Fabricación de microgeles de quitosano-genipina de tamaño controlado y sin emulsión para aplicaciones de ingeniería de tejidos

Resumen

El presente protocolo describe un método no basado en emulsiones para la fabricación de microgeles de quitosano-genipina. El tamaño de estos microgeles se puede controlar con precisión, y pueden mostrar hinchazón dependiente del pH, degradarse in vivo y cargarse con moléculas terapéuticas que se liberan con el tiempo de manera sostenida, lo que las hace altamente relevantes para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Resumen

Los microgeles de quitosano son de gran interés en la ingeniería de tejidos debido a su amplia gama de aplicaciones, bajo costo e inmunogenicidad. Sin embargo, los microgeles de quitosano se fabrican comúnmente utilizando métodos de emulsión que requieren enjuagues con solventes orgánicos, que son tóxicos y dañinos para el medio ambiente. El presente protocolo presenta un método rápido, no citotóxico y no basado en emulsiones para fabricar microgeles de quitosano-genipina sin la necesidad de enjuagues con disolventes orgánicos. Los microgeles descritos aquí se pueden fabricar con un control de tamaño preciso. Exhiben una liberación sostenida de biomoléculas, lo que las hace altamente relevantes para la ingeniería de tejidos, biomateriales y medicina regenerativa. El quitosano se reticula con la genipina para formar una red de hidrogel, luego se pasa a través de un filtro de jeringa para producir los microgeles. Los microgeles se pueden filtrar para crear una variedad de tamaños, y muestran hinchazón dependiente del pH y se degradan con el tiempo enzimáticamente. Estos microgeles se han empleado en un modelo de lesión de la placa de crecimiento de ratas y se demostró que promueven una mayor reparación del tejido del cartílago y muestran una degradación completa a los 28 días in vivo. Debido a su bajo costo, alta conveniencia y facilidad de fabricación con materiales citocompatibles, estos microgeles de quitosano presentan una tecnología emocionante y única en ingeniería de tejidos.

Introducción

La placa de crecimiento, también conocida como physis, es la estructura del cartílago ubicada al final de los huesos largos que media el crecimiento en los niños. Si la placa de crecimiento se lesiona, se puede formar tejido de reparación conocido como "barra ósea", que interrumpe el crecimiento normal y puede causar defectos de crecimiento o deformidades angulares. Los datos epidemiológicos han demostrado que entre el 15% y el 30% de todas las lesiones esqueléticas infantiles están relacionadas con la placa de crecimiento. La formación de barras óseas ocurre en hasta el 30% de estas lesiones, lo que hace que las lesiones de la placa de crecimiento y su tratamiento asociado sean un problema de manifestación clínica significativa ^1,2,3,4. Cuando se produce la formación de barras óseas, la vía de tratamiento más común consiste en reseccionar la barra ósea e insertar un material interposicional, como silicio o tejido adiposo⁵. Sin embargo, los pacientes que se someten a cirugía de resección de barra ósea a menudo tienen un mal pronóstico para la recuperación completa, ya que actualmente no existe un tratamiento que pueda reparar completamente una placa de crecimiento lesionada ^6,7,8. A la luz de estas deficiencias, existe una necesidad crítica de estrategias efectivas para tratar las lesiones de la placa de crecimiento, tanto para prevenir la formación de una barra ósea como para regenerar el tejido sano del cartílago físico.

Las micropartículas de hidrogel, o microgeles, han ganado interés recientemente como andamios inyectables que pueden proporcionar una liberación sostenida de terapias⁹. Debido a su alta capacidad de adaptación y biocompatibilidad, los microgeles también son adecuados para el factor bioactivo o la encapsulación celular. Los microgeles pueden estar hechos de diversos materiales, que van desde polímeros sintéticos, como el polietilenglicol (PEG), hasta polímeros naturales como el alginato o el quitosano 10,11,12. Se ha demostrado que el quitosano tiene varios efectos beneficiosos para la ingeniería de tejidos, como su capacidad para desestabilizar la membrana externa de las bacterias gramnegativas, ofreciendo así una actividad antimicrobiana inherente^{1 3,14}. Además, el quitosano es rentable, interactivo con las células y se modifica fácilmente utilizando su estructura que contiene aminas. Los microgeles a base de quitosano prometen una estrategia de biomaterial para la administración de fármacos y la señalización de materiales que pueden promover la regeneración de tejidos al tiempo que previenen la infección bacteriana. Sin embargo, los microgeles de quitosano a menudo se fabrican con una amplia gama de técnicas que requieren equipos especiales, técnicas de emulsión o enjuagues con solventes citotóxicos. Por ejemplo, algunos estudios han fabricado microgeles de quitosano con métodos basados en emulsiones, pero estos protocolos requieren enjuagues con disolventes y reticulantes citotóxicos, lo que podría negar su traducción a entornos clínicos^15,16. Otros estudios han utilizado enfoques de microfluídica o electropulverización para fabricar microgeles de quitosano, que requieren equipo especial, preparación y capacitación^17,18. Los microgeles de quitosano también se hacen comúnmente con un proceso de reticulación en solución de quitosano; sin embargo, este método depende en gran medida de la viscosidad de la solución, la concentración del polímero y el caudal, lo que dificulta el control del tamaño y la dispersión de los microgeles^19,20. Por el contrario, el método para la fabricación de microgeles descrito en este documento no requiere equipos especializados ni enjuagues con solventes, lo que hace que estos microgeles sean viables para la fabricación en casi cualquier laboratorio o entorno. Por lo tanto, estos microgeles representan biomateriales altamente relevantes para un vehículo de administración de medicamentos rápido, rentable y fácil de producir para muchas aplicaciones.

Al modular la composición de un microgel y las características del material, los investigadores pueden obtener un control preciso sobre el microambiente celular, dirigiendo así el comportamiento celular de una manera dependiente del material. Los microgeles pueden emplearse solos o combinarse con sistemas de biomateriales a granel para impartir funcionalidades específicas, como la liberación prolongada de factores bioactivos o la señalización especial precisa para células nativas o exógenas. Los biomateriales y los microgeles han surgido como vías de tratamiento atractivas para las lesiones de las placas de crecimiento. Se ha dedicado un esfuerzo significativo al desarrollo de biomateriales a base de alginato y quitosano para tratar las lesiones de la placa de crecimiento 21,22,23,24,25. Debido a la naturaleza temporal dinámica de la osificación de la placa de crecimiento y el alargamiento óseo, el mecanismo de formación de barras óseas no se entiende completamente. Por lo tanto, se han desarrollado varios modelos animales para dilucidar mejor los mecanismos de osificación endocondral y formación de barras óseas, como en ratas, conejos y ovejas 26,27,28. Uno de estos modelos es un modelo de lesión de placa de crecimiento de rata, que utiliza un defecto de perforación en la tibia de la rata para producir una barra ósea de una manera predecible y reproducible e imita las lesiones humanas en las tres zonas de la placa de crecimiento^29,30. Varias estrategias basadas en biomateriales para tratar las lesiones de la placa de crecimiento se han probado utilizando este modelo. Además, se han desarrollado dos métodos diferentes para fabricar microgeles de quitosano, que pueden ser utilizados como un sistema de biomaterial inyectable que libera terapias de manera sostenida^10,31. Estos microgeles se han empleado en un modelo de lesión física de rata, y mostraron una mejor regeneración del cartílago³¹ al liberar SDF-1a y TGF-b3. Las técnicas proporcionadas en este protocolo describen los métodos desarrollados para fabricar estos microgeles de quitosano, que luego se pueden emplear en una amplia variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos. Por ejemplo, estudios recientes han utilizado microgeles de quitosano termo o magentos sensibles para aplicaciones de administración de fármacos oncológicos controlados^32,33.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado en Denver. Se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley de 6 semanas de edad para el presente estudio. El modelo de lesión de la placa de crecimiento de la rata se creó a raíz de un informe publicado previamente³⁰.

1. Preparación del polímero de quitosano

1. Obtener quitosano purificado y liofilizado de bajo peso molecular (LMW) de fuentes disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales).
2. Agregue 495 ml de agua de doble destilación (ddH₂O) y una barra de agitación a un vaso de precipitados de 1 L. Añadir 5 g de quitosano (Paso 1.1.) y mezclar bien.
   NOTA: El quitosano solo es escasamente soluble en una solución acuosa a pH fisiológico, por lo que el quitosano no se disolverá fácilmente en este paso.
3. Agregue 5 ml de ácido acético glacial a la solución de quitosano preparada anteriormente.
4. Revuelva cubierto a 300 rpm durante 18 h con el vaso de precipitados en un baño de agua a 50 °C.
5. Utilizando un matraz y un embudo de Büchner, filtre la solución de quitosano a través de tamaños decrecientes de papel de filtro: 22 μm, 8 μm y 2,7 μm (ver Tabla de materiales).
6. Agregue la solución de quitosano filtrada a los tubos de diálisis de celulosa (consulte la Tabla de materiales) y deje dializar en ddH₂O a temperatura ambiente durante 4 días, cambiando el ddH₂O todos los días.
   NOTA: Use agua ultrapura ddH₂O para el último cambio.
7. Transfiera la solución de quitosano dializado a un vaso de precipitados y ajuste el pH a 8.0 usando 1 M de NaOH.
8. Alícuota el quitosano en tubos de centrífuga y centrífuga a 4000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
9. Decantar el sobrenadante a una corriente de residuos y resuspendir el quitosano en ddH₂O, repitiendo 2x.
10. Congelar y luego liofilizar la bolita de quitosano.
    1. Cada día, retire el producto liofilizado y registre la masa.
       NOTA: Cuando la masa del producto liofilizado ya no cambia, el producto se seca completamente y se puede almacenar a -20 °C hasta que esté listo para su uso.

2. Fabricación de hidrogel de quitosano

1. Agregue 2 ml de ácido acético al 6% y 120 mg de quitosano purificado (Paso 1) a una jeringa Luer-lock de 10 ml para formar una solución de quitosano al 6% p/v.
2. Conecte la jeringa Luer-lock a otra jeringa idéntica usando un conector Luer-lock hembra-hembra y mezcle la solución hacia adelante y hacia atrás durante 30 s, o hasta que el quitosano se haya disuelto completamente en el ácido acético.
3. Antes de la reticulación, agregue cualquier agente terapéutico o bioactivo a la solución de quitosano (si es necesario). Para el presente estudio, se agregaron 200 ng de SDF-1a y TGF-b3 (ver Tabla de Materiales) a los microgeles.
   NOTA: SDF-1a y TGF-b3 son agentes bioactivos relevantes para la regeneración del tejido de la placa de crecimiento. SDF-1a promueve la migración de células madre mesenquimales al sitio del defecto, y TGF-b3 sirve como un factor condrogénico para inducir la diferenciación de estas células madre a lo largo del linaje condrogénico³¹.
   NOTA: Mezcle el quitosano nuevamente entre las jeringas para incorporar completamente la terapéutica.
4. Preparar 100 mM de solución reticulante madre de geniapina (ver Tabla de Materiales) en etanol al 100%.
5. Añadir 100 μL de la solución de genipina preparada (Paso 2.4.) a la jeringa que contiene quitosano, y mezclar de nuevo de un lado a otro entre las jeringas durante 30 s.
6. Extruir la mezcla de la jeringa en una placa de Petri de 35 mm, cubrirla con una película de parafina e incubarla a 37 °C durante la noche en una atmósfera humidificada.
   NOTA: La solución se volverá azul oscuro, lo que indica que se ha producido la reacción de reticulación entre el quitosano y la genipina, lo que lleva a la formación de microgel de quitosano.
7. Filtre el microgel de quitosano preparado siguiendo los pasos a continuación.
   1. Rompe suavemente el hidrogel en trozos más pequeños usando una espátula.
      NOTA: Las piezas deben ser lo suficientemente pequeñas como para ser transferidas a la parte posterior de una jeringa de 10 ml, ~ 1-2 cm de diámetro.
   2. Coloque un filtro del tamaño de malla deseado en la parte posterior de una jeringa limpia de 10 ml.
      NOTA: El rango de tamaño típico para microgeles está entre 50-200 μm.
   3. Transfiera las piezas de gel rotas a la jeringa equipada con el filtro y agregue 6 ml de ddH₂O.
      NOTA: El gel de quitosano se hinchará significativamente en el medio acuoso, por lo que se espera un gran cambio en el volumen del gel.
   4. Conecte la jeringa a través de un conector Luer-lock a otra jeringa limpia de 10 ml.
   5. Forzar la mezcla de gel + agua a través de la jeringa con el filtro para crear microgeles con un diámetro máximo especificado.
      1. Después de la primera filtración, abra la parte posterior de la jeringa que contiene el filtro y extruya la mezcla de nuevo en esta jeringa.
      2. Reemplace la parte posterior de la jeringa y fuerce la mezcla a través del filtro nuevamente.
      3. Repita la filtración 5-6x o hasta que haya poca resistencia a través del filtro.
8. Enjuague y purifique los microgeles filtrados.
   1. Transfiera la mezcla de gel filtrado a un tubo cónico de 50 ml, lleve el volumen total hasta 20 ml con ddH₂O y luego vórtice la mezcla para garantizar una dispersión homogénea.
   2. Centrifugar los microgeles a 100 x g durante 5 min a temperatura ambiente y decantar la fase acuosa superior.
   3. Resuspender los microgeles en 10 ml de etanol al 70%, vórtice, y colocar bajo luz UV durante 1 h para esterilizar.
   4. Centrifugar los microgeles a 1.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el etanol y enjuagar 3x con ddH₂O.

3. Preparación de microgeles para aplicaciones in vitro o in vivo

NOTA: Para el presente estudio, la regeneración del cartílago en las lesiones de la placa de crecimiento se estudió en un modelo de rata. Para más detalles, véase la referencia³¹.

1. Resuspend los gránulos de microgel 1:1 en ddH₂O. Los microgeles se pueden almacenar hasta por 1 mes suspendidos en ddH₂O a 4 °C. Si se utiliza un agente bioactivo, los microgeles deben usarse inmediatamente.
2. Cree el sitio de la lesión en el animal siguiendo un informe publicado previamente³⁰.
3. Enjuague el sitio de la lesión con solución salina y mantenga al animal sin tratar (para el estudio de control) o inyecte solo los microgeles de quitosano o los microgeles cargados con los agentes bioactivos (Paso 3.2.).
4. Cierre la herida en el animal y administre analgésicos postquirúrgicos³⁰.
5. En los días 7 o 28 después de la cirugía, sacrificar a la rata por sobredosis de CO₂ , extirpar las extremidades y realizar histología para evaluar la reparación del tejido en el sitio de la lesión³¹.

Resultados

La fabricación exitosa de microgeles de quitosano se basa en la reacción de reticulación entre la genipina y el quitosano, involucrando específicamente las aminas en las cadenas de polímeros de quitosano. A diferencia de otras técnicas de fabricación de microgel, este método no requiere emulsiones ni enjuagues con disolvente y se puede realizar rápida y fácilmente con equipos de bajo costo. Un indicador distintivo para la fabricación exitosa de microgel es el cambio de color distintivo de blanquecino a azul os...

Discusión

Los microgeles han sido ampliamente investigados en los últimos años debido a su alto nivel de aplicabilidad para diversos fines, como la administración de fármacos o la encapsulación celular⁹. La facilidad de fabricación de construcciones de biomateriales a microescala es de gran relevancia en la ingeniería de tejidos, ya que permite a los investigadores desarrollar estrategias basadas en hidrogel en un tamaño y escala de tiempo específicos. Sin embargo, la mayoría de los métodos para ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh