Pase rápido, rentable y sin enzimas de células madre pluripotentes humanas a células alimentadoras mediante desadhesión mediada por ácido etilendiaminotetraacético

Resumen

Para evitar las limitaciones asociadas con el paso enzimático o mecánico de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) cultivadas en células alimentadoras, hemos establecido un método rápido, efectivo, rentable y de alto rendimiento para recolectar colonias de hESC o hiPSC mantenidas en una capa de células alimentadoras de fibroblastos del prepucio humano utilizando la desadhesión mediada por EDTA.

Resumen

Las células madre pluripotentes humanas (células madre embrionarias humanas, hESCs, y células madre pluripotentes humanas inducidas, hiPSCs) se cultivaron originalmente en diferentes tipos de células alimentadoras para su mantenimiento en un estado indiferenciado en cultivo a largo plazo. Este enfoque ha sido suplantado en gran medida por los protocolos de cultivo sin alimento, pero estos implican reactivos más costosos y pueden promover una transición a un estado cebado, lo que restringe la capacidad de diferenciación de las células. Tanto en condiciones de comedero como de libre alimento, la recolección de colonias hESC o hiPSC para el paso es un procedimiento necesario para expandir los cultivos.

Con el fin de proporcionar un procedimiento fácil y de alto rendimiento para el paso de hESCs/hiPSCs cultivadas en células alimentadoras, hemos establecido un método de recolección utilizando la desadhesión provocada por el quelante de calcio ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Hemos evaluado el rendimiento y la calidad de las células pasadas resultantes comparando este enfoque con el enfoque original de recolección mecánica, en el que las colonias se aíslan con un bisturí bajo un microscopio (se eligió la recolección mecánica como comparador para evitar la variabilidad de los reactivos asociada con la recolección enzimática).

En un conjunto de experimentos, se mantuvieron dos líneas diferentes de hESC en una capa de células alimentadoras de fibroblastos del prepucio humano. Cada línea se sometió a múltiples pasajes mediante recolección mecánica o basada en EDTA y se evaluó el tamaño y la morfología de la colonia, la densidad celular, la expresión de marcadores de tallo, la diferenciación a las tres capas germinales en los cuerpos embrioides y las aberraciones genómicas. En otro conjunto de experimentos, utilizamos la cosecha basada en EDTA en dos líneas diferentes de hiPSC y obtuvimos resultados similares. La desadhesión inducida por EDTA ahorró tiempo y dio un mayor rendimiento de colonias de un tamaño más favorable y una morfología más uniforme en comparación con la cosecha mecánica. También fue más rápido que la cosecha enzimática y no propenso a la variabilidad de los lotes enzimáticos. El método de desadhesión inducida por EDTA también facilita la transferencia de líneas hESC/hiPSC desde el cultivo basado en células alimentadoras a condiciones libres de alimentadores si se desea para su uso y análisis posteriores.

Introducción

El mantenimiento adecuado de las hESCs y hiPSCs in vitro es una metodología básica y conveniente para varias vías de investigación en biología celular y del desarrollo humano. Debido al impulso inherente de las hESC y hiPSC para diferenciarse, el mantenimiento del estado indiferenciado in vitro exige un cuidado y una atención especiales. Por lo tanto, el desarrollo de protocolos rentables para el mantenimiento y la aprobación de hESCs y hiPSCs con la menor variabilidad metodológica posible es de gran utilidad general.

Originalmente, las hESCs y hiPSCs se cultivaban en diferentes tipos de células alimentadoras para ayudar en el cultivo a largo plazo y el mantenimiento del estado indiferenciado ^1,2,3. Más recientemente, el cultivo en condiciones libres de alimentador se ha convertido en la norma, ya que evita por completo el tratamiento con las células alimentadoras⁴. Sin embargo, algunos laboratorios e instalaciones centrales todavía cultivan hESCs o hiPSCs en células alimentadoras. El cultivo sin alimentador es más costoso porque requiere el uso de medios de cultivo de composiciones especiales y algún tipo de recubrimiento de la superficie del cultivo para garantizar la adherencia de la colonia (componentes principales de la matriz extracelular [MEC] o un compuesto comercial de MEC, o el uso de placas recubiertas disponibles comercialmente). El gasto no es trivial y representa un obstáculo financiero potencial para algunos laboratorios interesados en llevar a cabo la investigación y el desarrollo basados en hESC o hiPSC. Además, el cultivo en condiciones libres de alimentación tiende a llevar a las hESC y hiPSC a un estado menos ingenuo que el que se mantiene en las células alimentadoras⁵, y esto puede comprometer la diferenciación posterior y dar lugar a variaciones genéticas⁶.

Históricamente, el paso de hESCs y hiPSCs cultivadas en células alimentadoras implicaba la recolección mecánica, utilizando un bisturí para extirpar colonias bajo un microscopio⁷, pero esto fue reemplazado en gran medida por la digestión enzimática con o sin raspado suave para aislar colonias o células disociadas. La recolección mecánica es tediosa y requiere microcirugía de precisión. La recolección enzimática puede variar en eficiencia debido a las diferencias enzimáticas de un lote a otro y tiende a favorecer la disociación completa, lo que promueve la muerte celular a menos que sea contrarrestado por inhibidores de ROCK ^8,9 y aumenta la incidencia de cariotipos anormales⁹.

Para aprovechar el menor gasto y el mayor potencial de diferenciación del cultivo de hESCs y hiPSCs en células alimentadoras, evitando al mismo tiempo las desventajas de la recolección mecánica y enzimática, hemos establecido un método rápido, eficaz, rentable y de alto rendimiento para cosechar colonias de hESC y hiPSC mantenidas en una capa alimentadora de fibroblastos del prepucio humano utilizando la desadhesión mediada por EDTA. Hemos comparado el rendimiento, la variabilidad y la calidad de las células madre con la obtenida con la recolección mecánica (no se comparó con la digestión enzimática debido a la variabilidad adicional que conlleva este enfoque). Observamos que la desadhesión mediada por EDTA también funciona bien para transferir colonias de cultivos basados en alimentadores a condiciones libres de alimentadores, si se desea para su uso y análisis posteriores. Este método proporciona una transición con un método de paso consistente, ya que la desadhesión inducida por EDTA es un enfoque popular empleado para cultivos libres de alimento.

Protocolo

Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Cultivo de células de fibroblastos humanos y preparación de la capa de células alimentadoras

