Fabrication de microgels de chitosane-genipine à taille contrôlée et sans émulsion pour des applications d’ingénierie tissulaire

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode non basée sur l’émulsion pour la fabrication de microgels de chitosane-genipine. La taille de ces microgels peut être contrôlée avec précision et ils peuvent présenter un gonflement dépendant du pH, se dégrader in vivo et être chargés de molécules thérapeutiques qui se libèrent au fil du temps de manière soutenue, ce qui les rend très pertinents pour les applications d’ingénierie tissulaire.

Résumé

Les microgels de chitosane présentent un intérêt considérable dans l’ingénierie tissulaire en raison de leur large éventail d’applications, de leur faible coût et de leur immunogénicité. Cependant, les microgels de chitosane sont généralement fabriqués à l’aide de méthodes d’émulsion qui nécessitent des rinçages au solvant organique, qui sont toxiques et nocifs pour l’environnement. Le présent protocole présente une méthode rapide, non cytotoxique et sans émulsion pour fabriquer des microgels de chitosane-genipine sans avoir besoin de rinçages au solvant organique. Les microgels décrits ici peuvent être fabriqués avec un contrôle précis de la taille. Ils présentent une libération prolongée de biomolécules, ce qui les rend très pertinents pour l’ingénierie tissulaire, les biomatériaux et la médecine régénérative. Le chitosane est réticulé avec la genipine pour former un réseau d’hydrogel, puis passé à travers un filtre à seringue pour produire les microgels. Les microgels peuvent être filtrés pour créer une gamme de tailles, et ils montrent un gonflement dépendant du pH et se dégradent avec le temps de manière enzymatique. Ces microgels ont été utilisés dans un modèle de lésion de plaque de croissance de rat et il a été démontré qu’ils favorisaient une réparation accrue du tissu cartilagineux et montraient une dégradation complète à 28 jours in vivo. En raison de leur faible coût, de leur grande commodité et de leur facilité de fabrication avec des matériaux cytocompatibles, ces microgels de chitosane présentent une technologie passionnante et unique en ingénierie tissulaire.

Introduction

La plaque de croissance, également connue sous le nom de physis, est la structure cartilagineuse située à l’extrémité des os longs qui médie la croissance chez les enfants. Si la plaque de croissance se blesse, un tissu de réparation connu sous le nom de « barre osseuse » peut se former, ce qui interrompt la croissance normale et peut provoquer des défauts de croissance ou des déformations angulaires. Les données épidémiologiques ont montré que 15% à 30% de toutes les blessures squelettiques infantiles sont liées à la plaque de croissance. La formation de barres osseuses se produit dans jusqu’à 30% de ces blessures, ce qui fait des lésions de la plaque de croissance et de leur traitement associé un problème de manifestation clinique important ^1,2,3,4. Lorsque la formation d’une barre osseuse se produit, la voie de traitement la plus courante consiste à résectionner la barre osseuse et à insérer un matériau interpositionnel, tel que le silicium ou le tissu adipeux⁵. Cependant, les patients qui subissent une chirurgie de résection de la barre osseuse ont souvent un mauvais pronostic pour un rétablissement complet, car il n’existe actuellement aucun traitement capable de réparer complètement une plaque de croissance blessée ^6,7,8. À la lumière de ces lacunes, il existe un besoin critique de stratégies efficaces pour traiter les blessures de la plaque de croissance, à la fois pour prévenir la formation d’une barre osseuse et pour régénérer le tissu cartilagineux physaire sain.

Les microparticules d’hydrogel, ou microgels, ont récemment gagné en intérêt en tant qu’échafaudages injectables pouvant fournir une libération prolongée de produits thérapeutiques⁹. En raison de leur grande accordabilité et de leur biocompatibilité, les microgels sont également bien adaptés à l’encapsulation de facteurs bioactifs ou de cellules. Les microgels peuvent être fabriqués à partir de divers matériaux, allant des polymères synthétiques, tels que le polyéthylène glycol (PEG), aux polymères naturels comme l’alginate ou le chitosane 10,11,12. Il a été démontré que le chitosane a plusieurs effets bénéfiques pour l’ingénierie tissulaire, tels que sa capacité à déstabiliser la membrane externe des bactéries à Gram négatif, offrant ainsi une activité antimicrobienne inhérente^{1 3,14}. De plus, le chitosane est rentable, interactif sur les cellules et facilement modifié à l’aide de sa structure contenant des amines. Les microgels à base de chitosane promettent une stratégie de biomatériau pour l’administration de médicaments et la signalisation des matériaux qui peuvent favoriser la régénération des tissus tout en prévenant les infections bactériennes. Cependant, les microgels de chitosane sont souvent fabriqués avec un large éventail de techniques qui nécessitent un équipement spécial, des techniques d’émulsion ou des rinçages au solvant cytotoxique. Par exemple, certaines études ont fabriqué des microgels de chitosane avec des méthodes à base d’émulsion, mais ces protocoles nécessitent des rinçages au solvant et des réticulants cytotoxiques, ce qui pourrait annuler leur traduction en milieu clinique^15,16. D’autres études ont utilisé des approches de microfluidique ou d’électropulvérisation pour fabriquer des microgels de chitosane, qui nécessitent un équipement, une préparation et une formation spéciaux^17,18. Les microgels de chitosane sont également couramment fabriqués avec un processus goutte à goutte de réticulant en solution de chitosane; cependant, cette méthode dépend fortement de la viscosité de la solution, de la concentration en polymère et du débit, ce qui rend difficile le contrôle de la taille et de la dispersion des microgels^19,20. Inversement, la méthode de fabrication de microgels décrite dans le présent document ne nécessite aucun équipement spécialisé ni rinçage au solvant, ce qui rend ces microgels viables pour la fabrication dans presque tous les laboratoires ou environnements. Par conséquent, ces microgels représentent des biomatériaux très pertinents pour un véhicule d’administration de médicaments rapide, rentable et facile à produire pour de nombreuses applications.

En modulant la composition et les caractéristiques matérielles d’un microgel, les chercheurs peuvent obtenir un contrôle précis sur le microenvironnement cellulaire, dirigeant ainsi le comportement cellulaire d’une manière dépendante du matériau. Les microgels peuvent être utilisés seuls ou combinés avec des systèmes de biomatériaux en vrac pour conférer des fonctionnalités spécifiques, telles que la libération prolongée de facteurs bioactifs ou une signalisation spéciale précise pour les cellules natives ou exogènes. Les biomatériaux et les microgels sont devenus des voies de traitement attrayantes pour les lésions des plaques de croissance. Des efforts importants ont été consacrés au développement de biomatériaux à base d’alginate et de chitosane pour traiter les lésions des plaques de croissance 21,22,23,24,25. En raison de la nature temporelle dynamique de l’ossification de la plaque de croissance et de l’allongement osseux, le mécanisme de formation de la barre osseuse n’est pas entièrement compris. Par conséquent, plusieurs modèles animaux ont été développés pour mieux élucider les mécanismes de l’ossification endochondrale et de la formation de barres osseuses, comme chez les rats, les lapins et les moutons 26,27,28. L’un de ces modèles est un modèle de blessure de plaque de croissance de rat, qui utilise un défaut de trou de forage dans le tibia du rat pour produire une barre osseuse de manière prévisible et reproductible et imite les blessures humaines dans les trois zones de la plaque de croissance^29,30. Plusieurs stratégies basées sur les biomatériaux pour traiter les lésions des plaques de croissance ont été testées à l’aide de ce modèle. En outre, deux méthodes différentes pour fabriquer des microgels de chitosane ont été développées, qui peuvent être utilisées comme un système de biomatériaux injectables qui libère des produits thérapeutiques de manière soutenue^10,31. Ces microgels ont été utilisés dans un modèle de blessure physique chez le rat, et ils ont montré une amélioration de la régénération du cartilage³¹ lors de la libération de SDF-1a et TGF-b3. Les techniques fournies dans ce protocole décrivent les méthodes développées pour fabriquer ces microgels de chitosane, qui peuvent ensuite être utilisés dans une grande variété d’applications d’ingénierie tissulaire. Par exemple, des études récentes ont utilisé des microgels de chitosane thermo- ou magento-responsive pour des applications d’administration contrôlée de médicaments oncologiques^32,33.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Colorado à Denver. Des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 6 semaines ont été utilisés pour la présente étude. Le modèle de blessure à la plaque de croissance du rat a été créé à la suite d’un rapport³⁰ publié précédemment.

