. Растворите 10 г триптозы, 15 г NaCl, 4 г агара в достаточном количестве дистиллированной воды, отрегулируйте рН до 7,2 ± 0,2 и доведите конечный объем до 1000 мл.
   2. Автоклавируйте агар при 121 ° C в течение 20 минут и распределите его в пробирки по 10 мл в виде полутвердой среды высотой 3 см.
2. Традиционный полутвердый агар с ТТС
   1. После автоклавирования обычной полутвердой среды охладите ее до 50 °C, добавьте 5 мл стерильного 1% раствора TTC к 100 мл среды, перемешайте и распределите ее в пробирки по 10 мл с образованием полутвердой среды высотой 3 см.

2. Бактериальные штаммы

ПРИМЕЧАНИЕ: Восемьдесят штаммов были выделены из водной среды и идентифицированы с помощью автоматизированного инструмента идентификации бактерий (см. Таблицу материалов), включая Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae и Aeromonas hydrophila (таблица 1). Золотистый стафилококк (см. Таблицу материалов) использовался в качестве отрицательного неподвижного контроля; В качестве положительных контрольных штаммов использовали Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella typhimurium (см. Таблицу материалов).

1. Определите тестовые штаммы бактерий, которые будут использоваться для анализа подвижности.
2. Включите отрицательные неподвижные контрольные и подвижные положительные контрольные штаммы.

3. Наблюдение за подвижностью бактерий с усилением TTC

1. Отбирают отдельные колонии исследуемых бактерий из агаровых пластин и инокулируют их в две вышеуказанные полутвердые среды (этапы 1.1.2 и 1.2.1) путем прокола с помощью инокуляционных игл.
2. Культивируют пробирки при 37 °C в инкубаторе в течение 24-48 ч, чтобы наблюдать за результатами.
3. Наблюдайте за состоянием роста: характеризуйте бактерии как неподвижные (-), если только линия прокола красная. Охарактеризуйте бактерии как подвижные (+), если красный цвет слегка распространяется наружу вдоль линии^{прокола 12}.

4. Влияние различных концентраций агара на подвижность бактерий

1. Готовят полутвердые среды, содержащие 0,3%, 0,5% и 0,8% агара, и инокулируют их путем пункции, как описано выше. Наблюдайте за результатами через 24-48 ч инкубации.

Результаты

Как стандартные, так и изолированные штаммы сравнивали для определения подвижности, и результаты приведены в таблице 1. Из-за отсутствия жгутиков Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae росли только вдоль инокулированной линии как на традиционных, так и на полутвердых средах TTC. ?...

Обсуждение

На выявление подвижности бактерий методом полутвердой среды влияет множество факторов^13,14. Условия роста бактерий, такие как кислород (аэробный на поверхности агара, неаэробный на дне пробирки с полутвердой средой), рН и температура, могут влиять на жизне...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Difco
Escherichia coli	ATCC	ATCC25922	Positive control
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC27853	Positive control
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028	Positive control
Staphylococcus aureus	ATCC	ATCC25923	Negative nonmotile control
Tryptose	OXOID
TTC	Sigma	298-96-4
VITEK 2 automated microbial identification system	Bio Mérieux