1. Siembra 0,5 × 10⁶ fibroblastos del prepucio humano (en lo sucesivo denominados "células alimentadoras") por cada matraz de cultivo T-75 (número de matraces según sea necesario) con 20 ml de medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) con (p/) 10% de suero fetal bovino (FBS), en lo sucesivo denominado "medio de células alimentadoras".
2. Cuando las células alimentadoras alcancen el 90% de confluencia, retire el medio y lave 3 veces con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco por matraz para evitar la inhibición de la tripsina por factores en el medio. Añadir 2 ml de tripsina-EDTA a cada matraz y colocar el matraz en una incubadora de CO₂ a 37 °C/5 % durante 5 min o hasta que las células alimentadoras se hayan desprendido del matraz o matrazs. Observe el desprendimiento de las células bajo un microscopio como agregados flotantes de células o células individuales.
3. Agregue 5 ml de medio fresco precalentado para la celda de alimentación a cada matraz para inactivar la tripsina-EDTA y suspenda suavemente las celdas de alimentación mediante pipeteo.
4. Transfiera las celdas alimentadoras a un tubo de centrífuga de 15 ml. Tapar el tubo y granular las celdas alimentadoras por centrifugación a 200 × g durante 5 min.
5. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo de la celda de alimentación. Luego, vuelva a suspender con cuidado el gránulo en 4 ml de medio celular alimentador fresco. Asegúrese de que las células alimentadoras se resuspendan completamente antes de contar utilizando una cámara de recuento de células u otro aparato de recuento de células.
6. Agregue 0,5 × 10⁶ celdas alimentadoras al número requerido de matraces de cultivo T-75 nuevos para expansión, y agregue 20 ml de medio de celda alimentadora fresca a cada matraz. Incubar el matraz o matraces de cultivo en una incubadora a 37 °C/5% de CO₂ hasta que las células alimentadoras hayan alcanzado el 90% de confluencia.
   NOTA: Las celdas de alimentación se pueden usar hasta al menos el pasaje 25.
7. Calcule el número de células alimentadoras necesarias para el número de placas de cultivo de tejidos de 35 mm que se utilizarán para el cultivo de las hESCs/hiPSCs.
   NOTA: Por lo general, 3,0 × 10⁵ células alimentadoras por placa de cultivo de tejidos son suficientes para generar una capa confluente de células alimentadoras.
8. Para evitar la proliferación de las células alimentadoras, asegúrese de que se detengan mitóticamente de cualquiera de estas dos maneras.
   NOTA: Para ambos métodos, se puede generar un gran lote de células alimentadoras detenidas mitóticamente y congelarlas en alícuotas para su uso posterior.
   1. Realizar la detención mitótica mediante irradiación gamma transfiriendo todas las células alimentadoras necesarias a un tubo centrífugo de 50 ml y rellenando con medio celular alimentador hasta un volumen total de 5 ml. Transportar inmediatamente a temperatura ambiente a una máquina de irradiación gamma e irradiar para detener mitóticamente las células alimentadoras (300 kV y 10 mA durante 20 min).
      NOTA: Un retraso en el transporte puede provocar una fijación no deseada de las celdas de alimentación a la pared del tubo de centrífuga de 50 ml. Si el transporte requiere más de unos pocos minutos, asegúrese de que las celdas de alimentación permanezcan suspendidas durante el transporte agitando continuamente el tubo.
   2. Realice la detención mitótica con mitomicina C transfiriendo todas las células alimentadoras necesarias en 5 ml de medio de células alimentadoras a un tubo de centrífuga de 50 ml, y luego agregue 15 ml de medio celular alimentador que contenga 20 μg/ml de mitomicina C, e incube en una incubadora a 37 °C/5% de CO2 durante 3 h. Añadir 20 mL de PBS a 37 °C, granular las células por centrifugación a 200 × g durante 5 min, repetir el lavado con PBS dos veces más y volver a suspender en medio celular alimentador.
9. Después de que las células alimentadoras se hayan detenido mitóticamente, regrese a la campana de cultivo de tejidos y coloque las células alimentadoras a 3,0 × 10⁵ células por placa de cultivo de tejidos de 35 mm, como se indica a continuación. Asegúrese de que las células alimentadoras estén completamente resuspendidas, agregue medio para la célula alimentadora para alcanzar una concentración de células alimentadoras de 1,5 × 10⁵ por ml y agregue 2 ml de esta suspensión de células alimentadoras a cada placa de cultivo de tejidos de 35 mm.
10. Transfiera las placas de cultivo a una incubadora de 37 °C/5% de CO₂ . Para garantizar una distribución uniforme de las células alimentadoras, mueva las placas de cultivo lenta pero firmemente en el estante de la incubadora hacia adelante y hacia atrás 3 veces, seguido de una pausa, y luego realice la misma acción de izquierda a derecha 3 veces. No vuelva a mover los platos y cierre suavemente la puerta de la incubadora.
11. Después de 24 h, cambie del medio de la célula de alimentación a IMDM con un 10% de reemplazo de suero (SR). A partir de entonces, reemplace este medio cada tres días. Las celdas alimentadoras están listas para su uso después de los primeros 3 días.

2. Recolección mecánica de las colonias hESC o hiPSC

1. Medio precalentado hESC compuesto por un 80 % de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), un 20 % de SR, 1 mM de sustituto de glutamina 100x, 1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1 mM de penicilina/estreptomicina (P/S), 0,1 mM de 2-mercaptoetanol y 10 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF). El medio hESC se utiliza para el cultivo de hESCs o hiPSCs en las células alimentadoras.
2. Tome placas frescas de cultivo de tejidos de 35 mm que contengan células alimentadoras detenidas mitóticamente y reemplace el medio de la célula alimentadora con 1,2 ml de medio hESC que contenga bFGF al menos 30 minutos antes de la transferencia de las colonias hESC/hiPSC.
3. Coloque una placa de cultivo que contenga colonias de hESC/hiPSC en células alimentadoras detenidas mitóticamente bajo un microscopio con un aumento de 10x colocado dentro de una campana de flujo laminar. Use un bisturí estéril para cortar con cuidado alrededor de la circunferencia de cada colonia y luego corte cada colonia en 5-6 trozos aproximadamente iguales. Levante con cuidado las piezas de la colonia con la punta de la hoja del bisturí para que se desprendan de la capa de células alimentadoras y floten libremente en el medio.
   1. Trate de evitar las regiones de las colonias que contienen células diferenciadoras, que aparecen como islas de células más pequeñas con núcleos menos distintos en comparación con las hESCs/hiPSCs dentro de una colonia.
4. Transfiera las colonias que flotan libremente con una pipeta de 1 ml a las nuevas placas de cultivo que contienen las células alimentadoras. Trate de mantener las colonias separadas para que no crezcan entre sí más tarde. Mueva las placas de cultivo con cuidado a una incubadora de células y evite perturbar las placas hasta el día siguiente.
5. Al día siguiente, agregue cuidadosamente 600 μL de medio hESC que contenga bFGF hasta un volumen final de 1,8 mL. Reemplace el medio hESC + bFGF todos los días a partir de entonces hasta el siguiente paso (generalmente después de 1 semana).

3. Recolección de las colonias hESC o hiPSC mediante desadhesión mediada por EDTA

1. Tome placas de cultivo frescas con células alimentadoras detenidas mitóticamente y cambie de IMDM con 10% de SR a 1,2 mL de medio hESC + bFGF precalentado al menos 30 minutos antes de la transferencia de las colonias.
2. Manipule una placa de cultivo que contenga colonias de hESC o hiPSC a la vez. Retire el medio hESC + bFGF y lave las colonias con 1 ml de DPBS a temperatura ambiente para eliminar cualquier posible célula suelta y restos celulares. Añadir 1 mL de EDTA 0,5 mM e incubar durante 1 min a 37 °C. Si la campana de flujo laminar tiene una placa de calentamiento, realice este paso y los pasos de la sección 4 en la placa de calentamiento para una mejor desadhesión.
3. Después de 1 minuto de incubación, retire la solución de EDTA y agregue con cuidado 1 ml de medio hESC + bFGF con una pipeta de 1 ml. Triturar suavemente con la misma pipeta para liberar las colonias de la capa de células alimentadoras. Continúe triturando con cuidado hasta que la capa de la célula alimentadora se afloje y se pliegue sobre sí misma en un grupo separado. Retire la capa de la célula alimentadora con la punta de la pipeta.
4. Transfiera las colonias suspendidas de hESC/hiPSC con una nueva pipeta de 1 ml a nuevas placas de cultivo que contengan las células de alimentación y el medio hESC + bFGF, dividiendo en una proporción de 1:5. Las colonias tienden a distribuirse uniformemente dentro de cada nuevo plato de cultivo, pero facilitan esto moviendo el plato suavemente de un lado a otro. Reemplace el medio hESC + bFGF todos los días a partir de entonces hasta el siguiente paso (generalmente después de 1 semana).

Resultados

En los ensayos y comparaciones que se documentan a continuación, utilizamos dos líneas hESC (H9 y HS429, de WiCell y el Instituto Karolinska, respectivamente) y dos líneas hiPSC (NCS001 y NCS002, ambas generadas por el Centro Noruego de Células Madre Pluripotentes Humanas). Los datos presentados en las figuras y tablas son de las líneas hESC, pero se obtuvieron resultados completamente similares de las líneas hiPSC.

En nuestras manos, la cosecha mecánica dio como resultado que las colonias se dividieran en aproximadamente cinco o seis grupos de ~200-250 μm de diámetro, mientras que con la desadhesión inducida por EDTA seguida de trituración, cada colonia se dividió en ~10-20 grupos de ~60 μm de diámetro. Estimamos que el número de células en cada grupo cosechado con EDTA es de ~20. Como no es práctico dividir una colonia en grupos de este tamaño con un bisturí, en este sentido, la desadhesión inducida por EDTA es superior, ya que genera grupos de un tamaño más favorable para la supervivencia de las células de la colonia^10,11.

Las colonias de hESC/hiPSC cosechadas con EDTA también fueron más homogéneas en tamaño y forma en comparación con las colonias cosechadas mecánicamente (Figura 1A-F). Esto se debe a que el corte requerido para la cosecha mecánica genera bordes desiguales y tamaños de grupo variables. Para evaluar cuantitativamente, evaluamos la circularidad de la colonia (como medida de cuán redondeados eran los bordes de la colonia; un valor de 1 indica un círculo perfecto) 5 días después del paso utilizando el protocolo ImageJ-win64¹². La circularidad de las colonias fue significativamente menor en las colonias cosechadas mecánicamente (cosecha mecánica: 0.61 ± 0.10; Aprovechamiento a base de EDTA: 0,84 ± 0,01; n = 10, p < 0,001, prueba U de Mann-Whitney, U = 10).

La densidad celular en las colonias cosechadas y replateadas, que es una medida de las interacciones célula-célula posteriores a la cosecha durante la formación de la colonia, fue similar a la recolección basada en EDTA y la recolección mecánica (Tabla 1 y Figura 1G, H). Las colonias cosechadas mecánicamente tuvieron una mayor tendencia a desarrollar necrosis en sus regiones centrales (Figura 1J). Esto probablemente se debió a la variabilidad en la forma y, en particular, al tamaño de los grupos celulares aislados mecánicamente, ya que cuando estos grupos son demasiado grandes, pueden plegarse fácilmente sobre sí mismos cuando se transfieren a nuevas placas de cultivo. Este no fue el caso de las colonias cosechadas con EDTA, que exhibieron uniformemente una apariencia translúcida con bordes distintivos (Figura 1I).

Utilizando la cosecha basada en EDTA, pudimos recolectar esencialmente todas las colonias que se habían establecido en un pozo en 2-3 minutos. Usando la cosecha mecánica, recolectar todas las colonias en un pozo sería tedioso y llevaría mucho tiempo. Por lo general, logramos recolectar solo ~ 30%, o ~ 20-25 colonias, utilizando la cosecha mecánica, y esto tomó ~ 20 minutos. Del mismo modo, utilizando la digestión de la colagenasa seguida de un raspado suave, por lo general era difícil cosechar todas las colonias, aunque el procedimiento total solo tomó unos minutos. Por lo tanto, la cosecha basada en EDTA es tan rápida o más rápida que la recolección enzimática y más eficiente que la recolección mecánica o enzimática.

Para evaluar el efecto de los diferentes métodos de recolección sobre el tallo y la pluripotencia, primero sometimos las colonias obtenidas después de 20 pasadas mediante recolección mecánica o basada en EDTA a análisis de qPCR (Figura 2) y tinción inmunocitoquímica (Figura 3 y Figura 4) para marcadores de tallo. Las colonias obtenidas utilizando cualquiera de los dos métodos exhibieron una expresión estable de marcadores de tallo tanto a nivel de ARNm como de proteína. A continuación, evaluamos la pluripotencia por diferenciación a las tres capas germinales en los cuerpos embrioides (Figura 5 y Figura 6). Los cuerpos embrioides generados a partir de las hESCs o hiPSCs obtenidas después de 20 pasadas utilizando cualquiera de los métodos contenían una mezcla de células que expresaban marcadores comúnmente evaluados para ectodermo, mesodermo y endodermo.

Por último, se evaluó la incidencia de aberraciones genómicas en las hESCs y hiPSCs aprobadas por cada método mediante análisis genético basado en qPCR (ver Tabla de Materiales). Las colonias obtenidas después de 20 pasadas utilizando cualquiera de los métodos de recolección mostraron algunos ejemplos de desviación modesta de un patrón cromosómico diploide de referencia (las anomalías evaluadas fueron las comúnmente asociadas con la reprogramación de las hiPSC, pero también se pueden obtener en las hESCs) (Figura 7). Sin embargo, el patrón de estas desviaciones fue esencialmente el mismo en las colonias obtenidas después de cualquiera de los métodos de cosecha, lo que indica que no estaban vinculadas al método de cosecha.

Figura 1: Morfología de la colonia y densidad celular después de la recolección mecánica o basada en EDTA. (A-F) Imágenes representativas de campo claro de colonias H9 hESC establecidas en cultivo libre de alimentador durante 5 días después de 20 pasadas utilizando recolección mecánica a base de EDTA (A-C) o (D-F). (G,H) Imágenes de fluorescencia representativas de la densidad celular en colonias H9 hESC establecidas después de 20 pasadas utilizando (G) recolección mecánica basada en EDTA o (H). Los núcleos celulares se tiñen con DAPI. (I,J) Imágenes representativas de campo claro de colonias H9 hESC establecidas después de 20 pasadas utilizando (I) recolección mecánica basada en EDTA o (J). Obsérvese la región central necrótica de la colonia cosechada mecánicamente (flecha en J). Todas las imágenes fueron adquiridas 5 días después del 20º paso. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: hESC = célula madre embrionaria humana; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Expresión del ARNm marcador de tallo en dos líneas hESC (H9 y HS429) generadas después de la recolección mecánica o basada en EDTA. Reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real de los marcadores indicados en las hESC H9 (panel superior) y HS429 (panel inferior) después de una sola pasada mediante recolección mecánica, después de 20 pasadas utilizando recolección mecánica y después de 20 pasadas utilizando recolección basada en EDTA (dilución 1:5). El nivel de expresión es relativo al del gen de mantenimiento ACTB (beta-actina). Las barras de error indican la desviación estándar. Abreviaturas: hESC = célula madre embrionaria humana; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Expresión de proteínas marcadoras de tallo en la línea H9 hESC después de diferentes condiciones de cosecha. Tinción representativa de inmunofluorescencia de colonias H9 hESC recolectadas mecánicamente (A-E) antes de un nuevo pase, (F-J) después de 20 pasadas usando recolección mecánica, y (K-O) después de 20 pasadas usando recolección basada en EDTA. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: hESC = célula madre embrionaria humana; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Expresión de proteínas marcadoras de tallo en la línea HS429 hESC después de diferentes condiciones de cosecha. Tinción de inmunofluorescencia representativa de colonias HS429 hESC recolectadas mecánicamente (A-E) antes de un nuevo pase, (F-J) después de 20 pasadas usando recolección mecánica y (K-O) después de 20 pasadas usando recolección basada en EDTA. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: hESC = célula madre embrionaria humana; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Expresión de marcadores para las tres capas germinales en cuerpos embrioides generados a partir de la línea H9 hESC después de la recolección mecánica o basada en EDTA. Tinción representativa por inmunofluorescencia de marcadores para (filas A y D), ectodermo (ECTO, TUJI), endodermo (filas B y E) (ENDO, AFP) y mesodermo (filas C y F) (MESO, SMA). EBs generados (A-C) después de 20 pasadas de cosecha mecánica o (D-F) después de 20 pasadas de cosecha a base de EDTA. Barras de escala = 40 μm. Abreviaturas: hESC = célula madre embrionaria humana; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; EBs = cuerpos embrioides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Expresión de marcadores para las tres capas germinales en cuerpos embrioides generados a partir de la línea HS429 hESC después de la recolección mecánica o basada en EDTA. Tinción representativa por inmunofluorescencia de marcadores para (filas A y D), ectodermo (ECTO, TUJI), endodermo (filas B y E) (ENDO, AFP) y mesodermo (filas C y F) (MESO, SMA). EBs generados (A-C) después de 20 pasadas de cosecha mecánica (A-C) o (D-F) después de 20 pasadas de cosecha a base de EDTA. Barras de escala = 40 μm. Abreviaturas: hESC = célula madre embrionaria humana; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; EBs = cuerpos embrioides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Análisis genético basado en qPCR de aberraciones genómicas comunes en las líneas HS9 y HS429 ESC y en la línea NCS002 iPSC después de 20 pasadas mediante recolección mecánica o basada en EDTA. La línea de base en el valor 2 representa la diploidía normal en todos los marcadores cromosómicos. Un valor de 1 o 3 representaría una pérdida o ganancia, respectivamente, del marcador cromosómico indicado en todas las células. Los valores intermedios entre 1 y 2 o entre 2 y 3 indican la presencia de una pérdida o ganancia del marcador indicado en una fracción de las células. Tenga en cuenta que el patrón de aberraciones es similar en las dos condiciones de cosecha. Abreviaturas: ESC = célula madre embrionaria; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; iPSC = célula madre pluripotente inducida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Densidad celular (células/mm2)
H9	significar	stdev
Vendimia mecánica antes de su posterior paso	3918	263.3
Vendimia mecánica 20 veces	3868	197.7
Cosecha de EDTA 20 veces	4080	127.8
HS429	significar	stdev
Vendimia mecánica antes de su posterior paso	5249	565.4
Vendimia mecánica 20 veces	5247	726.3
Cosecha de EDTA 20 veces	4963	448.8

Tabla 1: Comparación de las densidades celulares en las colonias de las dos líneas hESC (H9 y HS429) generadas después de la recolección mecánica o basada en EDTA. Las densidades celulares se evaluaron después de un solo paso mediante recolección mecánica, después de 20 pases utilizando recolección mecánica o después de 20 pases utilizando recolección basada en EDTA (con dilución 1:5). En todos los casos, n = 5 colonias.

Discusión

Hemos descrito un método rápido y rentable para la recolección de hESCs y hiPSCs cultivadas en células alimentadoras utilizando la desadhesión mediada por EDTA y lo hemos comparado principalmente con el método convencional de recolección mecánica con bisturí. También comparamos la cosecha basada en EDTA con la recolección enzimática con respecto a la velocidad del método, pero no a los aspectos de la calidad de la colonia resultante. La razón de esto es que la recolección enzimática es inherentemente más variable y se ha relacionado con una mayor prevalencia de aberraciones genómicas⁵, lo que podría oscurecer las diferencias entre métodos.

Demostramos que la cosecha basada en EDTA es más rápida y eficiente que cualquiera de los otros métodos y genera colonias más pequeñas y morfológicamente más homogéneas que la cosecha mecánica. Esta última característica es beneficiosa con respecto a la supervivencia celular, ya que los grupos más grandes obtenidos con la recolección mecánica son propensos a la necrosis central, mientras que la digestión enzimática tiende a generar hESCs y hiPSCs aisladas, que son más propensas a la apoptosis y requieren un tratamiento adicional, por ejemplo con inhibidores de ROCK, para sobrevivir. La recolección a base de EDTA se puede utilizar para al menos 20 pasos. Los métodos de recolección mecánica y basados en EDTA son comparables en lo que respecta a la densidad celular de la colonia, la expresión de ARNm y proteínas de los genes madre, la diferenciación de las tres capas germinales en los cuerpos embrioides y las anomalías genómicas. Si el objetivo es la eficiencia, un mayor rendimiento, una menor variabilidad y un manejo más cuidadoso de las hESC y hiPSC, es preferible la cosecha basada en EDTA.

También observamos que la recolección basada en EDTA de hESCs y hiPSCs cultivadas en células alimentadoras es una forma económica de mantener un estado más ingenuo y proporciona una transición suave de cultivo basado en alimentadores a cultivo sin alimentadores cuando esto es deseable.

Pasos críticos dentro del protocolo
Los pasos más críticos de la desadhesión mediada por EDTA son la sección 3 del protocolo (incubación en la solución de EDTA) y la sección 4 (trituración). Si la exposición a la solución de EDTA es superior a 1 min, aumenta el riesgo de disociación completa a células individuales. Esto también puede ocurrir si la trituración es demasiado prolongada o demasiado dura. Este último se ve afectado por el tamaño de la punta de la pipeta. Lo ideal es utilizar pipetas de cultivo celular de 1 ml como se describe aquí. El uso de un tipo diferente de pipeta con un diámetro de punta más pequeño es arriesgado.

Solución de problemas
Si las células alimentadoras continúan proliferando, la detención mitótica no ha sido efectiva, y se debe tomar un nuevo lote y reiniciar el procedimiento. Si las colonias no se desprenden de la capa de células alimentadoras, se debe asegurarse de que no haya Ca²⁺ en el EDTA y que la placa de cultivo que contiene las colonias se enjuague bien con PBS para eliminar cualquier medio de cultivo celular restante antes de agregar el EDTA. Demasiada disociación, que genera células aisladas o grupos celulares demasiado pequeños, puede surgir debido a una trituración excesiva y compromete el establecimiento de nuevas colonias. El grado de trituración debe determinarse empíricamente en las pruebas del protocolo para confirmar que los grupos celulares resultantes tienen ~60 μm de diámetro. Si la capa de alimentación se separa espontáneamente de la placa de cultivo, especialmente antes de que las hESCs/hiPSCs estén listas para la cosecha, podría deberse a que las células de alimentación no se han utilizado dentro de ~7 días después de haber sido preparadas. Por lo tanto, el marco de tiempo de uso de las celdas de alimentación debe controlarse cuidadosamente. Si la capa alimentadora se disocia durante la exposición al EDTA (algo que nunca hemos observado con las células alimentadoras utilizadas aquí), se debe cambiar el tipo de célula alimentadora o su método de cultivo.

Limitaciones de la técnica
La principal limitación de la técnica es que requiere una inspección visual del proceso de desadhesión para lograr un resultado exitoso. Esto significa que los usuarios deben aprender a identificar cuándo las colonias se liberan de la capa de células alimentadoras y la capa de células alimentadoras se afloja del sustrato. Sin embargo, esto no es difícil y, según nuestra experiencia, los nuevos usuarios de la técnica pueden dominarla en un par de pruebas.

También existe la posibilidad inherente de que las hESC o hiPSC cosechadas puedan estar contaminadas por unas pocas células alimentadoras. Si la intención es transferirse a condiciones no alimenticias o aislar las hESC o hiPSC para los ensayos, dicha contaminación comprometería la pureza. Observamos que con las células alimentadoras utilizadas aquí (fibroblastos del prepucio humano), es extremadamente difícil disociar la capa de células alimentadoras, incluso con la digestión enzimática (no mostrada). Dado que la capa de células alimentadoras no disociadas se elimina in toto, es probable que la contaminación de las hESC o hiPSC recolectadas sea insignificante. Como las células alimentadoras son, además, detenidas mitóticamente, cualquier contaminación eventualmente disminuiría a cero con un mayor paso de las hESC o hiPSC.

Importancia con respecto a los métodos existentes
La norma actual para el cultivo de hESCs y hiPSCs es hacerlo en condiciones libres de alimento, para lo cual el uso de EDTA para el paso está muy extendido. El cultivo sin alimentador depende del uso de medios y sustratos de cultivo especialmente formulados que garanticen la adherencia. Estos reactivos conllevan un gasto adicional que puede superar algunos presupuestos de laboratorio. Además, el cultivo en condiciones libres de alimentadores se ha asociado con un potencial de diferenciación perturbado debido a la falta de factores específicos en los medios de cultivo libres de alimentadores y una transición resultante del estado ingenuo al estado cebado. El crecimiento de células alimentadoras detenidas mitóticamente evita esta transición y puede reducir los costos generales a un nivel manejable, lo que facilita el uso más amplio de células madre pluripotentes en la investigación de laboratorio.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575020
15 mL centrifuge tubes	Sarstedt	62.554.502
2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010
50 mL centrifuge tubes	Sarstedt	62.547.254
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	PeproTech	AF-100-18B-250UG
Brand Bürker Chamber	Fisher Scientific	10628431
Disposable scalpels no.15	Susann-Morton	505
DPBS (1x) without Ca/Mg	Gibco	14190-094
Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm	Falcon	353001
Eppendorf pipette 1 mL	Eppendorf
Eppendorf pipette 200 μL	Eppendorf
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	10270-106
Filter tip 1,000 μL	Sarstedt	70.1186.210
Filter tip 200 μL	Sarstedt	70.760.211
Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation)	Best Theratronics	BT/MTS 8007 GC3000E
Glutamax 100x	Gibco	35050-038
Growth Factor Reduced Matrixgel	Corning	734-0269
H9 hESC line	WiCell	WAe009-A
hPSC Genetic Analysis Kit	Stem Cell Technologies	#07550
HS429 hESC line	ECACC	KIe024-A
Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line	ATTC	CRL2429
IMDM (1x)	Gibco	21980-032
iPSC lines	Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells	NCS001 & NCS002
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss)	Zeiss
Microscope	CETI
Mitomycin C	Sigma Aldrich	M4287
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140.035
Pipettes, plastic 10 mL	Sarstedt	86.1254.001
Pipettes, plastic, 5 mL	Sarstedt	86.1253.001
Serum Replacement (SR)	Gibco	10828-028
Sterile filters 0.22 um	Sarstedt	83.1826.102
T-75 culture flask	ThermoScientific	156499
Trypan Blue Stain (0.4 %)	Gibco	15250-061
Trypsin-EDTA, 500 mL	Gibco	25300062