Visualizzazione della motilità batterica basata su una reazione cromatica

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la motilità batterica basata su una reazione di colore. I principali vantaggi di questo metodo sono che è facile da valutare e più accurato e non richiede attrezzature specializzate.

Abstract

La motilità batterica è cruciale per la patogenicità batterica, la formazione di biofilm e la resistenza ai farmaci. La motilità batterica è cruciale per l'invasione e/o la diffusione di molte specie patogene. Pertanto, è importante rilevare la motilità batterica. Le condizioni di crescita batterica, come ossigeno, pH e temperatura, possono influenzare la crescita batterica e l'espressione dei flagelli batterici. Ciò può portare a una ridotta motilità o addirittura alla perdita di motilità, con conseguente valutazione imprecisa della motilità batterica. Sulla base della reazione cromatica del cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) da parte delle deidrogenasi intracellulari di batteri viventi, il TTC è stato aggiunto all'agar semisolido tradizionale per il rilevamento della motilità batterica. I risultati hanno mostrato che questo metodo di agar semisolido TTC per la rilevazione della motilità batterica è semplice, facile da usare e non coinvolge strumenti grandi e costosi. I risultati hanno anche mostrato che la motilità più alta è stata osservata nel mezzo semisolido preparato con agar allo 0,3%. Rispetto al tradizionale mezzo semisolido, i risultati sono più facili da valutare e più accurati.

Introduzione

La motilità batterica svolge un ruolo critico nella patogenicità batterica, nella formazione di biofilm e nella resistenza ai farmaci¹. La motilità batterica è strettamente associata alla patogenicità ed è necessaria per la colonizzazione batterica durante l'infezione precoce delle cellule ospiti². La formazione di biofilm è strettamente correlata alla motilità batterica, in cui i batteri aderiscono alla superficie dei mezzi solidi attraverso la motilità. La motilità batterica è stata a lungo considerata positivamente correlata con la formazione di biofilm. Un alto grado di resistenza batterica ai farmaci dovuto al biofilm può portare a infezioni persistenti che rappresentano una minaccia per la salute umana ^3,4,5. Pertanto, è importante rilevare la motilità batterica. Il test di motilità batterica viene utilizzato principalmente per esaminare la motilità di diverse forme di batteri allo stato vivente, che possono determinare indirettamente la presenza o l'assenza di flagelli e, quindi, ha un ruolo importante nell'identificazione dei batteri.

Esistono metodi diretti e indiretti per rilevare la motilità batterica⁶. Poiché i batteri con flagelli mostrano motilità, è possibile rilevare se i batteri sono mobili indirettamente rilevando la presenza o l'assenza di flagelli. Ad esempio, è possibile rilevare la motilità indirettamente mediante microscopia elettronica e colorazione flagellare per indicare che i batteri sono mobili. È anche possibile rilevare con metodi diretti, come la caduta della sospensione e i metodi di puntura semisolida.

Il metodo di puntura semisolida comunemente usato nei laboratori universitari di microbiologia per rilevare la motilità batterica inocula i batteri nella puntura nel mezzo di agar semisolido contenente 0,4-0,8% di agar, secondo la direzione della crescita batterica. Se i batteri crescono lungo la linea di puntura per diffondersi, appaiono tracce di crescita simili a nuvole (simili a pennelli), che indicano la presenza di flagelli e, quindi, di motilità. Se non ci sono tracce di crescita della linea di puntura, il batterio non è né flagellato né mobile.

Tuttavia, questo metodo ha i suoi svantaggi: i batteri sono incolori e trasparenti, l'attività flagellare è influenzata dalle caratteristiche fisiologiche dei batteri viventi e da altri fattori, dalla concentrazione di agar e dal piccolo diametro della provetta. Inoltre, i batteri aerobici sono adatti solo per la crescita sulla superficie dell'agar, influenzando l'osservazione della motilità batterica. Quindi, per migliorare questo esperimento, il cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (incolore) è stato aggiunto al mezzo per stabilire un metodo più affidabile e intuitivo per determinare la motilità batterica rispetto all'attuale metodo di puntura diretta che utilizza deidrogenasi intracellulari per catalizzare la formazione di un prodotto rosso di TTC 7,8,9,10.

Protocollo

1. Preparazione del mezzo semisolido

1. Agar semisolido tradizionale
   1. Preparare l'agar semisolido tradizionale secondo la ricetta del mezzo di prova della motilità batterica utilizzando gli ingredienti di base¹¹. Sciogliere 10 g di triptosio, 15 g di NaCl, 4 g di agar in acqua distillata a sufficienza, regolare il pH a 7,2 ± 0,2 e portare il volume finale a 1.000 ml.
   2. Autoclavare l'agar a 121 °C per 20 minuti ed erogarlo in provette da 10 mL come mezzo semisolido alto 3 cm.
2. Agar semisolido tradizionale con TTC
   1. Dopo aver sterilizzato in autoclave il mezzo semisolido convenzionale, raffreddarlo a 50 °C, aggiungere 5 ml di soluzione sterile di TTC all'1% a 100 ml di terreno, mescolare ed erogarlo in provette da 10 ml per formare un mezzo semisolido alto 3 cm.

2. Ceppi batterici

NOTA: Ottanta ceppi sono stati isolati dall'ambiente acquatico e identificati utilizzando uno strumento automatizzato di identificazione dei batteri (vedere la tabella dei materiali), tra cui Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae e Aeromonas hydrophila (Tabella 1). Lo Staphylococcus aureus (vedi la tabella dei materiali) è stato usato come controllo non mobile negativo; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium (vedere la tabella dei materiali) sono stati utilizzati come ceppi di controllo positivo.

1. Identificare i ceppi batterici da utilizzare per l'analisi della motilità.
2. Includere controlli non mobili negativi e ceppi di controllo positivi mobili.

3. Osservazione della motilità batterica potenziata da TTC

1. Prelevare singole colonie di batteri in esame dalle piastre di agar e inocularle nei due mezzi semisolidi di cui sopra (fasi 1.1.2 e 1.2.1) mediante puntura con aghi inoculanti.
2. Coltivare i tubi a 37 °C nell'incubatore per 24-48 ore per osservare i risultati.
3. Osservare lo stato di crescita: caratterizzare i batteri come non mobili (-) se solo la linea di puntura è rossa. Caratterizzare i batteri come mobili (+) se il colore rosso si diffonde leggermente verso l'esterno lungo la linea di puntura¹².

4. Effetto di diverse concentrazioni di agar sulla motilità batterica

1. Preparare mezzi semisolidi contenenti 0,3%, 0,5% e 0,8% di agar e inocularli mediante foratura, come descritto sopra. Osservare i risultati dopo 24-48 ore di incubazione.

Risultati

Sia i ceppi standard che i ceppi isolati sono stati confrontati per il rilevamento della motilità e i risultati sono mostrati nella Tabella 1. A causa dell'assenza di flagelli, Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae sono cresciuti solo lungo la linea inoculata su terreni semisolidi tradizionali e TTC. Al contrario, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Salmonella typhimurium hanno mostrato una crescita in tutte le direzioni attorno alla linea inoc...

Discussione

La rilevazione della motilità batterica con il metodo del mezzo semisolido è influenzata da molti fattori^13,14. Le condizioni di crescita batterica, come l'ossigeno (aerobico sulla superficie dell'agar, non aerobico sul fondo del tubo con il mezzo semisolido), il pH e la temperatura, possono influenzare la vitalità dei flagelli batterici, che possono portare a una ridotta motilità o addirittura alla perdita di motilità¹⁵. Inoltre, alc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Difco
Escherichia coli	ATCC	ATCC25922	Positive control
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC27853	Positive control
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028	Positive control
Staphylococcus aureus	ATCC	ATCC25923	Negative nonmotile control
Tryptose	OXOID
TTC	Sigma	298-96-4
VITEK 2 automated microbial identification system	Bio Mérieux