색상 반응을 기반으로 한 박테리아 운동성 시각화

요약

여기에서는 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성을 감지하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 평가하기 쉽고 정확하며 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.

초록

박테리아 운동성은 박테리아 병원성, 생물막 형성 및 약물 내성에 매우 중요합니다. 박테리아 운동성은 많은 병원성 종의 침입 및/또는 보급에 매우 중요합니다. 따라서 박테리아의 운동성을 감지하는 것이 중요합니다. 산소, pH 및 온도와 같은 박테리아 성장 조건은 박테리아 성장과 박테리아 편모의 발현에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 운동성을 감소시키거나 심지어 운동성을 상실하여 박테리아 운동성에 대한 부정확한 평가를 초래할 수 있습니다. 살아있는 박테리아의 세포 내 탈수소효소에 의한 2,3,5-트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)의 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성 검출을 위해 전통적인 반고체 한천에 TTC를 첨가했습니다. 그 결과 박테리아 운동성 검출을 위한 이 TTC 반고체 한천 방법이 간단하고 작동하기 쉬우며 크고 값비싼 기구가 필요하지 않다는 것을 보여주었습니다. 그 결과, 0.3% 한천으로 제조된 반고체 배지에서 가장 높은 운동성이 관찰되는 것으로 나타났다. 기존의 반고체 매체와 비교하여 결과를 평가하기 쉽고 정확합니다.

서문

박테리아 운동성은 박테리아 병원성, 생물막 형성 및 약물 내성에 중요한 역할을 합니다¹. 박테리아 운동성은 병원성과 밀접한 관련이 있으며, 숙주 세포의 초기 감염 동안 박테리아 집락화에 필요하다². 생물막 형성은 박테리아 운동성과 밀접한 관련이 있으며, 박테리아는 운동성을 통해 고체 배지의 표면에 부착됩니다. 박테리아의 운동성은 오랫동안 생물막 형성과 양의 상관관계가 있는 것으로 여겨져 왔습니다. 생물막으로 인한 높은 수준의 박테리아 약물 내성은 인체 건강에 위협이되는 지속적인 감염을 유발할 수 있습니다 ^3,4,5. 따라서 박테리아의 운동성을 감지하는 것이 중요합니다. 박테리아 운동성 검사는 주로 살아있는 상태에서 다양한 형태의 박테리아의 운동성을 검사하는 데 사용되며, 이는 편모의 유무를 간접적으로 결정할 수 있으므로 박테리아 식별에 중요한 역할을 합니다.

박테리아의 운동성을 감지하는 직간접적인 방법이 있다⁶. 편모를 가진 박테리아는 운동성을 나타내기 때문에 편모의 유무를 감지하여 박테리아가 운동성인지 여부를 간접적으로 검출할 수 있습니다. 예를 들어, 전자 현미경 및 편모 염색에 의해 간접적으로 운동성을 감지하여 박테리아가 운동성이 있음을 나타낼 수 있습니다. 서스펜션 드롭 및 반고체 펑크 방법과 같은 직접적인 방법으로 감지하는 것도 가능합니다.

세균 운동성을 감지하기 위해 학부 미생물학 실험실에서 일반적으로 사용되는 반고체 천자 방법은 세균 성장 방향에 따라 0.4-0.8% 한천을 함유한 반고체 한천 배지에 박테리아를 천자 내로 접종합니다. 박테리아가 펑크 라인을 따라 자라서 주변으로 퍼지면 구름 모양 (브러시 같은) 성장 흔적이 나타나 편모의 존재와 운동성을 나타냅니다. 펑크 라인 성장 흔적이 없으면 박테리아는 편모도 운동성도 없습니다.

그러나이 방법은 박테리아가 무색이고 투명하며 편모 활성은 살아있는 박테리아 및 기타 요인의 생리적 특성과 한천의 농도 및 시험관의 작은 직경에 의해 영향을받는 단점이 있습니다. 또한, 호기성 박테리아는 한천 표면에서의 성장에만 적합하여 박테리아 운동성 관찰에 영향을 미칩니다. 따라서이 실험을 개선하기 위해 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) (무색)를 배지에 첨가하여 TTC ^7,8,9,10의 적색 생성물 형성을 촉매하기 위해 세포 내 탈수소 효소를 사용하는 현재의 직접 천자 방법보다 박테리아 운동성을 결정하는 더 신뢰할 수 있고 직관적 인 방법을 확립했습니다.

프로토콜

1. 반고체 배지의 제조

1. 전통적인 반고체 한천
   1. 기본 성분¹¹을 사용하여 박테리아 운동성 시험 배지 레시피에 따라 전통적인 반고체 한천을 준비한다. 충분한 증류수에 트립토오스 10g, NaCl 15g, 한천 4g을 녹이고 pH를 7.2 ± 0.2로 조정하고 최종 부피를 1,000mL로 구성합니다.
   2. 한천을 121°C에서 20분 동안 오토클레이브하고 3cm 높이의 반고체 배지로 10mL 시험관에 분주합니다.
2. TTC를 사용한 전통적인 반고체 한천
   1. 종래의 반고체 배지를 오토클레이빙한 후 50°C로 냉각하고 100mL의 배지에 멸균된 1% TTC 용액 5mL를 넣고 혼합한 후 10mL 시험관에 분주하여 3cm 높이의 반고체 배지를 형성합니다.

2. 박테리아 균주

참고: 대장균, 녹농균, 살모넬라종, 비브리오종, 폐렴간균 및 에어로모나스 하이드로필라를 포함한 80개의 균주를 수생 환경에서 분리하고 자동 박테리아 식별 기기(재료 표 참조)를 사용하여 식별했습니다(표 1). 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)(재료 표 참조)은 음성 비운동성 대조군으로 사용되었습니다. 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)(재료 표 참조)을 양성 대조군 균주로 사용했습니다.

1. 운동성 분석에 사용할 테스트 박테리아 균주를 식별합니다.
2. 음성 비운동성 대조군 및 운동성 양성 대조군 균주를 포함합니다.

3. TTC 강화 박테리아 운동성 관찰

1. 한천 플레이트에서 테스트 박테리아의 단일 콜로니를 선택하고 접종 바늘을 사용하여 구멍을 뚫어 위의 두 반고체 배지(단계 1.1.2 및 1.2.1)에 접종합니다.
2. 튜브를 37°C에서 24-48시간 동안 배양하여 결과를 관찰하였다.
3. 성장 상태 관찰: 펑크 라인만 빨간색인 경우 박테리아를 운동성이 없는(-) 특성화합니다. 붉은 색이 천공선¹²를 따라 바깥쪽으로 가볍게 퍼지면 박테리아를 운동성(+)으로 특성화합니다.

4. 다양한 한천 농도가 박테리아 운동성에 미치는 영향

1. 0.3%, 0.5%, 0.8% 한천을 함유하는 반고체 배지를 준비하고, 상기와 같이 천자에 의해 접종한다. 배양 24-48 시간 후에 결과를 관찰하십시오.

결과

운동성 검출을 위해 표준 균주와 분리된 균주 모두 비교하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 편모가 없기 때문에 황색포도상구균과 폐렴간균은 전통적인 배지와 TTC 반고체 배지 모두에서 접종된 라인을 따라서만 성장했습니다. 대조적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)은 TTC 반고체 배?...

토론

반고체 배지 방법에 의한 박테리아 운동성의 검출은 많은 요인에 의해 영향을 받는다^13,14. 산소(한천 표면의 호기성, 반고체 배지가 있는 튜브 바닥의 비호기성), pH 및 온도와 같은 박테리아 성장 조건은 박테리아 편모의 생존력에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 운동성 감소 또는 운동성 상실로 이어질 수 있다¹⁵. 또한, 일부 점액형 박테?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Difco
Escherichia coli	ATCC	ATCC25922	Positive control
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC27853	Positive control
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028	Positive control
Staphylococcus aureus	ATCC	ATCC25923	Negative nonmotile control
Tryptose	OXOID
TTC	Sigma	298-96-4
VITEK 2 automated microbial identification system	Bio Mérieux