Fabricação de microgéis chitosan-genipin controlados por tamanho e sem emulsão para aplicações de engenharia de tecidos

Resumo

O presente protocolo descreve um método não baseado emulsão para a fabricação de microgéis de genipin quitosano. O tamanho desses microgésis pode ser precisamente controlado, e eles podem exibir inchaço dependente de pH, degradar in vivo, e ser carregados com moléculas terapêuticas que liberam ao longo do tempo de forma sustentada, tornando-os altamente relevantes para aplicações de engenharia de tecidos.

Resumo

Os microgéis chitosanos são de interesse significativo em engenharia de tecidos devido à sua ampla gama de aplicações, baixo custo e imunogenicidade. No entanto, os microgéis chitosanos são comumente fabricados usando métodos de emulsão que requerem enxágües de solventes orgânicos, que são tóxicos e prejudiciais ao meio ambiente. O presente protocolo apresenta um método rápido, não citotóxico, não baseado em emulsão para fabricação de microgéis de genipin chitosano sem a necessidade de enxaguantes orgânicos de solventes. Os microgésis aqui descritos podem ser fabricados com controle de tamanho preciso. Eles exibem a liberação sustentada de biomoléculas, tornando-as altamente relevantes para engenharia de tecidos, biomateriais e medicina regenerativa. Chitosan é interligado com genipin para formar uma rede de hidrogel, em seguida, passou por um filtro de seringa para produzir os microgésis. Os microgésos podem ser filtrados para criar uma variedade de tamanhos, e eles mostram inchaço dependente de pH e degradam-se ao longo do tempo enzimaticamente. Esses microgésis foram empregados em um modelo de lesão de placa de crescimento de ratos e foram demonstrados para promover o aumento da reparação de tecidos de cartilagem e para mostrar degradação completa aos 28 dias in vivo. Devido ao seu baixo custo, alta conveniência e facilidade de fabricação com materiais citocompatíveis, esses microgéis chitosanos apresentam uma tecnologia excitante e única na engenharia de tecidos.

Introdução

A placa de crescimento, também conhecida como fise, é a estrutura de cartilagem localizada no final de ossos longos que media o crescimento em crianças. Se a placa de crescimento se machucar, pode ser formado tecido de reparação conhecido como "barra óssea", que interrompe o crescimento normal e pode causar defeitos de crescimento ou deformidades angulares. Dados epidemiológicos mostram que 15%-30% de todas as lesões esqueléticas infantis estão relacionadas à placa de crescimento. A formação da barra óssea ocorre em até 30% dessas lesões, tornando as lesões da placa de crescimento e seu tratamento associado um problema significativo de manifestação clínica 1,2,3,4. Quando ocorre a formação da barra óssea, a avenida de tratamento mais comum envolve a ressecção da barra óssea e a inserção de um material interposicional, como tecido de silício ou adiposo⁵. No entanto, os pacientes submetidos à cirurgia de ressecção da barra óssea muitas vezes têm um prognóstico ruim para a recuperação completa, já que atualmente não há tratamento que possa reparar totalmente uma placa de crescimento^{lesionada 6,7,8}. Diante dessas deficiências, há uma necessidade crítica de estratégias eficazes para o tratamento de lesões de placas de crescimento, tanto na prevenção da formação de uma barra óssea quanto na regeneração do tecido saudável da cartilagem fiseal.

Micropartículas de hidrogel, ou microgésis, ganharam recentemente interesse como andaimes injetáveis que podem fornecer liberação sustentada de terapêutica⁹. Devido à sua alta sintonia e biocompatibilidade, os microgésis também são adequados para fator bioativo ou encapsulamento celular. Os microgels podem ser feitos de diversos materiais, desde polímeros sintéticos, como polietileno glicol (PEG), até polímeros naturais como alginato ou quitosan 10,11,12. Chitosan tem mostrado ter vários efeitos benéficos para a engenharia tecidual, como sua capacidade de desestabilizar a membrana externa de bactérias gram-negativas, oferecendo assim atividade antimicrobiana inerente^{1 3,14}. Além disso, o chitosan é econômico, interativo por células e facilmente modificado usando sua estrutura contendo amina. Microgéis baseados em Chitosan prometem uma estratégia de biomaterial para a entrega de medicamentos e sinalização material que pode promover a regeneração tecidual, evitando infecções bacterianas. No entanto, microgels chitosanos são frequentemente fabricados com uma ampla gama de técnicas que requerem equipamentos especiais, técnicas de emulsão ou enxágües de solventes citotóxicos. Por exemplo, alguns estudos fabricaram microgelos chitosanos com métodos baseados em emulsão, mas esses protocolos exigem enxaguantes solventes e crosslinkers citotóxicos, potencialmente negando sua tradução para configurações clínicas^15,16. Outros estudos utilizaram microfluidos ou abordagens de eletrospray para fabricar microgels chitosanos, que requerem equipamentos especiais, preparação e treinamento ^17,18. Microgéis chitosan também são comumente feitos com um processo dropwise de crosslinker em solução chitosana; no entanto, este método é altamente dependente da viscosidade da solução, concentração de polímeros e taxa de fluxo, dificultando o controle do tamanho e dispersão dos microgésis^19,20. Por outro lado, o método de fabricação de microgel descrito aqui não requer equipamentos especializados ou enxaguantes solventes, tornando esses microgésis viáveis para fabricação em quase qualquer laboratório ou configuração. Portanto, esses microgésis representam biomateriais altamente relevantes para um veículo de entrega de medicamentos rápido, econômico e fácil de produzir para muitas aplicações.

Ao modular a composição e características materiais de um microgel, os pesquisadores podem obter controle preciso sobre o microambiente celular, direcionando assim o comportamento celular de forma dependente do material. Os microgels podem ser empregados por conta própria ou combinados com sistemas biomateriais a granel para transmitir funcionalidades específicas, como a liberação estendida de fatores bioativos ou sinalização especial precisa para células nativas ou exógenas. Biomateriais e microgésis surgiram como caminhos de tratamento atraentes para lesões de placas de crescimento. Esforços significativos têm sido dedicados ao desenvolvimento de biomateriais à base de alginato e chitosan para tratar lesões de placas de crescimento 21,22,23,24,25. Devido à natureza temporal dinâmica da ossificação da placa de crescimento e do alongamento ósseo, o mecanismo de formação de barras ósseas não é totalmente compreendido. Por isso, diversos modelos animais foram desenvolvidos para melhor elucidar os mecanismos de ossificação endocondral e formação de barras ósseas, como em ratos, coelhos e ovelhas 26,27,28. Um desses modelos é um modelo de lesão de placa de crescimento de ratos, que usa um defeito de furo na tíbia de rato para produzir uma barra óssea de forma previsível e reprodutível e imita lesões humanas em todas as três zonas da placa de crescimento^29,30. Várias estratégias baseadas em biomateriais para o tratamento de lesões de placas de crescimento foram testadas usando este modelo. Além disso, foram desenvolvidos dois métodos diferentes para a fabricação de microgéis chitosanos, que podem ser usados como um sistema biomaterial injetável que libera terapêuticas de forma sustentada^10,31. Estes microgels foram empregados em um modelo de lesão fiseal de ratos, e apresentaram melhor regeneração da cartilagem³¹ ao liberar SDF-1a e TGF-b3. As técnicas fornecidas neste protocolo descrevem métodos desenvolvidos para fabricar esses microgéis chitosanos, que podem então ser empregados em uma ampla variedade de aplicações de engenharia de tecidos. Por exemplo, estudos recentes têm usado microgelis quitosanos termo ou magento-responsivos para aplicações de entrega de medicamentos oncológicos controlados^32,33.

Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Colorado Denver. Foram utilizados ratos de 6 semanas de idade, Sprague-Dawley. O modelo de lesão da placa de crescimento de ratos foi criado após um relatório publicado anteriormente³⁰.

1. Preparação do polímero chitosano

1. Obter chitosan de baixo peso molecular purificado e liofilizado (LMW) de fontes comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais).
2. Adicione 495 mL de água dupla destilada (ddH₂O) e uma barra de mexida a um béquer de 1 L. Adicione 5 g de chitosan (Passo 1.1.) e misture bem.
   NOTA: Chitosan é apenas solúvel com moderação em uma solução aquosa no pH fisiológico, de modo que o chitosan não se dissolverá facilmente nesta etapa.
3. Adicione 5 mL de ácido acético glacial à solução quitosana acima preparada.
4. Mexa coberto a 300 rpm por 18 h com o béquer definido em um banho de água mantido a 50 °C.
5. Utilizando um frasco e funil Büchner, filtrar a solução chitosana através de tamanhos decrescentes de papel filtro: 22 μm, 8 μm e 2,7 μm (ver Tabela de Materiais).
6. Adicione a solução de chitosan filtrada ao tubo de diálise de celulose (ver Tabela de Materiais) e deixe dialisar em ddH₂O em temperatura ambiente por 4 dias, alterando o ddH₂O todos os dias.
   NOTA: Use água ddH₂O ultrapura para a última alteração.
7. Transfira a solução de chitosan dialisada para um béquer e ajuste o pH para 8.0 usando 1 M NaOH.
8. Alíquotar o quitosan em tubos de centrífuga e centrífuga a 4000 x g por 5 min a temperatura ambiente.
9. Decante o supernatante para um fluxo de resíduos e resuspense o quitosan em ddH₂O, repetindo 2x.
10. Congele e lisephilize a pelota de chitosan.
    1. Todos os dias, remova o produto liofilizado e grave a massa.
       NOTA: Quando a massa do produto liofilizado não está mais mudando, o produto está totalmente seco e pode ser armazenado a -20 °C até estar pronto para uso.

2. Fabricação de hidrogel chitosano

1. Adicione 2 mL de ácido acético de 6% e 120 mg de quitosan purificado (Passo 1) a uma seringa luer-lock de 10 mL para formar uma solução chitosana de 6% w/v.
2. Conecte a seringa luer-lock a outra seringa idêntica usando um conector luer-lock feminino feminino e misture a solução para 30 s, ou até que o quitosano tenha totalmente dissolvido no ácido acético.
3. Antes de cruzar, adicione qualquer agente terapêutico ou bioativo à solução chitosana (se necessário). Para o presente estudo, foram adicionados 200 ng de SDF-1a e TGF-b3 (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: SDF-1a e TGF-b3 são agentes bioativos relevantes para a regeneração do tecido da placa de crescimento. O SDF-1a promove a migração de células-tronco mesenquimais para o local do defeito, e o TGF-b3 serve como um fator condrogênico para induzir a diferenciação dessas células-tronco pela linhagem condrogênica³¹.
   NOTA: Misture novamente o quitosano entre as seringas para incorporar totalmente o terapêutico.
4. Prepare 100 mM de solução de crosslinker de estoque de genipin (ver Tabela de Materiais) em 100% etanol.
5. Adicione 100 μL da solução genipin preparada (Passo 2.4.) à seringa contendo chitosan, e misture novamente entre seringas por 30 s.
6. Extrude a mistura da seringa em uma placa de Petri de 35 mm, cubra-a com filme de parafina e incuba-a a 37 °C durante a noite em uma atmosfera umidificada.
   NOTA: A solução ficará azul-escura, indicando que ocorreu a reação transfronteiriça entre o quitosano e o genipin, levando à formação de microgel chitosano.
7. Filtre o microgel chitosan preparado seguindo as etapas abaixo.
   1. Quebre suavemente o hidrogel em pedaços menores usando uma espátula.
      NOTA: As peças devem ser pequenas o suficiente para serem transferidas para a parte de trás de uma seringa de 10 mL, ~1-2 cm de diâmetro.
   2. Coloque um filtro do tamanho da malha desejada na parte de trás de uma seringa limpa de 10 mL.
      NOTA: A faixa de tamanho típica para microgels é entre 50-200 μm.
   3. Transfira as peças de gel quebradas para a seringa equipada com o filtro e adicione 6 mL de ddH₂O.
      NOTA: O gel de chitosan vai inchar significativamente no meio aquoso, de modo que uma grande mudança no volume de gel é esperada.
   4. Conecte a seringa através de um conector Luer-lock a outra seringa limpa de 10 mL.
   5. Force a mistura gel + água através da seringa com o filtro para criar microgels com um diâmetro máximo especificado.
      1. Após a primeira filtragem, abra a parte de trás da seringa contendo o filtro e extrude a mistura de volta para esta seringa.
      2. Substitua a parte de trás da seringa e force a mistura através do filtro novamente.
      3. Repita a filtragem 5-6x ou até que haja pouca resistência através do filtro.
8. Enxágüe e purifique os microgéis filtrados.
   1. Transfira a mistura de gel filtrada para um tubo cônico de 50 mL, leve o volume total até 20 mL com ddH₂O e, em seguida, o vórtice da mistura para garantir a dispersão homogênea.
   2. Centrifugar os microgel a 100 x g por 5 min em temperatura ambiente e decantar a fase aquosa superior.
   3. Resuspenja os microgels em 10 mL de 70% de etanol, vórtice, e coloque sob luz UV por 1h para esterilizar.
   4. Centrifugar os microgel a 1.000 x g por 5 min à temperatura ambiente, descartar o etanol e enxaguar 3x com ddH₂O.

3. Preparação de microgéis para aplicações in vitro ou in vivo

NOTA: Para o presente estudo, a regeneração da cartilagem nas lesões da placa de crescimento foi estudada em um modelo de rato. Para mais detalhes, consulte a referência³¹.

1. Resuspend as pelotas de microgel 1:1 no ddH₂O. Os microgels podem ser armazenados por até 1 mês suspensos em ddH₂O a 4 °C. Se um agente bioativo for usado, os microgels devem ser usados imediatamente.
2. Crie o local da lesão no animal após um relatório publicado anteriormente³⁰.
3. Lave o local da lesão com soro fisiológico e mantenha o animal sem tratamento (para estudo de controle) ou injete apenas os microgésis chitosanos ou os microgéis carregados com os agentes bioativos (Passo 3.2.).
4. Feche a ferida no animal e administre analgésicos pós-cirúrgicos³⁰.
5. Nos dias 7 ou 28 pós-cirurgia, eutanize o rato por overdose de CO₂ , extirpar os membros e realizar histologia para avaliar a reparação tecidual no local da lesão³¹.

Resultados

A fabricação bem sucedida de microgéis chitosanos depende da reação transversal entre genipin e chitosan, especificamente envolvendo as aminas nas cadeias de polímeros chitosanos. Em contraste com outras técnicas de fabricação de microgel, este método não requer emulsões ou enxaguantes de solventes e pode ser conduzido de forma rápida e fácil com equipamentos baratos. Um indicador marcante para a fabricação bem sucedida de microgel é a mudança de cor distinta de off-white para azul escuro depois que o c...

Discussão

Os microgels têm sido amplamente pesquisados nos últimos anos devido ao seu alto nível de aplicabilidade para vários fins, como entrega de medicamentos ou encapsulamento^{celular 9}. A facilidade de fabricação de construtos de micromateriais é de relevância significativa na engenharia de tecidos, pois permite aos pesquisadores desenvolver estratégias baseadas em hidrogel em um tamanho específico e escala de tempo. No entanto, a maioria dos métodos para fabricar microgels chitosanos exigem ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh