Herstellung von größenkontrollierten und emulsionsfreien Chitosan-Genipin-Mikrogelen für Tissue-Engineering-Anwendungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein nicht-emulsionsbasiertes Verfahren zur Herstellung von Chitosan-Genipin-Mikrogelen. Die Größe dieser Mikrogele kann präzise kontrolliert werden, und sie können pH-abhängige Schwellungen aufweisen, in vivo abgebaut werden und mit therapeutischen Molekülen beladen sein, die im Laufe der Zeit nachhaltig freigesetzt werden, was sie für Tissue-Engineering-Anwendungen sehr relevant macht.

Zusammenfassung

Chitosan-Mikrogele sind aufgrund ihres breiten Anwendungsspektrums, ihrer niedrigen Kosten und ihrer Immunogenität von großem Interesse im Tissue Engineering. Chitosan-Mikrogele werden jedoch üblicherweise mit Emulsionsmethoden hergestellt, die organische Lösungsmittelspülungen erfordern, die giftig und umweltschädlich sind. Das vorliegende Protokoll stellt eine schnelle, nicht zytotoxische, nicht auf Emulsion basierende Methode zur Herstellung von Chitosan-Genipin-Mikrogelen ohne die Notwendigkeit organischer Lösungsmittelspülungen vor. Die hierin beschriebenen Mikrogele können mit präziser Größenkontrolle hergestellt werden. Sie weisen eine anhaltende Freisetzung von Biomolekülen auf und sind damit für Tissue Engineering, Biomaterialien und regenerative Medizin von hoher Relevanz. Chitosan wird mit Genipin zu einem Hydrogelnetzwerk vernetzt und dann durch einen Spritzenfilter geleitet, um die Mikrogele herzustellen. Die Mikrogele können gefiltert werden, um eine Reihe von Größen zu erzeugen, und sie zeigen pH-abhängige Schwellungen und bauen sich im Laufe der Zeit enzymatisch ab. Diese Mikrogele wurden in einem Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell eingesetzt und es wurde gezeigt, dass sie eine erhöhte Knorpelgewebereparatur fördern und nach 28 Tagen in vivo einen vollständigen Abbau zeigen. Aufgrund ihrer niedrigen Kosten, ihres hohen Komforts und ihrer einfachen Herstellung mit zytokompatiblen Materialien stellen diese Chitosan-Mikrogele eine aufregende und einzigartige Technologie im Tissue Engineering dar.

Einleitung

Die Wachstumsplatte, auch bekannt als Physis, ist die Knorpelstruktur am Ende langer Knochen, die das Wachstum bei Kindern vermittelt. Wenn die Wachstumsplatte verletzt wird, kann sich Reparaturgewebe bilden, das als "knöcherner Balken" bekannt ist, was das normale Wachstum unterbricht und Wachstumsdefekte oder Winkeldeformitäten verursachen kann. Epidemiologische Daten haben gezeigt, dass 15%-30% aller Skelettverletzungen im Kindesalter mit der Wachstumsplatte zusammenhängen. Die Bildung von Knochenstäben tritt bei bis zu 30% dieser Verletzungen auf, was Wachstumsplattenverletzungen und die damit verbundene Behandlung zu einem signifikanten klinischen Manifestationsproblem^macht 1,2,3,4. Wenn eine knöcherne Stabbildung auftritt, besteht der häufigste Behandlungsweg darin, den knöchernen Stab zu resektieren und ein Interpositionsmaterial wie Silizium oder Fettgewebe^{einzuführen 5}. Patienten, die sich einer knöchernen Bar-Resektionsoperation unterziehen, haben jedoch oft eine schlechte Prognose für eine vollständige Genesung, da es derzeit keine Behandlung gibt, die eine verletzte Wachstumsplatte vollständig reparieren kann ^6,7,8. Angesichts dieser Mängel besteht ein kritischer Bedarf an wirksamen Strategien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen, sowohl bei der Verhinderung der Bildung eines knöchernen Balkens als auch bei der Regeneration von gesundem physärem Knorpelgewebe.

Hydrogel-Mikropartikel oder Mikrogele haben in letzter Zeit Interesse als injizierbare Gerüste gewonnen, die eine anhaltende Freisetzung von Therapeutika ermöglichen^{können 9}. Aufgrund ihrer hohen Abstimmbarkeit und Biokompatibilität eignen sich Mikrogele auch gut für die Bioaktivfaktor- oder Zellverkapselung. Mikrogele können aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, die von synthetischen Polymeren wie Polyethylenglykol (PEG) bis hin zu natürlichen Polymeren wie Alginat oder Chitosan^10,11,12 reichen. Es hat sich gezeigt, dass Chitosan mehrere positive Auswirkungen auf das Tissue Engineering hat, wie z.B. seine Fähigkeit, die äußere Membran von gramnegativen Bakterien zu destabilisieren und dadurch inhärente antimikrobielle Aktivität^{zu bieten 1 3,14}. Darüber hinaus ist Chitosan kostengünstig, zellinteraktiv und leicht zu modifizieren mit seiner aminhaltigen Struktur. Chitosan-basierte Mikrogele versprechen eine Biomaterialstrategie für die Arzneimittelabgabe und Materialsignalisierung, die die Geweberegeneration fördern und gleichzeitig bakterielle Infektionen verhindern kann. Chitosan-Mikrogele werden jedoch oft mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt, die spezielle Ausrüstung, Emulsionstechniken oder zytotoxische Lösungsmittelspülungen erfordern. Zum Beispiel haben einige Studien Chitosan-Mikrogele mit emulsionsbasierten Methoden hergestellt, aber diese Protokolle erfordern Lösungsmittelspülungen und zytotoxische Vernetzer, was möglicherweise ihre Translation in klinische Umgebungen negiert^15,16. Andere Studien haben Mikrofluidik- oder Elektrospray-Ansätze verwendet, um Chitosan-Mikrogele herzustellen, die spezielle Ausrüstung, Vorbereitung und Schulung erfordern^17,18. Chitosan-Mikrogele werden auch üblicherweise mit einem tropfenweisen Prozess des Vernetzers in Chitosanlösung hergestellt; Diese Methode ist jedoch stark von der Lösungsviskosität, der Polymerkonzentration und der Durchflussrate abhängig, was es schwierig macht, die Größe und Dispersität der Mikrogele^19,20 zu kontrollieren. Umgekehrt erfordert das hierin beschriebene Verfahren zur Mikrogelherstellung keine spezielle Ausrüstung oder Lösungsmittelspülungen, wodurch diese Mikrogele für die Herstellung in fast jedem Labor oder jeder Umgebung geeignet sind. Daher stellen diese Mikrogele hochrelevante Biomaterialien für ein schnelles, kostengünstiges und einfach herzustellendes Arzneimittelabgabevehikel für viele Anwendungen dar.

Durch die Modulation der Zusammensetzung und der Materialeigenschaften eines Mikrogels können Forscher eine präzise Kontrolle über die zelluläre Mikroumgebung erlangen und so das Zellverhalten materialabhängig steuern. Mikrogele können allein oder in Kombination mit Bulk-Biomaterialsystemen eingesetzt werden, um spezifische Funktionalitäten zu vermitteln, wie z.B. die verlängerte Freisetzung bioaktiver Faktoren oder eine präzise spezielle Signalgebung für native oder exogene Zellen. Biomaterialien und Mikrogele haben sich als attraktive Behandlungsmöglichkeiten für Wachstumsplattenverletzungen herauskristallisiert. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Alginat- und Chitosan-basierte Biomaterialien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen zu entwickeln 21,22,23,24,25. Aufgrund der dynamischen zeitlichen Natur der Wachstumsplattenverknöcherung und Knochendehnung ist der Mechanismus der knöchernen Balkenbildung nicht vollständig verstanden. Daher wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um die Mechanismen der endochondralen Ossifikation und der knöchernen Balkenbildung, wie bei Ratten, Kaninchen und Schafen, besser aufzuklären^26,27,28. Ein solches Modell ist ein Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell, das einen Bohrlochdefekt in der Rattentibia verwendet, um einen knöchernen Balken in einer vorhersehbaren und reproduzierbaren Weise herzustellen und menschliche Verletzungen in allen drei Zonen der Wachstumsplatte ^29,30 nachzuahmen. Mehrere biomaterialbasierte Strategien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen wurden mit diesem Modell getestet. Darüber hinaus wurden zwei verschiedene Methoden zur Herstellung von Chitosan-Mikrogelen entwickelt, die als injizierbares Biomaterialsystem verwendet werden können, das Therapeutika nachhaltig freisetzt ^10,31. Diese Mikrogele wurden in einem Rattenphyseal-Verletzungsmodell eingesetzt und zeigten eine verbesserte Knorpelregeneration³¹ bei der Freisetzung von SDF-1a und TGF-b3. Die in diesem Protokoll bereitgestellten Techniken beschreiben Methoden, die zur Herstellung dieser Chitosan-Mikrogele entwickelt wurden, die dann in einer Vielzahl von Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt werden können. Zum Beispiel haben neuere Studien thermo- oder magento-responsive Chitosan-Mikrogele für kontrollierte onkologische Arzneimittelverabreichungsanwendungen^{verwendet 32,33}.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. 6 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden für die vorliegende Studie verwendet. Das Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell wurde nach einem zuvor veröffentlichten Bericht^{erstellt 30}.

1. Herstellung des Chitosanpolymers

1. Erhalten Sie gereinigtes und lyophilisiertes niedermolekulares (LMW) Chitosan aus kommerziell verfügbaren Quellen (siehe Materialtabelle).
2. 495 ml doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O) und eine Rührstange zu einem 1 L Becherglas geben. 5 g Chitosan (Schritt 1.1.) zugeben und gut mischen.
   HINWEIS: Chitosan ist in einer wässrigen Lösung bei physiologischem pH-Wert nur spärlich löslich, so dass sich das Chitosan bei diesem Schritt nicht leicht auflöst.
3. Fügen Sie 5 ml Eisessigsäure zu der oben hergestellten Chitosanlösung hinzu.
4. Bei 300 U/min 18 h mit dem Becherglas in einem Wasserbad bei 50 °C umrühren.
5. Filtern Sie die Chitosanlösung mit einem Büchnerkolben und Trichter durch abnehmende Filterpapiergrößen: 22 μm, 8 μm und 2,7 μm (siehe Materialtabelle).
6. Die gefilterte Chitosanlösung in den Cellulose-Dialyseschlauch geben (siehe Materialtabelle) und in ddH 2 O bei Raumtemperatur 4Tage lang dialysieren lassen, wobei das ddH₂O täglich gewechselt wird.
   HINWEIS: Verwenden Sie für die letzte Änderung ultrareines ddH₂O-Wasser.
7. Die dialysierte Chitosanlösung in ein Becherglas geben und den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 8,0 einstellen.
8. Aliquot das Chitosan in Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 4000 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
9. Dekantieren Sie den Überstand zu einem Abfallstrom und suspendieren Sie das Chitosan in ddH 2 O, wobei Sie_{2x wiederholen.}
10. Einfrieren und dann das Chitosan-Pellet lyophilisieren.
    1. Entfernen Sie jeden Tag das lyophilisierte Produkt und zeichnen Sie die Masse auf.
       HINWEIS: Wenn sich die Masse des lyophilisierten Produkts nicht mehr ändert, ist das Produkt vollständig getrocknet und kann bei -20 ° C gelagert werden, bis es gebrauchsfertig ist.

2. Herstellung von Chitosan-Hydrogel

1. Fügen Sie 2 ml 6% Essigsäure und 120 mg gereinigtes Chitosan (Schritt 1) zu einer 10 ml Luer-Lock-Spritze hinzu, um eine 6% w/v Chitosanlösung zu bilden.
2. Verbinden Sie die Luer-Lock-Spritze mit einer anderen identischen Spritze über einen Luer-Lock-Buchsenstecker und mischen Sie die Lösung 30 s hin und her oder bis sich das Chitosan vollständig in der Essigsäure aufgelöst hat.
3. Vor der Vernetzung fügen Sie der Chitosanlösung (falls erforderlich) ein therapeutisches oder bioaktives Mittel hinzu. Für die vorliegende Studie wurden den Mikrogelen 200 ng SDF-1a und TGF-b3 (siehe Tabelle der Materialien) zugesetzt.
   HINWEIS: SDF-1a und TGF-b3 sind bioaktive Wirkstoffe, die für die Regeneration von Wachstumsplattengewebe relevant sind. SDF-1a fördert die Migration von mesenchymalen Stammzellen zur Defektstelle, und TGF-b3 dient als chondrogener Faktor, um die Differenzierung dieser Stammzellen entlang der chondrogenen Linie³¹ zu induzieren.
   HINWEIS: Mischen Sie das Chitosan erneut zwischen den Spritzen, um das therapeutische Mittel vollständig zu integrieren.
4. Bereiten Sie 100 mM Stammvernetzerlösung von Genipin (siehe Materialtabelle) in 100% Ethanol vor.
5. 100 μL der hergestellten Genipinlösung (Schritt 2.4.) in die Chitosan-haltige Spritze geben und erneut 30 s zwischen den Spritzen hin und her mischen.
6. Die Mischung aus der Spritze auf eine 35 mm Petrischale extrudieren, mit Paraffinfolie abdecken und über Nacht bei 37 °C in befeuchteter Atmosphäre inkubieren.
   HINWEIS: Die Lösung färbt sich dunkelblau, was darauf hinweist, dass die Vernetzungsreaktion zwischen Chitosan und Genipin stattgefunden hat, was zur Bildung von Chitosan-Mikrogel geführt hat.
7. Filtern Sie das hergestellte Chitosan-Mikrogel mit den folgenden Schritten.
   1. Brechen Sie das Hydrogel vorsichtig mit einem Spatel in kleinere Stücke.
      HINWEIS: Die Stücke sollten klein genug sein, um auf die Rückseite einer 10-ml-Spritze mit einem Durchmesser von ~ 1-2 cm übertragen zu werden.
   2. Legen Sie einen Filter der gewünschten Maschenweite in die Rückseite einer sauberen 10-ml-Spritze.
      HINWEIS: Der typische Größenbereich für Mikrogele liegt zwischen 50-200 μm.
   3. Die zerbrochenen Gelstücke in die mit dem Filter versehene Spritze geben und 6 ml ddH₂O hinzufügen.
      HINWEIS: Das Chitosan-Gel schwillt im wässrigen Medium deutlich an, so dass eine große Veränderung des Gelvolumens erwartet wird.
   4. Verbinden Sie die Spritze über einen Luer-Lock-Stecker mit einer anderen sauberen 10-ml-Spritze.
   5. Zwingen Sie das Gel + Wasser-Gemisch durch die Spritze mit dem Filter, um Mikrogele mit einem bestimmten maximalen Durchmesser zu erzeugen.
      1. Öffnen Sie nach der ersten Filtration die Rückseite der Spritze, die den Filter enthält, und extrudieren Sie die Mischung wieder in diese Spritze.
      2. Ersetzen Sie die Rückseite der Spritze und drücken Sie die Mischung erneut durch den Filter.
      3. Wiederholen Sie die Filtration 5-6x oder bis es wenig Widerstand durch den Filter gibt.
8. Spülen und reinigen Sie die gefilterten Mikrogele.
   1. Übertragen Sie die filtrierte Gelmischung auf ein konisches 50-ml-Rohr, bringen Sie das Gesamtvolumen mit ddH₂O auf 20 ml und wirbeln Sie dann die Mischung um, um eine homogene Dispersion zu gewährleisten.
   2. Die Mikrogele bei 100 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und die obere wässrige Phase dekantieren.
   3. Suspendieren Sie die Mikrogele in 10 ml 70% Ethanol, Wirbel und legen Sie sie für 1 Stunde unter UV-Licht, um zu sterilisieren.
   4. Zentrifugieren Sie die Mikrogele bei 1.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur, entsorgen Sie das Ethanol und spülen Sie es 3x mit ddH₂O ab.

3. Herstellung von Mikrogelen für In-vitro- oder In-vivo-Anwendungen

HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde die Knorpelregeneration bei Wachstumsplattenverletzungen in einem Rattenmodell untersucht. Weitere Informationen finden Sie unter Referenz³¹.

1. Resuspendiert die Mikrogelpellets 1:1 in ddH 2 O. Mikrogele können bis zu 1 Monat suspendiert in ddH₂O bei 4 °C gelagert werden. Wenn ein bioaktives Mittel verwendet wird, müssen die Mikrogele sofort verwendet werden.
2. Erstellen Sie die Verletzungsstelle im Tier nach einem zuvor veröffentlichten Bericht³⁰.
3. Spülen Sie die Verletzungsstelle mit Kochsalzlösung und halten Sie das Tier entweder unbehandelt (zur Kontrollstudie) oder injizieren Sie nur die Chitosan-Mikrogele oder die mit den bioaktiven Wirkstoffen beladenen Mikrogele (Schritt 3.2.).
4. Schließen Sie die Wunde im Tier und verabreichen Sie postoperative Analgetika³⁰.
5. An den Tagen 7 oder 28 nach der Operation, euthanasieren Sie die Ratte durch CO 2 Überdosis_, entfernen Sie die Gliedmaßen und führen Sie eine Histologie durch, um die Gewebereparatur an der Verletzungsstelle^{zu beurteilen 31}.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Herstellung von Chitosan-Mikrogelen beruht auf der Vernetzungsreaktion zwischen Genipin und Chitosan, an der insbesondere die Amine an den Chitosan-Polymerketten beteiligt sind. Im Gegensatz zu anderen Mikrogel-Herstellungstechniken erfordert diese Methode keine Emulsionen oder Lösungsmittelspülungen und kann schnell und einfach mit kostengünstigen Geräten durchgeführt werden. Ein charakteristischer Indikator für eine erfolgreiche Mikrogelherstellung ist der deutliche Farbwechsel von cremefarben zu...

Diskussion

Mikrogele wurden in den letzten Jahren aufgrund ihrer hohen Anwendbarkeit für verschiedene Zwecke, wie z.B. Arzneimittelabgabe oder Zellverkapselung, umfassend erforscht⁹. Die einfache Herstellung von Biomaterialkonstrukten im Mikromaßstab ist im Tissue Engineering von erheblicher Bedeutung, da sie es Forschern ermöglicht, Hydrogel-basierte Strategien in einer bestimmten Größe und Zeitskala zu entwickeln. Die meisten Methoden zur Herstellung von Chitosan-Mikrogelen erfordern jedoch teure Ger?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh