המחשת תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי תנועתיות חיידקים בהתבסס על תגובת צבע. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי קל להעריך ומדויק יותר, ואינו דורש ציוד מיוחד.

Abstract

תנועתיות חיידקים חיונית לפתוגני חיידקים, ליצירת ביופילם ולעמידות לתרופות. תנועתיות חיידקים חיונית לפלישה ו/או הפצה של מינים פתוגניים רבים. לכן, חשוב לזהות תנועתיות חיידקית. תנאי גדילה חיידקיים, כגון חמצן, pH וטמפרטורה, יכולים להשפיע על גדילת חיידקים ועל ביטוי שוטונים חיידקיים. זה יכול להוביל לתנועתיות מופחתת או אפילו לאובדן תנועתיות, וכתוצאה מכך הערכה לא מדויקת של תנועתיות חיידקים. בהתבסס על תגובת הצבע של 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) על ידי dehydrogenases תוך תאי של חיידקים חיים, TTC נוסף לאגר מוצק למחצה מסורתי לזיהוי תנועתיות חיידקית. התוצאות הראו כי שיטת אגר מוצקה למחצה TTC לזיהוי תנועתיות חיידקים היא פשוטה, קלה לתפעול ואינה מערבת מכשירים גדולים ויקרים. התוצאות הראו גם כי התנועתיות הגבוהה ביותר נצפתה בתווך מוצק למחצה שהוכן עם 0.3% אגר. בהשוואה למדיום המסורתי המוצק למחצה, התוצאות קלות יותר להערכה ומדויקות יותר.

Introduction

תנועתיות חיידקים ממלאת תפקיד קריטי בפתוגניות חיידקים, בהיווצרות ביופילם ובעמידות לתרופות¹. תנועתיות חיידקים קשורה קשר הדוק עם פתוגניות והיא הכרחית להתיישבות חיידקים במהלך זיהום מוקדם של תאים מארחים². היווצרות ביופילם קשורה קשר הדוק לתנועתיות חיידקים, שבה חיידקים נצמדים לפני השטח של מדיה מוצקה באמצעות תנועתיות. תנועתיות חיידקים נחשבת מזה זמן רב לקורלציה חיובית עם היווצרות ביופילם. רמה גבוהה של עמידות חיידקית לתרופות עקב ביופילם עלולה להוביל לזיהומים מתמשכים המהווים איום על בריאות האדם ^3,4,5. לכן, חשוב לזהות תנועתיות חיידקית. בדיקת תנועתיות החיידקים משמשת בעיקר לבחינת תנועתיותן של צורות שונות של חיידקים במצב החי, אשר יכול לקבוע בעקיפין את נוכחותם או היעדרם של שוטונים, ולכן יש לו תפקיד חשוב בזיהוי חיידקים.

ישנן שיטות ישירות ועקיפות לזיהוי תנועתיות חיידקית⁶. מכיוון שחיידקים עם שוטונים מראים תנועתיות, ניתן לזהות אם חיידקים נעים בעקיפין על ידי זיהוי נוכחות או היעדר שוטונים. לדוגמה, ניתן לזהות תנועתיות בעקיפין על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים וצביעת שוטונים כדי להצביע על כך שהחיידקים הם תנועתיים. ניתן גם לזהות בשיטות ישירות, כגון נפילת השעיה ושיטות ניקוב מוצקות למחצה.

שיטת הניקור המוצק למחצה הנפוצה במעבדות מיקרוביולוגיה לתואר ראשון לאיתור תנועתיות חיידקית מחסנת את החיידקים לנקב בתווך האגר המוצק למחצה המכיל 0.4-0.8% אגר, בהתאם לכיוון צמיחת החיידקים. אם החיידקים גדלים לאורך קו הנקב כדי להתפשט, מופיעים עקבות צמיחה דמויי ענן (דמויי מברשת), המעידים על נוכחות שוטונים, ולכן תנועתיות. אם אין עקבות צמיחה של קו ניקוב, החיידק אינו שוטון ואינו תנועתי.

עם זאת, לשיטה זו חסרונות: החיידקים חסרי צבע ושקופים, פעילות השוטון מושפעת מהמאפיינים הפיזיולוגיים של החיידקים החיים וגורמים נוספים, ומריכוז האגר וקוטרה הקטן של המבחנה. יתר על כן, חיידקים אירוביים מתאימים רק לצמיחה על פני האגר, המשפיעים על התצפית על תנועתיות החיידקים. לפיכך, כדי לשפר את הניסוי הזה, 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) (חסר צבע) נוסף למדיום כדי לבסס שיטה אמינה ואינטואיטיבית יותר לקביעת תנועתיות חיידקים מאשר שיטת ניקוב ישיר הנוכחית באמצעות dehydrogenases תוך תאיים כדי לזרז את היווצרות של מוצר אדום של TTC 7,8,9,10.

Protocol

1. הכנת מדיום מוצק למחצה

1. אגר מסורתי חצי מוצק
   1. הכינו את האגר המסורתי המוצק למחצה על פי המתכון הבינוני לבדיקת תנועתיות חיידקים תוך שימוש במרכיבים הבסיסיים¹¹. להמיס 10 גרם טריפטוז, 15 גרם NaCl, 4 גרם אגר במים מזוקקים מספיק, להתאים את ה- pH ל 7.2 ± 0.2, ולהשלים את הנפח הסופי ל 1,000 מ"ל.
   2. הוציאו את האגר בטמפרטורה של 121°C למשך 20 דקות, וחלקו אותו למבחנות בנפח 10 מ"ל כמדיום מוצק למחצה בגובה 3 ס"מ.
2. אגר מסורתי חצי מוצק עם TTC
   1. לאחר autoclaving המדיום הקונבנציונאלי מוצק למחצה, לקרר אותו ל 50 ° C, להוסיף 5 מ"ל של פתרון סטרילי 1% TTC ל 100 מ"ל של בינוני, לערבב, ולחלק אותו לתוך 10 מ"ל מבחנות הבדיקה כדי ליצור מדיום מוצק למחצה בגובה 3 ס"מ.

2. זני חיידקים

הערה: שמונים זנים בודדו מהסביבה הימית וזוהו באמצעות מכשיר זיהוי חיידקים אוטומטי (ראה טבלת חומרים), כולל Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae ו - Aeromonas hydrophila (טבלה 1). סטפילוקוקוס זהוב (Staphylococcus aureus ) (ראו טבלת חומרים) שימש כבקרה שלילית שאינה תנועתית; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, ו - Salmonella typhimurium (ראה טבלת חומרים) שימשו כזני בקרה חיוביים.

1. זהה זני חיידקים לבדיקה שישמשו לניתוח תנועתיות.
2. כלול בקרות שליליות שאינן נעות וזני בקרה חיוביים תנועתיים.

3. תצפית תנועתיות חיידקית משופרת TTC

1. בחר מושבות בודדות של חיידקי בדיקה מצלחות אגר וחסן אותם לשני מדיה מוצקה למחצה לעיל (שלבים 1.1.2 ו 1.2.1) על ידי ניקוב באמצעות מחטים חיסון.
2. תרבית את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 24-48 שעות כדי לצפות בתוצאות.
3. שימו לב למצב הצמיחה: אפיין את החיידקים כחסרי תנועה (-) אם רק קו הנקב אדום. אפיין את החיידקים כתנועתיים (+) אם הצבע האדום מתפשט קלות החוצה לאורך קו הניקוב¹².

4. השפעת ריכוזי אגר שונים על תנועתיות החיידקים

1. הכינו מדיה מוצקה למחצה המכילה 0.3%, 0.5% ו-0.8% אגר וחסנו אותם על ידי ניקוב, כמתואר לעיל. שימו לב לתוצאות לאחר 24-48 שעות של דגירה.

תוצאות

הן זנים סטנדרטיים והן זנים מבודדים הושוו לצורך זיהוי תנועתיות, והתוצאות מוצגות בטבלה 1. בשל היעדר שוטונים, Staphylococcus aureus ו Klebsiella pneumoniae רק גדל לאורך הקו מחוסן על מדיה מסורתית TTC מוצק למחצה. לעומת זאת, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli ו-Salmonella typhimurium הראו צמיחה בכל הכיוונים...

Discussion

זיהוי תנועתיות החיידקים בשיטת המדיום המוצק למחצה מושפע מגורמים רבים^13,14. תנאי גידול חיידקים, כגון חמצן (אירובי על משטח אגר, לא אירובי בתחתית הצינור עם המדיום המוצק למחצה), pH וטמפרטורה, יכולים להשפיע על הכדאיות של שוטונים חיידקיים, מה שעלול להוביל לתנועתיות מו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Difco
Escherichia coli	ATCC	ATCC25922	Positive control
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC27853	Positive control
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028	Positive control
Staphylococcus aureus	ATCC	ATCC25923	Negative nonmotile control
Tryptose	OXOID
TTC	Sigma	298-96-4
VITEK 2 automated microbial identification system	Bio Mérieux