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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe en detalle la preparación de complejos nucleosómicos utilizando dos métodos de preparación de muestras para congelar rejillas TEM.

Resumen

La reparación del ADN en el contexto de la cromatina es poco conocida. Los estudios bioquímicos que utilizan partículas de núcleo de nucleosomas, la unidad de repetición fundamental de la cromatina, muestran que la mayoría de las enzimas de reparación del ADN eliminan el daño del ADN a tasas reducidas en comparación con el ADN libre. Los detalles moleculares sobre cómo las enzimas de reparación por escisión de bases (BER) reconocen y eliminan el daño del ADN en los nucleosomas no se han dilucidado. Sin embargo, los datos bioquímicos de BER de sustratos nucleosómicos sugieren que el nucleosoma presenta diferentes barreras estructurales dependiendo de la ubicación de la lesión de ADN y la enzima. Esto indica que los mecanismos empleados por estas enzimas para eliminar el daño del ADN en el ADN libre pueden ser diferentes a los empleados en los nucleosomas. Dado que la mayoría del ADN genómico se ensambla en nucleosomas, se necesita información estructural de estos complejos. Hasta la fecha, la comunidad científica carece de protocolos detallados para realizar estudios estructurales técnicamente viables de estos complejos. Aquí, proporcionamos dos métodos para preparar un complejo de dos enzimas BER genéticamente fusionadas (polimerasa β y endonucleasa AP1) unidas a un espacio de un solo nucleótido cerca de la entrada-salida del nucleosoma para la determinación estructural de la criomicroscopía electrónica (crio-EM). Ambos métodos de preparación de muestras son compatibles para vitrificar rejillas de calidad mediante congelación por inmersión. Este protocolo se puede utilizar como punto de partida para preparar otros complejos nucleosómicos con diferentes factores BER, factores de transcripción pioneros y enzimas modificadoras de la cromatina.

Introducción

El ADN eucariota es organizado y compactado por proteínas histonas, formando cromatina. La partícula del núcleo del nucleosoma (NCP) constituye la unidad de repetición fundamental de la cromatina que regula la accesibilidad a las proteínas de unión al ADN para la reparación, transcripción y replicación del ADN1. Aunque la primera estructura cristalina de rayos X del NCP se resolvió por primera vez hace más de dos décadas2 y se han publicado muchas más estructuras del NCPdesde 3,4,5,6, los mecanismos de reparación del ADN en sustratos nucleosómicos aún no se han delineado. Descubrir los detalles moleculares subyacentes a la reparación del ADN en la cromatina requerirá la caracterización estructural de los componentes participantes para comprender cómo las características estructurales locales del NCP regulan las actividades de reparación del ADN. Esto es particularmente importante en el contexto de la reparación por escisión de bases (BER) dado que los estudios bioquímicos con enzimas BER sugieren mecanismos únicos de reparación del ADN en nucleosomas que dependen de los requisitos estructurales específicos de la enzima para la catálisis y la posición estructural de la lesión del ADN dentro del nucleosoma 7,8,9,10,11,12,13 . Dado que el BER es un proceso vital de reparación del ADN, existe un interés considerable en llenar estos vacíos y al mismo tiempo establecer un punto de partida desde el cual se puedan llevar a cabo otros estudios estructurales técnicamente factibles que involucren complejos nucleosómicos relevantes.

Cryo-EM se está convirtiendo rápidamente en el método de elección para resolver la estructura tridimensional (3D) de complejos cuya preparación a gran escala de muestras homogéneas es un desafío. Aunque el diseño y la purificación de NCP complejados con un factor de reparación del ADN (NCP-DRF) probablemente requerirán una optimización personalizada, el procedimiento presentado aquí para generar y congelar un complejo NCP-DRF estable proporciona detalles sobre cómo optimizar la preparación de la rejilla crio-EM y de la muestra. Dos flujos de trabajo (no mutuamente excluyentes) que se muestran en la figura 1 y los detalles específicos del protocolo identifican los pasos críticos y proporcionan estrategias para optimizarlos. Este trabajo impulsará el campo de la cromatina y la reparación del ADN en una dirección en la que complementar los estudios bioquímicos con estudios estructurales sea técnicamente factible para comprender mejor los mecanismos moleculares de la reparación del ADN nucleosómico.

Protocolo

1. Ensamblar partículas de núcleo de nucleosomas a través de diálisis de protección salina

NOTA: La preparación de partículas nucleosómicas del núcleo utilizando proteínas histonas recombinantes para estudios estructurales ha sido ampliamente descrita en detalle por otros14,15,16. Seguir la purificación de las histonas recombinantes de X. laevis y el conjunto de octameros de histonas descrito por otros14,15, y ensamblar el sustrato nucleosómico como se describe a continuación.

  1. Compre tres oligonucleótidos (enumerados en la Tabla 1) en la escala indicada: UND-197mer, 161mer, 35mer.
    1. PAGE purifica los ecrómeros (197mer y 161mer) como se describe17.
      1. Cantidades aneales equimolares de oligonucleótidos en 1x tampón de recocido (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl). Por ejemplo, mezcle 40 μL de 161-mer [166.7 μM]; 8 μL de 35 meres [292,4 μM]; 16,8 μL de hebra comp de 197 mer [408,2 μM]; 10 μL de tampón recocílico 10x y 10,9 μL dedH2O.
        NOTA: Es fundamental controlar la reacción de recocido con un gradiente de temperatura. Consulte la Tabla 2 para obtener detalles sobre el gradiente de temperatura.
  2. Realizar reconstituciones a pequeña escala (escala por un factor de 1/57 del ejemplo que se muestra a continuación para un volumen final de 50 μL) para determinar la proporción de ADN a octamer de histona (las proporciones iniciales típicas de ADN:octámero son las siguientes: 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; se muestra en la Figura 2A); Es fundamental determinar esta relación empíricamente con reconstituciones a pequeña escala.
    1. Después de determinar esta proporción, prepare una reconstitución a gran escala. Por ejemplo, mezcle 32.9 μL de ADN-197 pb [99.4 μM]; 1647,1 μL de TE (1x); 1120 μL de 5 M NaCl, y 62,3 μL de octamer de histona WT [2,56 μM].
  3. Hacer tampones de diálisis: RBbajo y RBalto como se describe en la Tabla 3 y Tabla 4, respectivamente; establecer las reconstituciones como se describió anteriormente14.
    1. Transfiera el tubo de diálisis al vaso de precipitados que contiene RBalto, y permita que la diálisis continúe, con una agitación suave, durante 16 h o hasta que se hayan transferido 2 LRB bajos al vaso de precipitados de desecho.
  4. Transfiera el tubo de diálisis a un vaso de precipitados de 1 L que contenga tampón RB50mM (Tabla 5) y deje que la muestra se dialice durante al menos 3 h o durante la noche.
    1. Evaluar la eficiencia de reconstitución en un gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 6%, asegurando que haya menos del 10% de ADN libre y una sola banda NCP; almacenar los NCP a 4 °C. Ver Figura 2A (carril 5) y Figura 2B para obtener resultados representativos óptimos de reconstitución.

2. Preparar el complejo del factor de reparación NCP-ADN (NCP-DRF)

  1. Purificación por electroforesis en gel preparativo
    NOTA: Este método es el más laborioso (de los dos descritos), y aunque es eficaz para eliminar especies de alto peso molecular (HMW) (Figura 6A) debido al alto factor de dilución, puede conducir a cierto desmontaje como se muestra en Figura 7A (NCP prep cell out lane), liberando ADN. Sin embargo, hasta un 25% de ADN libre sigue siendo compatible con los estudios crio-EM. Debido a la alta dilución, use este método para purificar solo el NCP, en lugar de todo el complejo.
    1. Prepare 70 ml de solución de gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6% en 0.2x TBE, usando solución de gel de poliacrilamida 37.5: 1, acrilamida: bisacrilamida. Vierta un gel cilíndrico con un radio exterior de 28 mm y polimerice durante la noche.
    2. Ensamble el aparato de gel preparativo que funciona, utilizando una membrana de diálisis con un corte de 6-8 kDa MW. Utilice 0,25x TBE como tampón de funcionamiento y 1x tampón de elución (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Pre-ejecute el gel cilíndrico a una constante de 12 W durante 1 h, y recoja las fracciones que hacen funcionar la bomba peristáltica a un caudal de aproximadamente 1 ml / min.
      NOTA: Si no se dispone de un detector UV para identificar fracciones que contienen ADN, se puede realizar un experimento de cribado con 32P-NCP para identificar las fracciones de interés. Manteniendo todas las condiciones iguales, los NCP no etiquetados se pueden purificar sin un detector UV.
    3. Concentrar los 2,8 ml de NCP a 250 μL utilizando un filtro centrífugo (corte MW 30 kDa), y cargar en el gel preparativo y electroforeso durante un total de 6 h. A las 2 h, cuando el cianol de xileno se haya quedado sin gel, comience a recolectar fracciones de 1,5 ml.
      NOTA: A las 2,5 h, las fracciones estarán libres de cianol xileno; el ADN (197mer) se eluye aproximadamente a las 3-3,5 h, y se espera que el NCP se eluya a las 4,5-5 h.
    4. Analizar fracciones de interés en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6%. Agrupe fracciones que contengan el NCP, y concentre inmediatamente con un filtro centrífugo (corte MW 30 kDa) a 1 mg/mL. Al día siguiente, evalúe la calidad del NCP en un gel no desnaturalizante de poliacrilamida al 6% antes de crear complejos con el factor de reparación del ADN (DRF) de interés.
    5. Incubar el NCP y el DRF de interés en hielo durante 15 minutos utilizando un amortiguador óptimo para el complejo específico. Por ejemplo, mezclar 1.000 μL de NCP [1,2 μM]; 260 μL de tampón de unión 5x (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL de 3 M KCl y 18 μL de MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
      NOTA: La temperatura y la fuerza iónica a la que se fabrica el complejo pueden necesitar optimización para diferentes complejos.
    6. Añadir glutaraldehído (recién abierto; EM) hasta una concentración final del 0,005%. Por lo tanto, a esta reacción, agregue 26.8 μL de glutaraldehído al 0.25% con 13.2 μL dedH2O. Mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 13 min.
    7. Enfriamiento con 1 M Tris-Cl, pH 7.5, hasta una concentración final de 20 mM Tris-Cl, pH 7.5. Concentrar a ~50 μL e intercambiar el tampón con 1x tampón de congelación: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.5 usando una columna de desalinización.
      PRECAUCIÓN: El glutaraldehído puede causar quemaduras graves en la piel y daño ocular; Es perjudicial si se ingiere, y es tóxico si se inhala. Use una bata de laboratorio, gafas, guantes y maneje glutaraldehído en una campana extractora y use una máscara.
      NOTA: Es crítico realizar la reacción de reticulación en un gran volumen con el NCP a esta concentración más baja. Los intentos previos de reticulación, incluso a esta concentración de glutaraldehído, pero a una NCP concentrada 10 veces mayor llevaron a la agregación de la muestra y a la reticulación excesiva como lo indica SDS PAGE y la cromatografía de exclusión de tamaño. Estas rejillas no tenían partículas discernibles con solo grumos (Figura 5D, E).
    8. Determinar las absorbancias en OD 280 y OD 260 y concentrarse aún más si es necesario para alcanzar 1.3-3 mg / ml, basado en OD 280 (la relación típica de OD260 / OD 280 = 1.7-2 produce partículas buenas). Para este pequeño volumen de 50 μL, el mejor método para reducir la pérdida de muestra es hacer un botón de diálisis con una tapa de un tubo de 1,7 ml cubierto por una membrana de diálisis (corte de 6-8 kDa MW), cortando la parte inferior del tubo y usando el borde del tubo para sellar la membrana en la parte superior de la tapa.
    9. Coloque el botón de diálisis que contiene la muestra sobre un lecho de polietilenglicol, con la membrana hacia abajo (verifique el progreso cada 2 minutos). Este método se prefiere cuando la concentración necesaria es menor o igual a 2,5 veces para evitar diluir o perder la muestra en el concentrador. Es fundamental preparar inmediatamente las rejillas crio-EM del complejo después de este paso.
  2. Purificación por cromatografía de exclusión de tamaño
    1. El día antes de la congelación, lavar y equilibrar una columna de exclusión de tamaño con 60 mL dedH2O, seguido de 80 mL de tampón de congelación (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) durante la noche a una velocidad de 0,4 mL/min. Usando NCP inmediatamente después de la reconstitución, prepare el mismo complejo usando cantidades 2.5 veces mayores de la siguiente manera: mezcle 2,500 μL de NCP [1.2 μM]; 650 μL de tampón de unión 5x; 45 μL de MBP-Pol β-APE1 [338 μM] y 55 μL de 3M KCl.
    2. Incubar la mezcla en hielo sin reticulación durante 15 min. Luego, agregue glutaraldehído a una concentración final de 0.005% como se describe en el método de gel preparativo. En este caso, sin embargo, concentrar el complejo en un filtro centrífugo preequilibrado (con tampón de congelación) a aproximadamente 120 μL.
    3. Analice inmediatamente las fracciones pico y concentre aquellas fracciones que contengan las histonas y MBP-Pol β-APE1 como se indicó anteriormente. Consulte la Figura 5A, B, C para obtener resultados exitosos utilizando el método de exclusión de tamaño y la Figura 7 utilizando ambos métodos.

3. Congelar complejo nucleosomal

  1. Después de encender el congelador de inmersión y llenar el humidificador con 50 ml de dH2O, ajuste la temperatura de la cámara a 22 °C y HR (humedad) al 98%. Coloque la taza de etano y la taza de nitrógeno líquido (que contiene una caja de rejilla etiquetada) en sus respectivos soportes de espacio.
  2. Cubra la taza de etano con el dispensador de tapa de etano y vierta cuidadosamente nitrógeno líquido (LN2) sobre ella, mientras también llena la taza LN 2 con LN2. Cuando el nivel de LN2 se haya estabilizado y alcance el 100% y una temperatura de -180 °C, abra con cuidado la válvula de etano y llene la copa de etano hasta que forme una burbuja en la tapa transparente. Retire el dispensador de etano.
  3. Coloque dos papeles de filtro en el dispositivo secante y asegúrelos con un anillo de metal. Vaya a la configuración y utilice los siguientes parámetros para la secación: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; seleccione A-plunge y haga clic en OK.
  4. En la pantalla principal, haga clic en Cargar pinzas y cárguelas con una cuadrícula con el lado de carbono / aplicación mirando hacia la izquierda (preparado como antes). Calibre las pinzas ajustando el eje Z para asegurar una mancha sólida. Haga clic en Cámara inferior y aplique 3 μL del complejo (1.3-3 mg / ml; OD280). Haga clic en Blot / A-plunge. Esto hará girar la rejilla para que se borre desde el frente y la congelará.
  5. Transfiera y almacene la rejilla en la caja de rejilla en la cámara LN2 . Cuando las cuatro rejillas se hayan congelado y colocado en la caja de rejilla, gire la tapa a una posición neutral, donde todas las rejillas estén cubiertas por la tapa, y apriete el tornillo. Las rejillas se pueden almacenar en LN2 hasta que se inicie la detección.

4. Cuadrículas de pantalla

  1. Antes de cargar las muestras en el microscopio, coloque las rejillas vitrificadas en un anillo y asegúrelas con un clip en C. Realice este proceso de recorte bajo LN2 en una habitación con humedad controlada, para evitar la contaminación del hielo.
  2. Al cargar el microscopio, inserte las rejillas en un casete de 12 ranuras. Inserte el casete en una cápsula nanocab y cárguelo en el cargador automático. El mecanismo robótico del cargador automático inicia el proceso.
  3. Transfiera la rejilla del casete a la etapa de microscopio. Ajuste el escenario a la altura eucéntrica tambaleando el escenario 10° y moviendo simultáneamente la altura Z hasta que se observe un desplazamiento plano mínimo en las imágenes.
  4. Una vez que se alcanza la altura eucéntrica, comience a tomar imágenes. Primero, obtenga el atlas tomando una imagen de montaje de 3 x 3 de la cuadrícula, en la que cada montaje se toma con un aumento de 62x. Elija tres cuadrados de diferentes tamaños; Tome la altura eucéntrica y luego la imagen con un aumento de 210x.
  5. Una vez que se toma una imagen de un cuadrado, elija un agujero desde el borde, el centro y el medio dentro de los cuadrados. Imagen de cada agujero con un aumento de 2600x.
  6. Antes de tomar esta imagen de gran aumento, el enfoque automático se produce en un desplazamiento del área de imagen. Tome la imagen de gran aumento desde el centro del orificio con un aumento de 36,000x y un tiempo de exposición de 7.1 s, 60 cuadros, tamaño de 1.18 píxeles y desenfoque de 3 μm. Vea imágenes representativas de la detección en la Figura 5, Figura 6 y Figura 7.

Resultados

Se utilizaron NCP correctamente ensamblados (Figura 2) para hacer un complejo con una proteína de fusión recombinante de MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Para determinar la relación de NCP a MBP-Polβ-APE1 para formar un complejo estable, realizamos ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) (Figura 4), que mostraron una banda desplazada individualmente de la NCP con un exceso molar de 5 veces de MBP-Polβ-APE1. Dur...

Discusión

Un protocolo específico para purificar el factor de reparación del ADN dependerá de la enzima de interés. Sin embargo, hay algunas recomendaciones generales, incluyendo el uso de métodos recombinantes para la expresión y purificación de proteínas18; si la proteína de interés es demasiado pequeña (<50 kDa), la determinación de la estructura por crio-EM había sido casi imposible hasta más recientemente mediante el uso de sistemas de fusión19, andamios de unión...

Divulgaciones

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Mario Borgnia del núcleo crio-EM en el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental y al Dr. Joshua Strauss de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill por su tutoría y capacitación en la preparación de la red crio-EM. Juliana Mello Da Fonseca Rezende por su asistencia técnica en las etapas iniciales de este proyecto. Apreciamos la contribución clave y el apoyo del difunto Dr. Samuel H. Wilson y sus miembros de laboratorio, especialmente el Dr. Rajendra Prasad y el Dr. Joonas Jamsen para la purificación del complejo APE1-Polβ genéticamente fusionado. La investigación ha sido apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental [números de subvención Z01ES050158, Z01ES050159 y K99ES031662-01].

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M HEPES; pH 7.5Thermo Fisher Scientific15630080
1 M MgCl2Thermo Fisher ScientificAM9530G
10x TBEBio-rad1610733
25% glutaraldehydeFisher Scientific50-262-23
3 M KClThermo Fisher Scientific043398.K2
491 prep cellBio-rad1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)Millipore SigmaZ717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)Millipore SigmaUFC8030
AutoGrid TweezersTed Pella47000-600
Automatic Plunge FreezerLeicaLeica EM GP
C-1000 touch thermocyclerBio-rad1851148
C-clips and ringsThermo Fisher6640--6640
Clipping stationSubAngostromSCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)Fisher Scientific15370752
Diamond TweezersTechni-Pro758TW0010
dsDNAIntegrated DNA techonologiesN/A
FEI Titan KriosThermo FisherKRIOSG4TEM
FPLC purification systemAKTA Pure29018224
Fraction collector Model 2110Bio-rad7318122
Glow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S
Grid BoxesSubAngostromPB-E
Grid Storage Accessory PackSubAngostromGSAX
Liquid EthaneN/AN/A
Liquid NitrogenN/AN/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pumpGilsonF155008
NanodropThermo Fisher ScientificND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein GelsThermo Fisher ScientificEC6695BOX
PipetmanGilsonFA10002M
Pipette tips (VWR) Low RetentionVWR76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1)Bio-rad1610158
polyethylene glycol (PEG)Millipore SigmaP4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500Millipore SigmaPURX35050
Purified recombinant DNA repair factorN/AN/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh GridsQuantifoilN1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamerN/AN/A
Spring clipping toolsSubAngostromCSA-01
Superdex 200 column 10/300Millipore SigmaGE28-9909-44
Transmission Electron MicroscopeThermo FisherTalos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-ITed Pella47000-500
UltraPure GlycerolThermo Fisher Scientific15514011
VitrobotThermo FisherMark IV System
Whatman Filter paper (55 mM)Cytiva1005-055
Xylene cyanolThermo Fisher Scientific440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µLThermo Fisher Scientific89877

Referencias

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