Passaggio rapido, economico e privo di enzimi di cellule staminali pluripotenti umane su cellule nutritrici mediante disadesione mediata dall'acido etilendiamminotetraacetico

Riepilogo

Per evitare le limitazioni associate al passaggio enzimatico o meccanico di cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) coltivate su cellule feeder, abbiamo stabilito un metodo rapido, efficace, economico e ad alto rendimento per la raccolta di colonie hESC o hiPSC mantenute su uno strato di cellule feeder di fibroblasti prepuzi umani utilizzando la disadesione mediata da EDTA.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti umane (cellule staminali embrionali umane, hESC e cellule staminali pluripotenti indotte umane, hiPSC) sono state originariamente coltivate su diversi tipi di cellule feeder per il mantenimento in uno stato indifferenziato in coltura a lungo termine. Questo approccio è stato soppiantato in larga misura dai protocolli di coltura feeder-free, ma questi comportano reagenti più costosi e possono promuovere una transizione verso uno stato primed, che limita la capacità di differenziazione delle cellule. Sia in condizioni di alimentazione che di alimentazione libera, la raccolta di colonie hESC o hiPSC per il passaggio è una procedura necessaria per espandere le colture.

Per fornire una procedura semplice e ad alto rendimento per il passaggio di hESCs/hiPSCs coltivate su cellule feeder, abbiamo stabilito un metodo di raccolta che utilizza la disadesione suscitata dal chelante del calcio acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Abbiamo valutato la resa e la qualità delle cellule passate risultanti confrontando questo approccio con l'approccio originale di raccolta meccanica, in cui le colonie vengono isolate con un bisturi al microscopio (la raccolta meccanica è stata scelta come comparatore per evitare la variabilità dei reagenti associata alla raccolta enzimatica).

In una serie di esperimenti, due diverse linee di hESC sono state mantenute su uno strato di cellule feeder di fibroblasti prepuzi umani. Ogni linea è stata sottoposta a passaggi multipli utilizzando la raccolta meccanica o basata su EDTA e valutata per le dimensioni e la morfologia della colonia, la densità cellulare, l'espressione dei marcatori di staminalità, la differenziazione nei tre strati germinali nei corpi embrioidi e le aberrazioni genomiche. In un'altra serie di esperimenti, abbiamo utilizzato il picking a base di EDTA su due diverse linee di hiPSC e abbiamo ottenuto risultati simili. La disadesione indotta dall'EDTA ha fatto risparmiare tempo e ha dato una maggiore resa di colonie di dimensioni più favorevoli e morfologia più uniforme rispetto alla raccolta meccanica. Era anche più veloce della raccolta enzimatica e non era soggetto a variabilità del lotto enzimatico. Il metodo di disadesione indotto da EDTA facilita anche il trasferimento di linee hESC/hiPSC da colture basate su cellule feeder a condizioni prive di feeder, se lo si desidera, per l'uso e l'analisi a valle.

Introduzione

Il corretto mantenimento delle hESC e delle hiPSC in vitro è una metodologia di base e conveniente per diverse strade di ricerca nella biologia cellulare umana e dello sviluppo. A causa della spinta intrinseca delle hESC e delle hiPSC a differenziarsi, il mantenimento dello stato indifferenziato in vitro richiede particolare cura e attenzione. Pertanto, lo sviluppo di protocolli efficienti in termini di costi per il mantenimento e il passaggio di hESC e hiPSC con la minor variabilità metodologica possibile è di grande utilità generale.

Originariamente, le hESC e le hiPSC sono state coltivate su diversi tipi di cellule feeder per aiutare nella coltura a lungo termine e nel mantenimento dello stato indifferenziato ^1,2,3. Più recentemente, la coltura in condizioni di alimentazione libera è diventata la norma, in quanto evita del tutto di trattare con le cellule nutritrici⁴. Tuttavia, alcuni laboratori e strutture di base coltivano ancora hESC o hiPSC su cellule feeder. La coltura senza alimentatore è più costosa perché richiede l'uso di terreni di coltura di composizioni speciali e una qualche forma di rivestimento della superficie di coltura per garantire l'aderenza della colonia (principali componenti della matrice extracellulare [ECM] o un composto ECM commerciale, o utilizzando piastre rivestite disponibili in commercio). La spesa non è banale e rappresenta un potenziale ostacolo finanziario per alcuni laboratori interessati a perseguire attività di ricerca e sviluppo basate su hESC o hiPSC. Inoltre, la coltura in condizioni di feeder-free tende a portare le hESC e le hiPSC ad uno stato meno naïve rispetto a quello mantenuto sulle cellule feeder⁵, e questo può compromettere il successivo differenziamento e portare a variazioni genetiche⁶.

Storicamente, il passaggio di hESC e hiPSCs coltivate su cellule feeder ha comportato la raccolta meccanica - utilizzando un bisturi per asportare le colonie al microscopio⁷ - ma questo è stato in seguito in gran parte soppiantato dalla digestione enzimatica con o senza raschiamento delicato per isolare le colonie o le cellule dissociate. La raccolta meccanica è noiosa e richiede una microchirurgia di precisione. Il prelievo enzimatico può variare in efficienza a causa delle differenze enzimatiche da lotto a lotto e tende a favorire la completa dissociazione, che promuove la morte cellulare a meno che non sia contrastata dagli inibitori di ROCK ^8,9 e aumenta l'incidenza di cariotipi anomali⁹.

Per sfruttare la minore spesa e il maggiore potenziale di differenziazione della coltura di hESC e hiPSC su cellule feeder, evitando gli svantaggi del prelievo meccanico ed enzimatico, abbiamo stabilito un metodo rapido, efficace, economico e ad alto rendimento per la raccolta di colonie hESC e hiPSC mantenute su uno strato di alimentazione di fibroblasti prepuziali umani utilizzando la disadesione mediata da EDTA. Abbiamo confrontato la resa, la variabilità e la qualità delle cellule staminali con quella ottenuta con la raccolta meccanica (non abbiamo confrontato la digestione enzimatica a causa della variabilità aggiuntiva che questo approccio comporta). Notiamo che la disadesione mediata dall'EDTA funziona bene anche per il trasferimento di colonie da colture basate su feeder a condizioni prive di feeder, se lo si desidera per l'uso e le analisi a valle. Questo metodo fornisce una transizione con un metodo di passaggio coerente, poiché la disadesione indotta da EDTA è un approccio popolare impiegato per le colture prive di feeder.

Protocollo

Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Coltivazione di cellule di fibroblasti umani e preparazione dello strato di cellule di alimentazione

1. Seme 0,5 × 10⁶ fibroblasti prepuziali umani (di seguito denominati "cellule nutritrici") per ciascun pallone di coltura T-75 (numero di palloni secondo necessità) con 20 mL di terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM) con (p/) 10% di siero fetale bovino (FBS), di seguito denominato "terreno di coltura alimentare".
2. Quando le cellule di alimentazione raggiungono il 90% di confluenza, rimuovere il terreno e lavare 3 volte con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco per flacone per evitare l'inibizione della tripsina da parte di fattori nel terreno. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA a ciascun matraccio e porre il pallone o i palloni in un incubatore a 37 °C/5% di CO₂ per 5 minuti o fino a quando le cellule di alimentazione non si sono staccate dal pallone o dai palloni. Osservare il distacco delle cellule al microscopio come aggregati fluttuanti di cellule o singole cellule.
3. Aggiungere 5 mL di terreno fresco preriscaldato a ciascun matraccio per inattivare la tripsina-EDTA e sospendere delicatamente le cellule di alimentazione mediante pipettaggio.
4. Trasferire le celle di alimentazione in una provetta da centrifuga da 15 mL. Tappare il tubo e pellettare le celle di alimentazione mediante centrifugazione a 200 × g per 5 min.
5. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet della cella di alimentazione. Quindi, risospendere con cautela il pellet in 4 mL di terreno fresco della cella di alimentazione. Assicurarsi che le celle di alimentazione siano completamente risospese prima di contare utilizzando una camera di conteggio delle cellule o un altro apparecchio per il conteggio delle cellule.
6. Aggiungere 0,5 × 10⁶ cellule di alimentazione al numero richiesto di nuovi palloni di coltura T-75 per l'espansione e aggiungere 20 mL di terreno di coltura fresco a ciascun pallone. Incubare il pallone o i palloni di coltura in un incubatore a 37 °C/5% di CO₂ fino a quando le cellule di alimentazione non hanno raggiunto il 90% di confluenza.
   NOTA: Le celle di alimentazione possono essere utilizzate almeno fino al passaggio 25.
7. Calcolare il numero di cellule feeder necessarie per il numero di piastre di coltura tissutale da 35 mm che verranno utilizzate per la coltura delle hESC/hiPSC.
   NOTA: Di solito, 3,0 × 10⁵ cellule di alimentazione per piastra di coltura tissutale sono sufficienti per generare uno strato confluente di cellule di alimentazione.
8. Per evitare la proliferazione delle cellule nutritrici, assicurarsi che vengano bloccate mitoticamente in uno dei due modi.
   NOTA: Per entrambi i metodi, è possibile generare un grande lotto di cellule nutritrici con arresto mitotico e congelarlo in aliquote per un uso successivo.
   1. Eseguire l'arresto mitotico mediante irradiazione gamma trasferendo tutte le cellule di alimentazione necessarie in una provetta da centrifuga da 50 mL e rabboccando con il terreno di coltura della cellula di alimentazione per un volume totale di 5 mL. Trasportare immediatamente a temperatura ambiente in una macchina per l'irradiazione gamma e irradiare per arrestare mitoticamente le cellule di alimentazione (300 kV e 10 mA per 20 minuti).
      NOTA: Un ritardo nel trasporto può causare un fissaggio indesiderato delle celle di alimentazione alla parete della provetta da centrifuga da 50 mL. Se il trasporto richiede più di qualche minuto, assicurarsi che le celle di alimentazione rimangano sospese durante il trasporto agitando continuamente il tubo.
   2. Eseguire l'arresto mitotico utilizzando la mitomicina C trasferendo tutte le cellule feeder necessarie in 5 mL di terreno di coltura feeder in una provetta da centrifuga da 50 mL, quindi aggiungere 15 mL di terreno di coltura contenente 20 μg/mL di mitomicina C e incubare in un incubatore a 37 °C/5% di CO2 per 3 ore. Aggiungere 20 mL di PBS a 37 °C, pellettare le cellule mediante centrifugazione a 200 × g per 5 min, ripetere il lavaggio PBS altre due volte e risospendere nel terreno di alimentazione delle cellule.
9. Dopo che le cellule di alimentazione sono state bloccate mitoticamente, tornare alla cappa di coltura tissutale e placcare le cellule di alimentazione a 3,0 × 10⁵ cellule per piastra di coltura tissutale da 35 mm, come segue. Assicurarsi che le cellule di alimentazione siano completamente risospese, aggiungere il terreno di coltura delle cellule di alimentazione per raggiungere una concentrazione di cellule di alimentazione di 1,5 × 10⁵ per mL e aggiungere 2 ml di questa sospensione di cellule di alimentazione a ciascuna piastra di coltura tissutale da 35 mm.
10. Trasferire le piastre di coltura in un incubatore a 37 °C/5% di CO₂ . Per garantire una distribuzione uniforme delle cellule di alimentazione, muovere le piastre di coltura lentamente ma con decisione sul ripiano dell'incubatore avanti e indietro 3 volte, seguite da una pausa, quindi eseguire la stessa azione da sinistra a destra 3 volte. Non spostare nuovamente le stoviglie e chiudere delicatamente lo sportello dell'incubatrice.
11. Dopo 24 ore, passare dal terreno di alimentazione cellulare all'IMDM con sostituzione del siero (SR) al 10%. Sostituire questo mezzo in seguito ogni tre giorni. Le celle di alimentazione sono pronte per l'uso dopo i primi 3 giorni.

2. Raccolta meccanica delle colonie hESC o hiPSC

1. Terreno hESC preriscaldato costituito per l'80% da terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM), 20% SR, 1 mM di sostituto della glutammina 100x, 1 mM di aminoacidi non essenziali (NEAA), 1 mM di penicillina/streptomicina (P/S), 0,1 mM di 2-mercaptoetanolo e 10 ng/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF). Il terreno hESC viene utilizzato per la coltura di hESC o hiPSC sulle cellule feeder.
2. Prelevare piastre di coltura tissutale fresche da 35 mm contenenti cellule feeder con arresto mitotico e sostituire il terreno con 1,2 mL di terreno di coltura hESC contenente bFGF almeno 30 minuti prima del trasferimento delle colonie hESC/hiPSC.
3. Posizionare una piastra di coltura contenente colonie hESC/hiPSC su cellule feeder mitoticamente arrestate sotto un microscopio con ingrandimento 10x posizionato all'interno di una cappa a flusso laminare. Usa un bisturi sterile per tagliare con cura la circonferenza di ogni colonia e poi taglia ogni colonia in 5-6 pezzi più o meno uguali. Sollevare con cautela i pezzi della colonia con la punta della lama del bisturi in modo che si stacchino dallo strato cellulare di alimentazione e galleggino liberamente nel terreno.
   1. Cerca di evitare le regioni delle colonie che contengono cellule differenzianti, che appaiono come isole di cellule più piccole con nuclei meno distinti rispetto alle hESC/hiPSC all'interno di una colonia.
4. Trasferire le colonie galleggianti liberamente con una pipetta da 1 mL nelle nuove piastre di coltura contenenti le cellule di alimentazione. Cerca di tenere le colonie separate in modo che non crescano l'una nell'altra in seguito. Spostare con cautela le piastre di coltura in un'incubatrice cellulare ed evitare di disturbare le piastre fino al giorno successivo.
5. Il giorno seguente, aggiungere con cautela 600 μL di terreno hESC contenente bFGF a un volume finale di 1,8 mL. Sostituire il terreno hESC + bFGF ogni giorno successivo fino al passaggio successivo (generalmente dopo 1 settimana).

3. Raccolta delle colonie hESC o hiPSC mediante disadesione mediata da EDTA

1. Prelevare piastre di coltura fresche con cellule nutritrici bloccate mitoticamente e passare da IMDM con SR al 10% a 1,2 mL di terreno hESC + bFGF preriscaldato almeno 30 minuti prima del trasferimento delle colonie.
2. Maneggiare una piastra di coltura contenente colonie di hESC o hiPSC alla volta. Rimuovere il terreno hESC + bFGF e lavare le colonie con 1 mL di DPBS a temperatura ambiente per eliminare eventuali cellule non attaccate e detriti cellulari. Aggiungere 1 mL di EDTA 0,5 mM e incubare per 1 minuto a 37 °C. Se la cappa a flusso laminare è dotata di una piastra riscaldante, eseguire questo passaggio e i passaggi nella sezione 4 sulla piastra riscaldante per una migliore disadesione.
3. Dopo l'incubazione di 1 minuto, rimuovere la soluzione di EDTA e aggiungere con cautela 1 mL di terreno hESC + bFGF utilizzando una pipetta da 1 mL. Triturare delicatamente con la stessa pipetta per liberare le colonie dallo strato di cellule di alimentazione. Continuare a triturare con attenzione fino a quando lo strato di cellule di alimentazione non si allenta e si ripiega su se stesso in un ciuffo separato. Estrarre lo strato di celle di alimentazione con il puntale della pipetta.
4. Trasferire le colonie hESC/hiPSC sospese con una nuova pipetta da 1 mL in nuove piastre di coltura contenenti le cellule di alimentazione e il terreno hESC + bFGF, dividendo in un rapporto di 1:5. Le colonie tendono a distribuirsi uniformemente all'interno di ogni nuovo piatto di coltura, ma facilitano questo spostando delicatamente il piatto da un lato all'altro. Sostituire il terreno hESC + bFGF ogni giorno successivo fino al passaggio successivo (generalmente dopo 1 settimana).

Risultati

Nei saggi e nei confronti documentati di seguito, sono state utilizzate due linee hESC (H9 e HS429, rispettivamente di WiCell e del Karolinska Institute) e due linee hiPSC (NCS001 e NCS002, entrambe generate dalla Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells). I dati presentati nelle figure e nelle tabelle provengono dalle linee hESC, ma risultati del tutto simili sono stati ottenuti dalle linee hiPSC.

Nelle nostre mani, la raccolta meccanica ha portato alla divisione delle colonie in circa cinque o sei ciuffi di ~200-250 μm di diametro, mentre con la disadesione indotta dall'EDTA seguita da triturazione, ogni colonia è stata divisa in ~10-20 ciuffi di ~60 μm di diametro. Stimiamo che il numero di cellule in ogni grumo raccolto con EDTA sia ~20. Poiché non è pratico dividere una colonia in grumi di queste dimensioni con un bisturi, a questo proposito, la disadesione indotta dall'EDTA è superiore, in quanto genera grumi di dimensioni più favorevoli per la sopravvivenza delle cellule della colonia^10,11.

Le colonie hESC/hiPSC raccolte utilizzando EDTA erano anche più omogenee in termini di dimensioni e forma rispetto alle colonie raccolte meccanicamente (Figura 1A-F). Questo perché il taglio necessario per la raccolta meccanica genera bordi irregolari e dimensioni variabili dei ciuffi. Per valutarlo quantitativamente, abbiamo valutato la circolarità della colonia (come misura di quanto fossero arrotondati i bordi della colonia; un valore di 1 indica un cerchio perfetto) 5 giorni dopo il passaggio utilizzando il protocollo ImageJ-win64¹². La circolarità delle colonie è risultata significativamente più bassa nelle colonie raccolte meccanicamente (raccolta meccanica: 0,61 ± 0,10; Raccolta a base di EDTA: 0,84 ± 0,01; n = 10, p < 0,001, U-test di Mann-Whitney, U = 10).

La densità cellulare nelle colonie raccolte e ripiastre, che è una misura delle interazioni cellula-cellula post-raccolta durante la formazione della colonia, è risultata simile alla raccolta basata su EDTA e alla raccolta meccanica (Tabella 1 e Figura 1G,H). Le colonie raccolte meccanicamente avevano una maggiore tendenza a sviluppare necrosi nelle loro regioni centrali (Figura 1J). Ciò era probabilmente dovuto alla variabilità nella forma e, in particolare, alle dimensioni dei grumi cellulari isolati meccanicamente, poiché quando questi grumi sono troppo grandi, possono facilmente ripiegarsi su se stessi quando vengono trasferiti in nuove piastre di coltura. Questo non è stato il caso delle colonie raccolte utilizzando l'EDTA, che hanno mostrato uniformemente un aspetto traslucido con bordi distinti (Figura 1I).

Utilizzando la raccolta basata sull'EDTA, siamo stati in grado di raccogliere essenzialmente tutte le colonie che erano state stabilite in un pozzo entro 2-3 minuti. Utilizzando la raccolta meccanica, raccogliere tutte le colonie in un pozzo sarebbe noioso e richiederebbe molto tempo. In genere siamo riusciti a raccogliere solo ~ 30%, o ~ 20-25 colonie, utilizzando la raccolta meccanica, e questo ha richiesto ~ 20 minuti. Allo stesso modo, utilizzando la digestione della collagenasi seguita da una raschiatura delicata, era in genere difficile raccogliere tutte le colonie, anche se la procedura totale richiedeva solo pochi minuti. Pertanto, la raccolta a base di EDTA è altrettanto veloce o più veloce della raccolta enzimatica e più efficiente della raccolta meccanica o enzimatica.

Per valutare l'effetto dei diversi metodi di raccolta sulla staminalità e sulla pluripotenza, abbiamo prima sottoposto le colonie ottenute dopo 20 passaggi utilizzando la raccolta meccanica o basata su EDTA all'analisi qPCR (Figura 2) e alla colorazione immunocitochimica (Figura 3 e Figura 4) per i marcatori di staminalità. Le colonie ottenute utilizzando entrambi i metodi hanno mostrato un'espressione stabile dei marcatori di staminalità sia a livello di mRNA che di proteina. Abbiamo quindi valutato la pluripotenza differenziando i tre strati germinali nei corpi embrioidi (Figura 5 e Figura 6). I corpi embrioidi generati dalle hESC o dalle hiPSC ottenuti dopo 20 passaggi utilizzando entrambi i metodi contenevano una miscela di cellule che esprimevano marcatori comunemente valutati per ectoderma, mesoderma ed endoderma.

Infine, è stata valutata l'incidenza di aberrazioni genomiche nelle hESC e nelle hiPSC passate da ciascun metodo utilizzando l'analisi genetica basata sulla qPCR (vedi la Tabella dei Materiali). Le colonie ottenute dopo 20 passaggi utilizzando entrambi i metodi di prelievo hanno mostrato alcuni esempi di modesta deviazione da un pattern cromosomico diploide di riferimento (le anomalie valutate erano quelle comunemente associate alla riprogrammazione delle hiPSC ma possono essere ottenute anche nelle hESC) (Figura 7). Tuttavia, il modello di queste deviazioni era essenzialmente lo stesso nelle colonie ottenute dopo entrambi i metodi di raccolta, indicando che non erano collegate al metodo di raccolta.

Figura 1: Morfologia della colonia e densità cellulare dopo raccolta meccanica o a base di EDTA. (A-F) Immagini rappresentative in campo chiaro di colonie hESC H9 stabilite in coltura senza feeder per 5 giorni dopo 20 passaggi utilizzando la raccolta meccanica a base di EDTA (A-C) o (D-F). (G,H) Immagini rappresentative in fluorescenza della densità cellulare nelle colonie hESC H9 stabilite dopo 20 passaggi utilizzando (G) raccolta meccanica a base di EDTA o (H). I nuclei cellulari sono colorati con DAPI. (I,J) Immagini rappresentative in campo chiaro delle colonie hESC H9 stabilite dopo 20 passaggi utilizzando (I) raccolta meccanica basata su EDTA o (J). Si noti la regione centrale necrotica nella colonia raccolta meccanicamente (freccia in J). Tutte le immagini sono state acquisite 5 giorni dopo il 20° passaggio. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: hESC = cellula staminale embrionale umana; EDTA = acido etilendiamminotetraacetico; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Espressione dell'mRNA marcatore di staminalità in due linee hESC (H9 e HS429) generate dopo raccolta meccanica o basata su EDTA. Reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale dei marcatori indicati nelle hESC H9 (pannello superiore) e HS429 (pannello inferiore) dopo un singolo passaggio mediante raccolta meccanica, dopo 20 passaggi mediante raccolta meccanica e dopo 20 passaggi mediante raccolta a base di EDTA (diluizione 1:5). Il livello di espressione è relativo a quello del gene housekeeping ACTB (beta-actina). Le barre di errore indicano la deviazione standard. Abbreviazioni: hESC = cellula staminale embrionale umana; EDTA = acido etilendiamminotetraacetico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Espressione di proteine marcatrici di staminalità nella linea H9 hESC dopo diverse condizioni di raccolta. Colorazione rappresentativa in immunofluorescenza di colonie hESC H9 raccolte meccanicamente (A-E) prima di un ulteriore passaggio, (F-J) dopo 20 passaggi utilizzando la raccolta meccanica e (K-O) dopo 20 passaggi utilizzando la raccolta basata su EDTA. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: hESC = cellula staminale embrionale umana; EDTA = acido etilendiamminotetraacetico; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Espressione di proteine marcatrici di staminalità nella linea HS429 hESC dopo diverse condizioni di raccolta. Colorazione rappresentativa in immunofluorescenza di colonie hESC HS429 raccolte meccanicamente (A-E) prima di un ulteriore passaggio, (F-J) dopo 20 passaggi utilizzando la raccolta meccanica e (K-O) dopo 20 passaggi utilizzando la raccolta basata su EDTA. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: hESC = cellula staminale embrionale umana; EDTA = acido etilendiamminotetraacetico; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Espressione dei marcatori per i tre strati germinali nei corpi embrioidi generati dalla linea H9 hESC dopo il prelievo meccanico o a base di EDTA. Colorazione rappresentativa in immunofluorescenza di marcatori per (file A e D), ectoderma (ECTO, TUJI), endoderma (file B ed E) (ENDO, AFP) e mesoderma (file C e F) (MESO, SMA). EB generati (A-C) dopo 20 passaggi di raccolta meccanica o (D-F) dopo 20 passaggi di raccolta a base di EDTA. Barre di scala = 40 μm. Abbreviazioni: hESC = cellula staminale embrionale umana; EDTA = acido etilendiamminotetraacetico; EB = corpi embrioidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Espressione dei marcatori per i tre strati germinali nei corpi embrioidi generati dalla linea HS429 hESC a seguito di prelievo meccanico o a base di EDTA. Colorazione rappresentativa in immunofluorescenza di marcatori per (file A e D), ectoderma (ECTO, TUJI), endoderma (file B ed E) (ENDO, AFP) e mesoderma (file C e F) (MESO, SMA). EB generati (A-C) dopo 20 passaggi di raccolta meccanica (A-C) o (D-F) dopo 20 passaggi di raccolta a base di EDTA. Barre di scala = 40 μm. Abbreviazioni: hESC = cellula staminale embrionale umana; EDTA = acido etilendiamminotetraacetico; EB = corpi embrioidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: analisi genetica basata su qPCR di aberrazioni genomiche comuni nelle linee ESC HS9 e HS429 e nella linea iPSC NCS002 a seguito di 20 passaggi utilizzando il prelievo meccanico o basato su EDTA. La linea di base al valore 2 rappresenta la normale diploidia in tutti i marcatori cromosomici. Un valore di 1 o 3 rappresenterebbe una perdita o un guadagno, rispettivamente, del marcatore cromosomico indicato in tutte le cellule. Valori intermedi compresi tra 1 e 2 o tra 2 e 3 indicano la presenza di una perdita o di un guadagno del marcatore indicato in una frazione delle cellule. Si noti che il modello di aberrazioni è simile nelle due condizioni di raccolta. Abbreviazioni: ESC = cellula staminale embrionale; EDTA = acido etilendiamminotetraacetico; iPSC = cellula staminale pluripotente indotta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Densità cellulare (celle/mm2)
H9	Significare	stdev
Raccolta meccanica prima dell'ulteriore passaggio	3918	263.3
Raccolta meccanica 20 volte	3868	197.7
Raccolta EDTA 20 volte	4080	127.8
HS429	Significare	stdev
Raccolta meccanica prima dell'ulteriore passaggio	5249	565.4
Raccolta meccanica 20 volte	5247	726.3
Raccolta EDTA 20 volte	4963	448.8

Tabella 1: Confronto delle densità cellulari nelle colonie delle due linee hESC (H9 e HS429) generate dopo la raccolta meccanica o basata su EDTA. Le densità cellulari sono state valutate dopo un singolo passaggio utilizzando la raccolta meccanica, dopo 20 passaggi utilizzando la raccolta meccanica o dopo 20 passaggi utilizzando la raccolta basata su EDTA (alla diluizione 1:5). In tutti i casi, n = 5 colonie.

Discussione

Abbiamo descritto un metodo rapido ed economico per la raccolta di hESC e hiPSC coltivate su cellule feeder utilizzando la disadesione mediata da EDTA e lo abbiamo confrontato principalmente con il metodo convenzionale di raccolta meccanica utilizzando un bisturi. Abbiamo anche confrontato la raccolta basata su EDTA con la raccolta enzimatica per quanto riguarda la velocità del metodo, ma non gli aspetti della qualità della colonia risultante. La ragione di ciò è che il prelievo enzimatico è intrinsecamente più variabile ed è stato collegato a una maggiore prevalenza di aberrazioni genomiche⁵, che potrebbero oscurare le differenze tra i metodi.

Dimostriamo che la raccolta basata sull'EDTA è più veloce ed efficiente di entrambi gli altri metodi e genera colonie più piccole e morfologicamente più omogenee rispetto alla raccolta meccanica. Quest'ultima caratteristica è benefica per quanto riguarda la sopravvivenza cellulare, poiché i grumi più grandi ottenuti con il prelievo meccanico sono soggetti a necrosi centrale, mentre la digestione enzimatica tende a generare hESC e hiPSC isolate, che sono più inclini all'apoptosi e richiedono un trattamento extra, ad esempio con inibitori di ROCK, per sopravvivere. La raccolta a base di EDTA può essere utilizzata per almeno 20 passaggi. I metodi di raccolta basati sull'EDTA e meccanici sono comparabili per quanto riguarda la densità cellulare delle colonie, l'espressione di mRNA e proteine dei geni staminali, la differenziazione dei tre strati germinali nei corpi embrioidi e le anomalie genomiche. Se l'obiettivo è l'efficienza, una maggiore resa, una minore variabilità e una gestione più delicata delle hESC e delle hiPSC, è preferibile la raccolta basata su EDTA.

Notiamo anche che la raccolta basata su EDTA di hESC e hiPSC coltivate su cellule feeder è un modo economico per mantenere uno stato più naïve e fornisce una transizione graduale dalla coltura basata su feeder a quella feeder-free dove ciò è auspicabile.

Passaggi critici all'interno del protocollo
Le fasi più critiche della disadesione mediata da EDTA sono la sezione 3 del protocollo (incubazione nella soluzione di EDTA) e la sezione 4 (triturazione). Se l'esposizione alla soluzione di EDTA è superiore a 1 minuto, aumenta il rischio di dissociazione completa alle singole cellule. Ciò può verificarsi anche se la triturazione è troppo prolungata o troppo dura. Quest'ultimo è influenzato dalle dimensioni del puntale della pipetta. L'ideale è utilizzare pipette per colture cellulari da 1 mL come descritto qui. L'uso di un tipo diverso di pipetta con un diametro del puntale più piccolo è rischioso.

Risoluzione dei problemi
Se le cellule feeder continuano a proliferare, l'arresto mitotico non è stato efficace e deve essere prelevato un nuovo lotto e la procedura deve essere riavviata. Se le colonie non si staccano dallo strato cellulare di alimentazione, è necessario assicurarsi che non ci sia Ca²⁺ nell'EDTA e che la piastra di coltura contenente le colonie sia risciacquata bene con PBS per rimuovere eventuali residui di terreno di coltura cellulare prima di aggiungere l'EDTA. Troppa dissociazione, che genera cellule isolate o grumi cellulari troppo piccoli, può insorgere a causa di un'eccessiva triturazione e compromette l'insediamento di nuove colonie. Il grado di triturazione deve essere determinato empiricamente in prove del protocollo per confermare che i grumi cellulari risultanti hanno un diametro di ~60 μm. Se lo strato di alimentazione si stacca spontaneamente dalla piastra di coltura, soprattutto prima che le hESC/hiPSC siano pronte per la raccolta, potrebbe essere perché le cellule di alimentazione non sono state utilizzate entro ~7 giorni dalla preparazione. Pertanto, il periodo di tempo di utilizzo delle celle di alimentazione deve essere monitorato attentamente. Se lo strato di alimentazione si dissocia durante l'esposizione all'EDTA (cosa che non abbiamo mai osservato con le cellule di alimentazione utilizzate qui), è necessario modificare il tipo di cellula di alimentazione o il loro metodo di coltura.

Limiti della tecnica
Il limite principale della tecnica è che richiede un'ispezione visiva del processo di disadesione per ottenere un risultato di successo. Ciò significa che gli utenti devono imparare a identificare quando le colonie si staccano dallo strato di cellule di alimentazione e lo strato di cellule di alimentazione si stacca dal substrato. Tuttavia, questo non è difficile e, secondo la nostra esperienza, i nuovi utenti della tecnica possono padroneggiarla entro un paio di prove.

C'è anche la possibilità intrinseca che le hESC o le hiPSC raccolte possano essere contaminate da alcune cellule di alimentazione. Se l'intenzione è quella di trasferirsi in condizioni senza alimentazione o di isolare le hESC o le hiPSC per i saggi, tale contaminazione comprometterebbe la purezza. Notiamo che con le cellule di alimentazione utilizzate qui (fibroblasti prepuziali umani), è estremamente difficile dissociare lo strato di cellule di alimentazione, anche con la digestione enzimatica (non mostrata). Poiché lo strato di cellule di alimentazione non dissociate viene rimosso in toto, è probabile che la contaminazione delle hESC o delle hiPSC raccolte sia trascurabile. Poiché le cellule feeder sono, inoltre, mitoticamente arrestate, qualsiasi contaminazione finirebbe per diminuire a zero con un ulteriore passaggio delle hESC o delle hiPSC.

Significatività rispetto ai metodi esistenti
L'attuale norma per la coltura di hESC e hiPSC è di farlo in condizioni di assenza di feeder, per le quali l'uso dell'EDTA per il passaggio è molto diffuso. La coltura senza alimentatore dipende dall'uso di terreni di coltura appositamente formulati e substrati di coltura che ne garantiscono l'aderenza. Questi reagenti comportano una spesa aggiuntiva che può superare alcuni budget di laboratorio. Inoltre, la coltura in condizioni di feeder-free è stata associata a un potenziale di differenziazione perturbato a causa della mancanza di fattori specifici nei terreni di coltura feeder-free e di una conseguente transizione dallo stato naïve allo stato innescato. La crescita su cellule feeder mitoticamente arrestate evita questa transizione e può ridurre i costi complessivi a un livello gestibile, facilitando così l'uso più ampio delle cellule staminali pluripotenti nella ricerca di laboratorio.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575020
15 mL centrifuge tubes	Sarstedt	62.554.502
2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010
50 mL centrifuge tubes	Sarstedt	62.547.254
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	PeproTech	AF-100-18B-250UG
Brand Bürker Chamber	Fisher Scientific	10628431
Disposable scalpels no.15	Susann-Morton	505
DPBS (1x) without Ca/Mg	Gibco	14190-094
Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm	Falcon	353001
Eppendorf pipette 1 mL	Eppendorf
Eppendorf pipette 200 μL	Eppendorf
FBS (Fetal Bovine Serum)	Gibco	10270-106
Filter tip 1,000 μL	Sarstedt	70.1186.210
Filter tip 200 μL	Sarstedt	70.760.211
Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation)	Best Theratronics	BT/MTS 8007 GC3000E
Glutamax 100x	Gibco	35050-038
Growth Factor Reduced Matrixgel	Corning	734-0269
H9 hESC line	WiCell	WAe009-A
hPSC Genetic Analysis Kit	Stem Cell Technologies	#07550
HS429 hESC line	ECACC	KIe024-A
Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line	ATTC	CRL2429
IMDM (1x)	Gibco	21980-032
iPSC lines	Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells	NCS001 & NCS002
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss)	Zeiss
Microscope	CETI
Mitomycin C	Sigma Aldrich	M4287
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140.035
Pipettes, plastic 10 mL	Sarstedt	86.1254.001
Pipettes, plastic, 5 mL	Sarstedt	86.1253.001
Serum Replacement (SR)	Gibco	10828-028
Sterile filters 0.22 um	Sarstedt	83.1826.102
T-75 culture flask	ThermoScientific	156499
Trypan Blue Stain (0.4 %)	Gibco	15250-061
Trypsin-EDTA, 500 mL	Gibco	25300062