Настоящий протокол описывает удобный подход к интеграции оптического улавливания и поверхностно-расширенной рамановской спектроскопии (SERS) для манипулирования плазмонными наночастицами для чувствительного молекулярного обнаружения. Без агрегирующих агентов улавливающий лазер собирает плазмонные наночастицы для усиления сигналов SERS целевых аналитов для спектроскопических измерений in situ .
Поверхностно-расширенная рамановская спектроскопия (SERS) позволяет сверхчувствительно обнаруживать молекулы анализируемого вещества в различных приложениях благодаря усиленному электрическому полю металлических наноструктур. Солеобразная агрегация наночастиц серебра является наиболее популярным методом генерации SERS-активных подложек; однако он ограничен плохой воспроизводимостью, стабильностью и биосовместимостью. Настоящий протокол объединяет оптические манипуляции и обнаружение SERS для разработки эффективной аналитической платформы для решения этой проблемы. Улавливающий лазер 1064 нм и рамановский зондовый лазер 532 нм объединены в микроскоп для сборки наночастиц серебра, которые генерируют плазмонные горячие точки для измерений SERS in situ в водных средах. Без агрегирующих агентов эта динамическая сборка плазмонных наночастиц серебра обеспечивает примерно 50-кратное усиление сигнала молекулы анализируемого вещества. Кроме того, он обеспечивает пространственное и временное управление для формирования SERS-активной сборки всего в 0,05 нМ раствора наночастиц серебра с аналитическим покрытием, что сводит к минимуму потенциальное возмущение для анализа in vivo . Следовательно, эта оптическая платформа SERS, интегрированная в улавливание, обладает большим потенциалом для эффективного, воспроизводимого и стабильного молекулярного анализа в жидкостях, особенно в водных физиологических средах.
Поверхностно-расширенная рамановская спектроскопия (SERS) является чувствительным аналитическим методом для непосредственного обнаружения химической структуры молекул-мишеней в сверхнизких концентрациях или даже на уровне одноймолекулы 1,2,3,4. Лазерное облучение индуцирует локализованный поверхностный плазмонный резонанс в металлических наноструктурах, используемых в качестве подложек SERS для усиления рамановских сигналов молекул-мишеней. Солеобразные наночастицы являются широко используемыми субстратами SERS, которые спонтанно подвергаются броуновскому движению в коллоидных суспензионных жидкостях 5,6. Дальнейшая сушка позволяет проводить стабильные измерения SERS; однако может возникнуть концентрация примесей, которая создает фоновый шум и наносит необратимый ущерб биологическим образцам7. Следовательно, целесообразно разрабатывать бессолевые агрегации наночастиц, контролировать их движение в растворе и улучшать биосовместимость при сохранении эффективности измерений.
Оптический захват был принят для контроля различных металлических подложек и облегчения обнаружения SERS 8,9,10,11,12,13,14. Оптическая ловушка генерируется путем плотной фокусировки лазерного луча для создания оптического силового поля, которое притягивает небольшие объекты в область наибольшей интенсивности вокруг фокуса15,16. В последнее время оптические ловушки используются для разработки воспроизводимых и чувствительных плазмонных сенсорных платформ для различных применений, демонстрируя свои уникальные преимущества в обнаружении и контроле положения SERS-активных металлических наноструктур в решениях 17,18,19,20,21,22,23,24 . Настоящий протокол вводит подход к объединению оптического пинцета и рамановской спектромископии для динамической сборки наночастиц серебра (AgNP) и стабилизации их против броуновского движения в решении для эффективных измерений SERS. В области сборки AgNP сигнал 3,3'-дитиобиса[6-нитробензойной кислоты] бис(сукцинимидного) эфира (DSNB), молекул анализируемого вещества, покрытых на поверхности AgNP, может быть усилен примерно в 50 раз. Этот подход подходит для анализа чувствительных биомолекул, несовместимых с химическими укупорочными агентами 25,26,27. Кроме того, он обеспечивает пространственное и временное управление для создания SERS-активной сборки AgNP. Это позволяет обнаруживать in situ в водных средах, что может снизить использование AgNP и свести к минимуму возмущения для анализа in vivo 28,29,30. Кроме того, сборка AgNP, индуцированная оптическим улавливанием, стабильна, воспроизводима и обратима31,32. Следовательно, это перспективная платформа для обнаружения молекул анализируемого вещества в растворах и в физиологических условиях, когда агрегация, вызванная солью, неприменима.
В настоящем исследовании улавливающий лазер 1064 нм, модуль обнаружения силы и источник яркого освещения интегрированы в систему оптической микроскопии пинцета для оптического манипулирования и визуализации частиц. 532-нм рамановский зондовый лазер также был включен в микроскоп и выровнен с улавливающим лазером в камере образца. Для получения спектра обратно рассеянный свет собирали и перенаправляли в спектрометр (рисунок 1).
1. Оптическая настройка
2. Изготовление AgNP
3. Взаимодействие молекулы анализируемого DSNB и AgNP
4. Подготовка пробовой камеры и генерация агрегата AgNP для измерения SERS
В качестве доказательства концепции DSNB был выбран в качестве молекулы анализируемого вещества и покрыт на поверхность AgNP. Типичные спектры SERS DSNB, усиленные плазмонной сборкой AgNP и дисперсными AgNP, показаны на рисунке 6. Без улавливающего лазера дисперсные AgNP в камере образца генерировали черный спектр (рисунок 6A) при возбуждении рамановским зондовым лазером. Слабый и широкий сигнал SERS наблюдался примерно на уровне 1380-1450 см-1, характерный пик DSNB от его симметричного растяжения NO2, что согласуется с литературными сообщениями35,36. Поскольку дисперсные AgNP находились под броуновским движением, межчастичные соединения были большими и нестабильными, как показано на рисунке 6C. Таким образом, усиление сигнала SERS DSNB было низким для дисперсных AgNP.
AgNP собираются для формирования плазмонной сборки AgNP при включении улавливающего лазера. Увеличение мощности и увеличение времени облучения улавливающего лазера может привлечь больше AgNP и создать темное пятно, как показано на рисунке 6B. Здесь мы применили улавливающий лазер мощностью 700 мМ и временем облучения 20 с для создания плазмонной сборки AgNP в растворе AgNP с покрытием DSNB 0,05 нМ в указанном месте и моменте. Спектр SERS DSNB был получен в области плазмонной сборки AgNP (рисунок 6A, красный). Сильная рамановская полоса при 930 см-1 отнесена к вибрации нитронареза, а большие полосы при 1078 см-1, 1152 см-1 и 1191 см-1, вероятно, соответствуют сукцинимидилу N-C-O, перекрывающемуся с ароматическими кольцевыми режимами DSNB35,37. Полосы признаков при 1385 см-1 и 1444 см-1 возникают из симметричного нитрорастяжения DSNB и значительно усиливаются и слегка смещаются из-за реакции с поверхностью AgNP35,37. Основываясь на ранее сообщенных отпечатках SERS DSNB 35,36,37, полоса на 1579 см-1 была отнесена к ароматическому кольцевому режиму DSNB. Общая интенсивность DSNB в плазмонной сборке AgNP была выше, чем у дисперсного AgNP. Учитывая интенсивность характеристического пика при 1444 см-1, плазмонная сборка AgNP может обеспечить примерно 50-кратное усиление сигнала SERS DSNB по сравнению с дисперсным AgNP. Как показано на рисунке 7, спектры SERS DSNB регистрировались многократно (20 раз) для сборки AgNP в эксперименте, демонстрируя идентичные вибрационные характеристики. Интенсивности характерных пиков DSNB при 1152 см−1, 1444 см−1 и 1579 см−1 по этим 20 спектрам SERS были построены в виде гистограмм с относительными стандартными отклонениями (RSD) 6,88%, 6,59% и 5,48% соответственно. Это еще больше подтвердило воспроизводимость и стабильность. Следовательно, этот подход надежен для манипулирования плазмонными наночастицами и обнаружения SERS молекул анализируемого вещества в растворе.
Рисунок 1: Схематическое изображение рамановской спектроскопической платформы, связанной с оптическим пинцетом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подготовка AgNP к измерению SERS. (A) SEM изображение AgNP. B) Распределение agNP по размерам по DLS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Взаимодействие AgNP и DSNB. (A) Схема покрытия DSNB на поверхности AgNP. (B) УФ-видимые спектры AgNP и AgNP-DSNB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Схема подготовки пробоотборной камеры. (А) Процесс подготовки пробоотборной камеры. (B) Подготовленная пробоотборная камера. Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Положение перекрытия 532 нм рамановского лазера и 1064 нм улавливающего лазера. (A) Положение 532 нм рамановского лазера обозначается белым пятном. (B) Положение 1064 нм улавливающего лазера, обозначенное красным кругом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Типичные спектры SERS молекул анализируемого вещества, усиленные плазмонной сборкой AgNP. (A) SERS спектры DSNB на плазмонной сборке AgNP (красный) и дисперсном AgNP (черный). (B) Плазмонная сборка AgNP при включении улавливающего лазера показывает темное пятно при микроскопической визуализации. (C) Дисперсный AgNP при выключении улавливающего лазера. (D) Иллюстрация механизма формирования сборки AgNP. (E) Концентрационно-зависимая интенсивность СЕРС в отсутствие улавливающего лазера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Воспроизводимость сигнала SERS DSNB. (A) 20 спектров SERS DSNB на плазмонной сборке AgNP, зарегистрированной повторно в эксперименте. (B) Гистограммы интенсивности характерных пиков DSNB при 1152 см-1 (RSD = 6,88%), 1444 см-1 (RSD = 6,59%) и 1579 см-1 (RSD = 5,48%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Сборка AgNP, генерируемая при различных экспериментальных параметрах. (A) Различная мощность улавливающего лазера; время облучения 20 с и концентрация AgNP 0,05 нМ. B) различное время облучения; мощность улавливающего лазера 700 мВт и концентрация AgNP 0,05 нМ. с) различная концентрация AgNP; время облучения 20 с и улавливающего лазера мощностью 700 мВт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Изображения камеры микроскопа сборки AgNP во временных рядах, когда улавливающий лазер был выключен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
В настоящем исследовании сообщается об аналитической платформе, которая сочетает в себе оптический захват и обнаружение SERS для молекулярных характеристик in situ . 532-нм рамановский зондовый луч был объединен с 1064-нм улавливающим лазерным лучом через стерео двухслойные пути для объединения фокусировки и сбора для дополнительных спектроскопических измерений в геометрии обратного рассеяния. Улавливающий лазерный луч собирал AgNP для формирования плазмонных горячих точек с последующим возбуждением рамановского зондового лазерного луча для генерации сигнала SERS молекул анализируемого вещества в растворе. В качестве доказательства концепции было продемонстрировано обнаружение DSNB, которое было покрыто на поверхности AgNP. В области сборки AgNP, контролируемой улавливающим лазерным лучом, было достигнуто примерно 50-кратное улучшение сигнала DSNB по сравнению с окружающими дисперсными AgNP. Получено аналогичное высокосигнальное усиление молекул анализируемого вещества в измерениях растворно-фазы SERS на представленной платформе.
Критическим шагом, влияющим на усиление сигнала SERS, является формирование сборки AgNP, индуцированной оптическим улавливанием. Сигнал SERS молекул анализируемого вещества может быть оптимизирован путем тонкой настройки экспериментальных параметров, таких как мощность улавливающего лазера, время облучения и концентрация AgNP. Как показано на рисунке 8, использование более высокой мощности улавливающего лазера может повысить эффективность формирования сборки AgNP. Воспроизводимые сборки AgNP были получены путем увеличения мощности улавливающего лазера с 450 мВт до 700 мВт. Однако мощность улавливающего лазера выше 950 мВт может вызвать перегрев и генерацию пузырьков38. Таким образом, для создания динамической сборки AgNP рекомендуется лазер умеренной улавливающей мощности. Аналогичным образом, более длительное время облучения полезно для содействия формированию сборок AgNP. На рисунке 8В показано, что четкий сферический агрегат AgNP образовался при увеличении времени облучения с 5-20 с. Однако сборка AgNP была искажена после облучения 60 с. Кроме того, формирование сборки AgNP ускорялось при более высокой концентрации AgNP, с 0,01 нМ до 0,05 нМ, при этом она быстро перегревалась при 0,25 нМ, как показано на рисунке 8C. Если нет видимого образования сборки AgNP, рекомендуется увеличить мощность улавливающего лазера и время облучения. После создания стабильного агрегата AgNP улавливающий лазер должен быть отключен, чтобы избежать потенциального теплового повреждения.
Активность SERS в сборке AgNP, индуцированной оптическим улавливанием, объяснялась увеличением локальной концентрации AgNP в области лазерного облучения, которая является темным пятном на рисунке 6B. В текучем растворе AgNP оптическая ловушка может непрерывно притягивать AgNP для накопления и формирования плазмонных горячих точек в ограниченном пространстве в межчастичных соединениях. Это дает усиленное электрическое поле, которое усиливает эффект SERS. Это было дополнительно подтверждено более сильным сигналом SERS, полученным при более высокой концентрации AgNP (1,00 нМ) по сравнению с более слабым сигналом SERS, полученным при более низкой концентрации AgNP (0,05 нМ) без улавливающего лазера, как показано на рисунке 6E.
Кроме того, контроль положения плазмонного агрегата AgNP в растворе против броуновского движения с помощью оптического улавливания значительно повысил эффективность и стабильность измерений SERS. Высокопроизводительное зондирование может проводиться при подключении к микрофлюидной системе. По сравнению с традиционной солевой агрегацией наночастиц для генерации SERS-активных субстратов, наша платформа позволяет динамически формировать плазмонные сборки AgNP в заданном месте и моменте с высокой гибкостью26,28. Кроме того, он эффективно работает при наномолярных концентрациях AgNP и позволяет пространственно-временные манипуляции с активными горячими точками SERS для спектроскопических измерений in situ в растворах. Эта динамическая сборка AgNP постепенно разбиралась в течение нескольких минут, когда улавливающий лазер был выключен. Без улавливающего лазера сборка AgNP почти исчезла за 20 минут, как показано на дополнительном рисунке 1. Это может минимизировать влияние на систему обнаружения и демонстрирует большой потенциал для различных биоприложений, особенно для обнаружения биомолекул (ДНК, РНК и белка) в физиологических и in vivo условиях. Однако эта динамическая сборка AgNP обеспечивает меньший коэффициент усиления, чем агрегаты AgNP2, индуцированные солью, и, следовательно, требуется дальнейшая модификация и развитие.
В заключение, интеграция оптического улавливания и обнаружения SERS обеспечивает удобный метод управления плазмонными наночастицами и достижения воспроизводимого усиления сигнала SERS для обнаружения молекул анализируемого вещества в растворах с высокой эффективностью, стабильностью и биосовместимостью.
Авторам нечего раскрывать.
Мы признаем финансовую поддержку со стороны Комиссии по науке, технике и инновациям муниципалитета Шэньчжэня (No. JCYJ20180306174930894), Муниципальное бюро науки и техники Чжуншань (2020AG003) и Совет по исследовательским грантам Гонконга (проект 26303018). Мы также выражаем признательность профессору Чи-Мин Че и его финансовой поддержке со стороны «Лаборатории синтетической химии и химической биологии» в рамках программы Health@InnoHK, запущенной Комиссией по инновациям и технологиям правительства Специального административного района Гонконг Китайской Народной Республики.
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
1064 nm trapping laser | IPG Photonics, United States | 1064 nm CW Yb fiber laser, 10W | ||
3,3'-Dithiobis[6-nitrobenzoic acid] bis(succinimide) ester | Biosynth Carbosynth | FD15467 | ||
532 nm Raman excitation source | CNI, China | MLL-III-532 | ||
Bluelake software | LUMICKS, Netherlands | version 1.6.12 | optical tweezer control software | |
Frame tape | Thermo Fisher Scientific, Inc | AB-0576 | ||
Immersion oil | Cargille Laboratories, Inc | 16482 | ||
Liquid nitrogen-cooled charge-coupled device (CCD) camera | Teledyn Princeton Instrument, United States | 400B eXcelon | ||
Long-pass dichroic mirror | AHF, Germany | F48-801 | ||
Magnetic laser safety screen | ThorLabs | TPSM2 | ||
Optical tweezer microscope | LUMICKS, Netherlands | m-trap | ||
Silver nitrate | Sigma-Aldrich China, Inc. | S8157 | ||
Spectrometer | Teledyn Princeton Instrument, United States | IsoPlane SCT-320 | ||
Trisodium citrate | Sigma-Aldrich China, Inc. | S4641 | ||
WinSpec software | Teledyn Princeton Instrument, United States | version 2.6.24.0 | spectrum software |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены