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Resumen

El presente protocolo describe un enfoque conveniente para integrar la captura óptica y la espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS) para manipular nanopartículas plasmónicas para la detección molecular sensible. Sin agentes agregadores, el láser de captura ensambla nanopartículas plasmónicas para mejorar las señales SERS de los analitos objetivo para mediciones espectroscópicas in situ .

Resumen

La espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS) permite la detección ultrasensible de moléculas de analito en diversas aplicaciones debido al campo eléctrico mejorado de las nanoestructuras metálicas. La agregación de nanopartículas de plata inducida por sal es el método más popular para generar sustratos activos SERS; sin embargo, está limitado por una escasa reproducibilidad, estabilidad y biocompatibilidad. El protocolo actual integra la manipulación óptica y la detección SERS para desarrollar una plataforma analítica eficiente para abordar esto. Un láser de captura de 1064 nm y un láser de sonda Raman de 532 nm se combinan en un microscopio para ensamblar nanopartículas de plata, que generan puntos calientes plasmónicos para mediciones SERS in situ en ambientes acuosos. Sin agentes agregadores, este conjunto dinámico de nanopartículas plasmónicas de plata permite una mejora de aproximadamente 50 veces de la señal de la molécula de analito. Además, proporciona control espacial y temporal para formar el ensamblaje activo SERS en una solución de nanopartículas de plata recubiertas de analito de tan solo 0,05 nM, lo que minimiza la perturbación potencial para el análisis in vivo . Por lo tanto, esta plataforma SERS integrada en trampeo óptico tiene un gran potencial para análisis moleculares eficientes, reproducibles y estables en líquidos, especialmente en entornos fisiológicos acuosos.

Introducción

La espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS) es una técnica analítica sensible para detectar directamente la estructura química de las moléculas diana en concentraciones ultrabajas o incluso a nivel de molécula única 1,2,3,4. La irradiación láser induce resonancia localizada de plasmones superficiales en nanoestructuras metálicas, utilizadas como sustratos SERS para amplificar las señales Raman de las moléculas diana. Los agregados de nanopartículas inducidos por sal son los sustratos SERS ampliamente utilizados, que experimentan espontáneamente movimiento browniano en líquidos de suspensión coloidal 5,6. El secado adicional permite mediciones SERS estables; Sin embargo, puede producirse una concentración de impurezas, lo que introduce ruido de fondo y causa daños irreversibles a las muestras biológicas7. Por lo tanto, es pertinente desarrollar agregaciones de nanopartículas sin sal, controlar su movimiento en solución y mejorar la biocompatibilidad manteniendo la eficiencia de medición.

Se ha adoptado el atrapamiento óptico para controlar diversos sustratos metálicos y facilitar las detecciones SERS 8,9,10,11,12,13,14. Una trampa óptica se genera enfocando firmemente un rayo láser para generar un campo de fuerza óptica, que atrae objetos pequeños a la región de mayor intensidad alrededor del foco15,16. Recientemente, las trampas ópticas se han utilizado para desarrollar plataformas de detección plasmónica reproducibles y sensibles para diversas aplicaciones, mostrando sus ventajas únicas en la localización y control de la posición de nanoestructuras metálicas activas SERS en soluciones 17,18,19,20,21,22,23,24 . El protocolo actual introduce un enfoque para combinar pinzas ópticas y espectromicroscopía Raman para ensamblar dinámicamente nanopartículas de plata (AgNP) y estabilizarlas contra el movimiento browniano en solución para mediciones SERS eficientes. En la región de ensamblaje de AgNP, la señal del éster de bis(succinimida) (DSNB) de 3,3'-ditiobis[6-ácido nitrobenzoico], moléculas de analito recubiertas en la superficie de AgNPs, puede mejorarse en aproximadamente 50 pliegues. Este enfoque es adecuado para analizar biomoléculas sensibles incompatibles con agentes de taponado químico25,26,27. Además, proporciona control espacial y temporal para generar el ensamblaje AgNP activo de SERS. Esto permite la detección in situ en ambientes acuosos, lo que podría disminuir el uso de AgNPs y minimizar la perturbación para el análisis in vivo 28,29,30. Además, el conjunto AgNP inducido por atrapamiento óptico es estable, reproducible y reversible31,32. Por lo tanto, es una plataforma prometedora para detectar moléculas de analito en soluciones y en condiciones fisiológicas donde la agregación inducida por sal no es aplicable.

En el presente estudio, un láser de captura de 1064 nm, un módulo de detección de fuerza y una fuente de iluminación de campo claro se integran en el sistema de microscopía de pinza óptica para la manipulación óptica y la visualización de partículas. Un láser de sonda Raman de 532 nm también se incorporó al microscopio y se alineó con el láser de captura en la cámara de muestra. Para la adquisición espectral, se recogió luz retrodispersada y se redirigió a un espectrómetro (Figura 1).

Protocolo

1. Configuración óptica

  1. Dirija un rayo láser de 532 nm (fuente de excitación Raman) en el puerto flexible del microscopio de pinza óptica (consulte la Tabla de materiales).
  2. Alinee el rayo láser de 532 nm en las vías estéreo de doble capa del microscopio pinza óptica con un espejo dicroico de paso largo de 750 nm para combinar con los rayos láser de captura originales para enfocar la cámara de muestra.
  3. Recoja la luz retrodispersada de la cámara de muestras utilizando un espejo dicroico de paso largo de 750 nm y rediríjala a un espectrómetro que contenga una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) refrigerada por nitrógeno líquido (consulte la Tabla de materiales). Coloque un filtro de muesca de 532 nm delante de la ranura de entrada del espectrómetro antes de la adquisición espectral.
    NOTA: Se debe usar protección para los ojos cuando se enciende el láser, y el rayo láser debe estar contenido dentro de un área segura.

2. Fabricación de AgNPs

  1. Calentar 50 ml de solución acuosa de AgNO3 a 1 mM en un matraz de fondo redondo mientras hierve.
  2. Añadir 1,0 ml de solución de citrato trisódico 0,1 M gota a gota en la solución acuosa hervida de AgNO3 .
  3. Mantenga la mezcla hirviendo durante 16 minutos bajo agitación constante.
  4. Enfríe la mezcla a temperatura ambiente. Se observa color amarillento.
  5. Centrifugar los coloides AgNP a 2000 × g durante 5 min a temperatura ambiente y luego retirar el sobrenadante con una pipeta.
  6. Resuspender los coloides AgNP con 1 mL de agua desionizada (resistividad de 18,2 MΩ cm).
  7. Repita los pasos 2.5 y 2.6 tres veces para eliminar el agente residual reductor.
  8. Caracterizar la distribución de tamaños de las AgNPs utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM) y dispersión dinámica de luz (DLS)33 para confirmar la uniformidad de las AgNPs (Figura 2). La concentración de AgNP fue estimada en 0,1 nM por absorbancia UV34.
    NOTAS: Debido a la baja concentración, la solución madre de AgNP se puede mantener sin agruparse durante 2-3 semanas. No se requieren agentes estabilizadores. Si se observó un precipitado en la solución madre de AgNP, se preparó una nueva solución de AgNP siguiendo el protocolo anterior.

3. Interacción de la molécula de analito DSNB y AgNP

  1. Añadir 200 μL de 2 mM DSNB (ver Tabla de materiales) a 1 ml de coloide AgNP e incubar a temperatura ambiente durante 3 h para recubrir una capa de DSNB en la superficie de AgNP mediante la formación del enlace Ag-S entre AgNP y DSNB35. En la Figura 3 se muestra una representación esquemática de esta interacción.
  2. Centrifugar la AgNP a 2.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante.
  3. Resuspender el AgNP-DSNB con 1 ml de agua desionizada.
  4. Repita los pasos 3.2 y 3.3 tres veces para eliminar el exceso de DSNB.
  5. Registre los espectros UV-visibles del coloide AgNP y la solución AgNP-DSNB.
    NOTA: Estos espectros muestran un cambio máximo de absorción de aproximadamente 420 nm a 450 nm, lo que indica el recubrimiento exitoso de DSNB en la superficie de AgNP (Figura 3).

4. Preparación de la cámara de muestras y generación del conjunto AgNP para la medición SERS

  1. Limpie el portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos con agua y etanol.
  2. Fije la cinta del marco (0,25 mm de grosor, consulte Tabla de materiales) a la corredera de vidrio para crear una cámara (1,0 cm de largo × 1,0 cm de ancho × 0,25 mm de alto).
  3. Agregue unas gotas de la solución AgNP-DSNB (alrededor de 25 μL) en el marco.
  4. Coloque el cubreobjetos en la cinta del marco y séllelo (Figura 4).
  5. Agregue nitrógeno líquido al recipiente de la cámara CCD refrigerada por nitrógeno líquido hasta que la temperatura alcance -120 °C.
  6. Bloquee la trayectoria del haz de la sonda Raman con una pantalla de seguridad láser magnética (consulte Tabla de materiales) y, a continuación, encienda el láser de fuente de excitación Raman de 532 nm.
  7. Fije la cámara de muestras con la solución AgNP-DSNB en el soporte de la cámara. Agregue agua al objetivo sumergido en agua (aumento de 60x con una apertura numérica A de 1.2) como se muestra en la Figura 1. A continuación, coloque el soporte de la cámara inmediatamente sobre el microescenario por encima del objetivo.
  8. Coloque el aceite de inmersión sobre el cubreobjetos y coloque el condensador sumergido en aceite para visualizar las partículas en la cámara del microscopio.
  9. Ajuste la posición Z del objetivo girando la perilla del microscopio hasta que el haz de sonda Raman de 532 nm se enfoque en la superficie de vidrio inferior de la cámara, mostrando una mancha blanca en la cámara del microscopio (Figura 5).
    1. Ajuste las posiciones X e Y de la microetapa para mover la cámara y colocar la región central de la cámara en el punto blanco. Abra el software de control de pinzas ópticas (consulte Tabla de materiales) y utilice el control de palanca universal equipado para mover el láser de captura de 1064 nm (indicado por un círculo rojo en el sistema de pinzas ópticas) para que se superponga con el punto blanco (Figura 5).
    2. A continuación, ajuste la perilla del microscopio para mover la posición Z del objetivo hacia arriba.
      NOTA: La desaparición de la mancha blanca en la imagen de la cámara del microscopio indica que el haz de sonda Raman de 532 nm está enfocado dentro de la cámara.
  10. Encienda el láser de captura de 1064 nm para atraer AgNP en la cámara de muestras y crear un conjunto de AgNP plasmónico.
    NOTA: La recolección de AgNPs da como resultado una mancha oscura en la cámara de muestra (Figura 6B).
    1. Baje el rayo láser de captura para evitar el sobrecalentamiento o la formación de burbujas cuando sea necesario.
      NOTA: Aumente la potencia del láser de captura y el tiempo de irradiación si no hay formación aparente del conjunto AgNP.
  11. Ajuste la posición de la microetapa de la muestra para colocar la mancha oscura del conjunto plasmónico AgNP bajo el foco del haz de sonda Raman de 532 nm para mediciones espectroscópicas.
  12. Coloque los filtros de densidad neutra (ND) frente a la salida láser Raman de 532 nm para ajustar la potencia a 10 mW. Introduzca el tiempo de adquisición (10 s para el presente estudio, Figura 6) en el panel de configuración del software de espectro (consulte la Tabla de materiales) y haga clic en el botón Adquirir para iniciar la adquisición espectral.
    NOTA: Esto genera el espectro SERS de las moléculas de analito (DSNB en el resultado representativo y Figura 6).

Resultados

Como prueba de concepto, DSNB fue elegido como la molécula de analito y recubierto en la superficie de AgNPs. Los espectros SERS típicos de DSNB mejorados por el ensamblaje plasmónico de AgNP y AgNP disperso se muestran en la Figura 6. Sin el láser de captura, los AgNP dispersos en la cámara de muestra generaron un espectro negro (Figura 6A) tras la excitación por el láser de sonda Raman. Se observó una señal SERS débil y amplia a aproximadamente 1380-1450 cm-1, el pico característico de DSNB de su tramo simétrico NO2, que es consistente con los relatos de la literatura35,36. Dado que los AgNPs dispersos estaban bajo movimiento browniano, las uniones entre partículas eran grandes e inestables, como se ilustra en la Figura 6C. Por lo tanto, la amplificación de la señal SERS de DSNB fue baja para los AgNP dispersos.

Las AgNP se reúnen para formar un conjunto plasmónico de AgNP cuando el láser de captura está encendido. Aumentar la potencia y extender el tiempo de irradiación del láser de captura podría atraer más AgNPs y generar un punto oscuro, como se muestra en la Figura 6B. Aquí, aplicamos una potencia láser de atrapamiento de 700 mM y un tiempo de irradiación de 20 s para crear un ensamblaje plasmónico de AgNP en una solución AgNP recubierta con DSNB de 0.05 nM en un lugar y momento designados. El espectro SERS de DSNB se obtuvo en la región del ensamblaje plasmónico AgNP (Figura 6A, rojo). La fuerte banda Raman a 930 cm-1 se asigna a la vibración de tijera nitro, y las bandas grandes a 1078 cm-1, 1152 cm-1 y 1191 cm-1 probablemente corresponden al estiramiento de succinimidyl N-C-O que se superpone con los modos de anillo aromático de DSNB 35,37. Las bandas de características a 1385 cm-1 y 1444 cm-1 surgen del tramo nitro simétrico de DSNB y están significativamente mejoradas y ligeramente desplazadas debido a la reacción con la superficie de AgNP35,37. Sobre la base de las huellas dactilares SERS previamente informadas de DSNB35,36,37, la banda a 1579 cm-1 se asignó al modo de anillo aromático de DSNB. Las intensidades totales de DSNB en el ensamblaje plasmónico de AgNP fueron mayores que las del AgNP disperso. Teniendo en cuenta la intensidad del pico característico a 1444 cm-1, el conjunto plasmónico AgNP puede proporcionar una mejora de aproximadamente 50 veces de la señal SERS de DSNB en comparación con la de la AgNP dispersa. Como se muestra en la Figura 7, los espectros SERS de DSNB se registraron repetidamente (20 veces) para el ensamblaje AgNP en el experimento, demostrando características vibratorias idénticas. Las intensidades de los picos característicos de DSNB a 1152 cm−1, 1444 cm−1 y 1579 cm−1 a través de estos 20 espectros SERS se trazaron como histogramas con desviaciones estándar relativas (RSD) de 6.88%, 6.59% y 5.48%, respectivamente. Esto verificó aún más la reproducibilidad y estabilidad. Por lo tanto, este enfoque es confiable para manipular nanopartículas plasmónicas y la detección SERS de moléculas de analito en solución.

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Figura 1: Representación esquemática de la plataforma espectroscópica Raman acoplada a pinzas ópticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Preparación de AgNP para la medición de SERS. (A) Imagen SEM de AgNP. (B) Distribución por tamaño de AgNP por DLS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Interacción de AgNP y DSNB. (A) Esquema del recubrimiento de DSNB en la superficie de AgNP. (B) espectros UV-visibles de AgNP y AgNP-DSNB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Esquema de preparación de la cámara de muestra. (A) Proceso de preparación de la cámara de muestra. (B) Cámara de muestras preparada. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Superposición de posición del láser Raman de 532 nm y del láser de captura de 1064 nm. (A) Posición del láser Raman de 532 nm indicada por punto blanco. (B) Posición del láser de captura de 1064 nm indicada por un círculo rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Espectros SERS típicos de las moléculas de analito mejoradas por el ensamblaje plasmónico de AgNP. (A) Espectros SERS de DSNB en el ensamblaje plasmónico de AgNP (rojo) y el AgNP disperso (negro). (B) El ensamblaje plasmónico de AgNP cuando el láser de captura está encendido muestra un punto oscuro bajo visualización microscópica. (C) El AgNP disperso cuando el láser de captura está apagado. (D) Ilustración del mecanismo de formación del ensamblaje AgNP. (E) Intensidad SERS dependiente de la concentración en ausencia del láser de captura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Reproducibilidad de la señal SERS de DSNB. (A) 20 espectros SERS de DSNB en el ensamblaje plasmónico de AgNP registrados repetidamente en el experimento. (B) Histogramas de las intensidades de los picos característicos de DSNB a 1152 cm-1 (RSD = 6,88%), 1444 cm-1 (RSD = 6,59%) y 1579 cm-1 (RSD = 5,48%). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Ensamblaje AgNP generado bajo diferentes parámetros experimentales. (A) Diferente potencia láser de captura; tiempo de irradiación 20 s y concentración de AgNP 0,05 nM. B) Diferentes tiempos de irradiación; Potencia láser de captura 700 mW y concentración de AgNP 0,05 nM. (C) Diferente concentración de AgNP; tiempo de irradiación 20 s y potencia láser de atrapamiento 700 mW. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Las imágenes de la cámara del microscopio del ensamblaje AgNP en series temporales cuando se apagó el láser de captura. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El presente estudio reporta una plataforma analítica que combina trampeo óptico y detección SERS para caracterizaciones moleculares in situ . Un haz de sonda Raman de 532 nm se combinó con un rayo láser de captura de 1064 nm a través de vías estéreo de doble capa para combinar el enfoque y la recolección de mediciones espectroscópicas adicionales en geometría de retrodispersión. El rayo láser de captura ensambló AgNPs para formar puntos calientes plasmónicos, seguido de la excitación del rayo láser de sonda Raman para generar la señal SERS de las moléculas de analito en solución. Como prueba de concepto, se demostró la detección de DSNB, que se recubrió en la superficie de AgNPs. En la región de ensamblaje de AgNP controlada por el rayo láser de captura, se logró una mejora de aproximadamente 50 veces en la señal de DSNB en comparación con los AgNP dispersos circundantes. Se obtuvo de forma reproducible una amplificación similar de alta señal de moléculas de analito en las mediciones SERS en fase de solución en la plataforma presentada.

El paso crítico que afecta la amplificación de la señal SERS es formar un conjunto AgNP inducido por atrapamiento óptico. La señal SERS de las moléculas de analito se puede optimizar ajustando parámetros experimentales como la potencia del láser de captura, el tiempo de irradiación y la concentración de AgNP. Como se muestra en la Figura 8, el uso de una mayor potencia láser de captura puede aumentar la eficiencia de la formación del ensamblaje AgNP. Los ensamblajes de AgNP reproducibles se obtuvieron aumentando la potencia del láser de captura de 450 mW a 700 mW. Sin embargo, una potencia láser de atrapamiento superior a 950 mW puede inducir sobrecalentamiento y generación de burbujas38. Por lo tanto, se recomienda una potencia láser de captura moderada para crear un conjunto dinámico de AgNP. Análogamente, un tiempo de irradiación más largo es útil para promover la formación de ensamblajes AgNP. La Figura 8B muestra que se formó un conjunto de AgNP esférico claro cuando el tiempo de irradiación aumentó de 5 a 20 s. Sin embargo, el conjunto AgNP se distorsionó después de la irradiación de 60 s. Además, la formación del conjunto AgNP se aceleró a una concentración de AgNP más alta, de 0,01 nM a 0,05 nM, mientras que se sobrecalentó rápidamente a 0,25 nM, como se muestra en la Figura 8C. Si no hay una formación aparente de ensamblaje de AgNP, se recomienda aumentar la potencia del láser de captura y el tiempo de irradiación. Tras la generación de un conjunto estable de AgNP, el láser de captura debe reducirse para evitar posibles daños térmicos.

La actividad SERS del conjunto de AgNP inducido por trampeo óptico se atribuyó a un aumento en la concentración local de AgNP en la región de irradiación láser de atrapamiento, que es el punto oscuro en la Figura 6B. En la solución de AgNP fluídica, la trampa óptica puede atraer continuamente AgNPs para acumular y formar puntos calientes plasmónicos en un espacio confinado en las uniones de interpartículas. Esto produce un campo eléctrico mejorado que mejora el efecto SERS. Se verificó aún más por la señal SERS más fuerte obtenida a una concentración de AgNP más alta (1.00 nM) en comparación con la señal SERS más débil adquirida a una concentración de AgNP más baja (0.05 nM) sin el láser de captura, como se muestra en la Figura 6E.

Además, el control de posición del ensamblaje plasmónico de AgNP en solución, contra el movimiento browniano, mediante captura óptica ha mejorado significativamente la eficiencia y la estabilidad de las mediciones SERS. La detección de alto rendimiento se puede realizar cuando se conecta al sistema microfluídico. En comparación con la agregación tradicional inducida por sal de nanopartículas para generar sustratos activos SERS, nuestra plataforma permite la formación dinámica de ensamblajes plasmónicos de AgNP, en la ubicación y momento diseñados, con alta flexibilidad26,28. Además, funciona eficientemente a concentraciones nanomolares de AgNP y permite la manipulación espacio-temporal de puntos calientes activos SERS para mediciones espectroscópicas in situ en soluciones. Este conjunto dinámico de AgNP se desmontó gradualmente en unos pocos minutos cuando se apagó el láser de captura. Sin el láser de captura, el conjunto AgNP casi desapareció en 20 minutos, como se muestra en la Figura suplementaria 1. Esto puede minimizar la influencia en el sistema de detección y exhibe un gran potencial para diversas aplicaciones biológicas, especialmente la detección de biomoléculas (ADN, ARN y proteína) en condiciones fisiológicas e in vivo. Sin embargo, este ensamblaje dinámico de AgNP proporciona un factor de mejora más pequeño que los agregados de AgNP inducidos por sal2 y, por lo tanto, se requieren más modificaciones y desarrollos.

En conclusión, la integración de la captura óptica y la detección SERS proporciona un método conveniente para controlar las nanopartículas plasmónicas y lograr una mejora de la señal SERS reproducible para detectar moléculas de analito en soluciones con alta eficiencia, estabilidad y biocompatibilidad.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Reconocemos el apoyo financiero de la Comisión de Ciencia, Tecnología e Innovación de la Municipalidad de Shenzhen (No. JCYJ20180306174930894), la Oficina Municipal de Ciencia y Tecnología de Zhongshan (2020AG003) y el Consejo de Subvenciones de Investigación de Hong Kong (Proyecto 26303018). También reconocemos al Prof. Chi-Ming Che y su apoyo financiero del "Laboratorio de Química Sintética y Biología Química" bajo el Programa Health@InnoHK lanzado por la Comisión de Innovación y Tecnología del Gobierno de Hong Kong Región Administrativa Especial de la República Popular China.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1064 nm trapping laserIPG Photonics, United States1064 nm CW Yb fiber laser, 10W
3,3'-Dithiobis[6-nitrobenzoic acid] bis(succinimide) ester Biosynth CarbosynthFD15467
532 nm Raman excitation sourceCNI, ChinaMLL-III-532
Bluelake softwareLUMICKS, Netherlandsversion 1.6.12optical tweezer control software
Frame tapeThermo Fisher Scientific, IncAB-0576
Immersion oilCargille Laboratories, Inc16482
Liquid nitrogen-cooled charge-coupled device (CCD) cameraTeledyn Princeton Instrument, United States400B eXcelon
Long-pass dichroic mirrorAHF, GermanyF48-801
Magnetic laser safety screenThorLabsTPSM2
Optical tweezer microscopeLUMICKS, Netherlandsm-trap
Silver nitrateSigma-Aldrich China, Inc.S8157
SpectrometerTeledyn Princeton Instrument, United StatesIsoPlane SCT-320
Trisodium citrateSigma-Aldrich China, Inc.S4641
WinSpec softwareTeledyn Princeton Instrument, United Statesversion 2.6.24.0spectrum software

Referencias

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