1. Préparation du polymère chitosane

1. Obtenir du chitosane purifié et lyophilisé de faible poids moléculaire (LMW) à partir de sources disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux).
2. Ajouter 495 mL d’eau double distillée (ddH₂O) et un agitateur dans un bécher de 1 L. Ajouter 5 g de chitosane (étape 1.1.) et bien mélanger.
   REMARQUE: Le chitosane n’est que peu soluble dans une solution aqueuse au pH physiologique, de sorte que le chitosane ne se dissoudra pas facilement à cette étape.
3. Ajouter 5 mL d’acide acétique glacial à la solution de chitosane préparée ci-dessus.
4. Remuer à 300 tr/min pendant 18 h avec le bécher fixé au bain-marie maintenu à 50 °C.
5. À l’aide d’une fiole et d’un entonnoir Büchner, filtrez la solution de chitosane en diminuant les tailles de papier filtre : 22 μm, 8 μm et 2,7 μm (voir tableau des matériaux).
6. Ajouter la solution de chitosane filtrée au tube de dialyse en cellulose (voir Tableau des matériaux) et laisser dialyser dans ddH₂O à température ambiante pendant 4 jours, en changeant le ddH₂O tous les jours.
   REMARQUE: Utilisez de l’eau ddH₂O ultrapure pour la dernière modification.
7. Transférer la solution de chitosane dialysée dans un bécher et ajuster le pH à 8,0 à l’aide de 1 M NaOH.
8. Aliquoter le chitosane dans des tubes centrifuges et centrifuger à 4000 x g pendant 5 min à température ambiante.
9. Décantez le surnageant à un flux de déchets et remettez en suspension le chitosane en ddH₂O, en répétant 2x.
10. Congeler puis lyophiliser la pastille de chitosane.
    1. Chaque jour, retirez le produit lyophilisé et enregistrez la masse.
       REMARQUE: Lorsque la masse du produit lyophilisé ne change plus, le produit est complètement séché et peut être conservé à -20 ° C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

2. Fabrication de l’hydrogel de chitosane

1. Ajouter 2 mL d’acide acétique à 6 % et 120 mg de chitosane purifié (étape 1) à une seringue Luer-lock de 10 mL pour former une solution de chitosane à 6 % p/v.
2. Connectez la seringue Luer-lock à une autre seringue identique à l’aide d’un connecteur Luer-lock femelle-femelle et mélangez la solution d’avant en arrière pendant 30 s, ou jusqu’à ce que le chitosane soit complètement dissous dans l’acide acétique.
3. Avant la réticulation, ajoutez tout agent thérapeutique ou bioactif à la solution de chitosane (si nécessaire). Pour la présente étude, 200 ng de SDF-1a et de TGF-b3 (voir tableau des matériaux) ont été ajoutés aux microgels.
   REMARQUE: SDF-1a et TGF-b3 sont des agents bioactifs pertinents pour la régénération des tissus de la plaque de croissance. SDF-1a favorise la migration des cellules souches mésenchymateuses vers le site du défaut, et le TGF-b3 sert de facteur chondrogène pour induire la différenciation de ces cellules souches dans la lignée chondrogène³¹.
   REMARQUE: Mélanger à nouveau le chitosane entre les seringues pour incorporer complètement le thérapeutique.
4. Préparer 100 mM de solution de réticulation de genipine (voir tableau des matériaux) dans de l’éthanol à 100 %.
5. Ajouter 100 μL de la solution de genipine préparée (étape 2.4.) à la seringue contenant du chitosane, et mélanger à nouveau entre les seringues pendant 30 s.
6. Extruder le mélange de la seringue sur une boîte de Petri de 35 mm, le recouvrir d’un film de paraffine et l’incuber à 37 °C pendant la nuit dans une atmosphère humidifiée.
   REMARQUE: La solution deviendra bleu foncé, indiquant que la réaction de réticulation entre le chitosane et la genipine s’est produite, conduisant à la formation de microgel de chitosane.
7. Filtrer le microgel de chitosane préparé en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Casser doucement l’hydrogel en plus petits morceaux à l’aide d’une spatule.
      REMARQUE: Les pièces doivent être suffisamment petites pour être transférées à l’arrière d’une seringue de 10 mL, d’environ 1 à 2 cm de diamètre.
   2. Placez un filtre de la taille de maille souhaitée à l’arrière d’une seringue propre de 10 mL.
      REMARQUE: La gamme de taille typique pour les microgels est comprise entre 50 et 200 μm.
   3. Transférer les morceaux de gel cassés dans la seringue équipée du filtre et ajouter 6 mL de ddH₂O.
      REMARQUE: Le gel de chitosane gonflera considérablement dans le milieu aqueux, de sorte qu’un grand changement dans le volume de gel est attendu.
   4. Connectez la seringue via un connecteur Luer-lock à une autre seringue propre de 10 mL.
   5. Forcez le mélange gel + eau à travers la seringue avec le filtre pour créer des microgels d’un diamètre maximal spécifié.
      1. Après la première filtration, ouvrez l’arrière de la seringue contenant le filtre et extrudez le mélange dans cette seringue.
      2. Remplacez l’arrière de la seringue et forcez à nouveau le mélange à travers le filtre.
      3. Répétez la filtration 5-6x ou jusqu’à ce qu’il y ait peu de résistance à travers le filtre.
8. Rincez et purifiez les microgels filtrés.
   1. Transférer le mélange de gel filtré dans un tube conique de 50 mL, porter le volume total à 20 mL avec ddH₂O, puis vortexer le mélange pour assurer une dispersion homogène.
   2. Centrifuger les microgels à 100 x g pendant 5 min à température ambiante et décanter la phase aqueuse supérieure.
   3. Remettre en suspension les microgels dans 10 mL d’éthanol à 70%, vortex, et placer sous lumière UV pendant 1 h pour stériliser.
   4. Centrifuger les microgels à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante, jeter l’éthanol et rincer 3x avec ddH₂O.

3. Préparation de microgels pour des applications in vitro ou in vivo

REMARQUE: Pour la présente étude, la régénération du cartilage dans les lésions de la plaque de croissance a été étudiée dans un modèle de rat. Pour plus de détails, voir la référence³¹.

1. Remettre en suspension les granulés de microgel 1:1 dans ddH₂O. Les microgels peuvent être conservés jusqu’à 1 mois en suspension dans ddH₂O à 4 °C. Si un agent bioactif est utilisé, les microgels doivent être utilisés immédiatement.
2. Créez le site de la blessure chez l’animal à la suite d’un rapport³⁰ publié précédemment.
3. Rincer le site de la blessure avec une solution saline et soit garder l’animal non traité (pour l’étude de contrôle), soit injecter les microgels de chitosane uniquement ou les microgels chargés des agents bioactifs (étape 3.2.).
4. Fermer la plaie chez l’animal et administrer des analgésiques post-chirurgicaux³⁰.
5. Aux jours 7 ou 28 après la chirurgie, euthanasier le rat par surdosage de CO₂ , exciser les membres et effectuer une histologie pour évaluer la réparation tissulaire au site de la blessure³¹.

Résultats

La fabrication réussie de microgels de chitosane repose sur la réaction de réticulation entre la genipine et le chitosane, impliquant spécifiquement les amines sur les chaînes de polymères de chitosane. Contrairement à d’autres techniques de fabrication de microgels, cette méthode ne nécessite pas d’émulsions ou de rinçages au solvant et peut être rapidement et facilement réalisée avec un équipement peu coûteux. Un indicateur caractéristique de la fabrication réussie de microgels est le changement d...

Discussion

Les microgels ont fait l’objet de nombreuses recherches ces dernières années en raison de leur haut niveau d’applicabilité à diverses fins, telles que l’administration de médicaments ou l’encapsulation cellulaire⁹. La facilité de fabrication de constructions de biomatériaux à micro-échelle est d’une importance significative dans l’ingénierie tissulaire, car elle permet aux chercheurs de développer des stratégies à base d’hydrogel à une taille et à une échelle de temps...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh