Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Herstellung von Nukleosomalkomplexen unter Verwendung von zwei Methoden der Probenvorbereitung zum Einfrieren von TEM-Gittern.

Zusammenfassung

Die DNA-Reparatur im Zusammenhang mit Chromatin ist kaum verstanden. Biochemische Studien mit Nukleosomenkernpartikeln, der grundlegenden Wiederholungseinheit des Chromatins, zeigen, dass die meisten DNA-Reparaturenzyme DNA-Schäden im Vergleich zu freier DNA mit reduzierten Raten entfernen. Die molekularen Details darüber, wie Basen-Exzisionsreparatur-Enzyme (BER) DNA-Schäden in Nukleosomen erkennen und entfernen, wurden nicht aufgeklärt. Biochemische BER-Daten von nukleosomalen Substraten deuten jedoch darauf hin, dass das Nukleosom je nach Ort der DNA-Läsion und des Enzyms unterschiedliche strukturelle Barrieren aufweist. Dies deutet darauf hin, dass die Mechanismen, die von diesen Enzymen verwendet werden, um DNA-Schäden in freier DNA zu entfernen, sich von denen unterscheiden können, die in Nukleosomen verwendet werden. Angesichts der Tatsache, dass der Großteil der genomischen DNA zu Nukleosomen zusammengesetzt ist, werden strukturelle Informationen dieser Komplexe benötigt. Bis heute fehlen der wissenschaftlichen Gemeinschaft detaillierte Protokolle, um technisch machbare Strukturstudien dieser Komplexe durchzuführen. Hier stellen wir zwei Methoden zur Verfügung, um einen Komplex aus zwei genetisch fusionierten BER-Enzymen (Polymerase β und AP Endonuclease1) herzustellen, die an eine Einzelnukleotidlücke in der Nähe des Eintritts-Austritts des Nukleosoms gebunden sind, um die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu ermöglichen. Beide Methoden der Probenvorbereitung sind für die Verglasung von Qualitätsgittern durch Tauchgefrieren geeignet. Dieses Protokoll kann als Ausgangspunkt für die Herstellung anderer nukleosomaler Komplexe mit verschiedenen BER-Faktoren, Pionier-Transkriptionsfaktoren und Chromatin-modifizierenden Enzymen verwendet werden.

Einleitung

Eukaryotische DNA wird durch Histonproteine organisiert und verdichtet, wobei Chromatin gebildet wird. Das Nukleosomenkernpartikel (NCP) stellt die grundlegende Wiederholungseinheit des Chromatins dar, die den Zugang zu DNA-bindenden Proteinen für die DNA-Reparatur, -Transkription und -Replikation reguliert¹. Obwohl die erste Röntgenkristallstruktur des NCP erstmals vor mehr als zwei Jahrzehnten aufgeklärt wurde² und viele weitere Strukturen des NCP seit 3,4,5,6 veröffentlicht wurden^, sind DNA-Reparaturmechanismen in nukleosomalen Substraten noch nicht beschrieben. Die Aufdeckung der molekularen Details, die der DNA-Reparatur im Chromatin zugrunde liegen, erfordert eine strukturelle Charakterisierung der beteiligten Komponenten, um zu verstehen, wie lokale strukturelle Merkmale des NCP die DNA-Reparaturaktivitäten regulieren. Dies ist besonders wichtig im Zusammenhang mit der Basenexzisionsreparatur (BER), da biochemische Studien mit BER-Enzymen auf einzigartige DNA-Reparaturmechanismen in Nukleosomen hindeuten, die von enzymspezifischen strukturellen Anforderungen für die Katalyse und der strukturellen Position der DNA-Läsion innerhalb des Nukleosoms^abhängen 7,8,9,10,11,12,13 . Da es sich bei der BER um einen lebenswichtigen DNA-Reparaturprozess handelt, besteht ein erhebliches Interesse, diese Lücken zu schließen und gleichzeitig einen Ausgangspunkt zu schaffen, von dem aus andere technisch realisierbare Strukturstudien mit relevanten nukleosomalen Komplexen durchgeführt werden können.

Die Kryo-EM entwickelt sich schnell zur Methode der Wahl, um die dreidimensionale (3D) Struktur von Komplexen zu lösen, deren großflächige Vorbereitung einer homogenen Probe eine Herausforderung darstellt. Obwohl das Design und die Aufreinigung von NCPs, die mit einem DNA-Reparaturfaktor (NCP-DRF) komplexiert sind, wahrscheinlich eine maßgeschneiderte Optimierung erfordern wird, liefert das hier vorgestellte Verfahren zur Erzeugung und zum Einfrieren eines stabilen NCP-DRF-Komplexes Details zur Optimierung der Proben- und Kryo-EM-Gittervorbereitung. Zwei (sich nicht gegenseitig ausschließende) Workflows, die in Abbildung 1 dargestellt sind, und die spezifischen Details im Protokoll identifizieren kritische Schritte und bieten Strategien zur Optimierung dieser Schritte. Diese Arbeit wird das Chromatin- und DNA-Reparaturfeld in eine Richtung treiben, in der die Ergänzung biochemischer mit strukturellen Studien technisch möglich wird, um die molekularen Mechanismen der nukleosomalen DNA-Reparatur besser zu verstehen.

Protokoll

1. Zusammenbau von Nukleosomenkernpartikeln mittels Salz-Garstoff-Dialyse

ANMERKUNG: Die Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln unter Verwendung rekombinanter Histonproteine für Strukturstudien wurde von anderen ausführlich beschrieben^14,15,16. Befolgen Sie die Reinigung der rekombinanten X. laevis-Histone und der Histon-Oktamer-Assemblierung, die von anderen^14,15 beschrieben wurden^, und bauen Sie das nukleosomale Substrat wie unten beschrieben zusammen.

1. Kaufen Sie drei Oligonukleotide (aufgeführt in Tabelle 1) in der angegebenen Skala: UND-197mer, 161mer, 35mer.
   1. PAGE reinigt Ultramere (197mer und 161mer) wie beschrieben¹⁷.
      1. Anneale äquimolare Mengen an Oligonukleotiden in 1x Annealing-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Mischen Sie beispielsweise 40 μl 161-mer [166,7 μM]; 8 μl 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μl 197-merer Comp-Strang [408,2 μM]; 10 μl 10x Glühpuffer und 10,9 μl_dH2O.
         HINWEIS: Es ist wichtig, die Glühreaktion mit einem Temperaturgradienten zu steuern. In Tabelle 2 finden Sie Details zum Temperaturgradienten.
2. Durchführung von Rekonstitutionen im kleinen Maßstab (Skalierung um den Faktor 1/57 des unten gezeigten Beispiels für ein Endvolumen von 50 μl), um das Verhältnis von DNA zu Histon-Oktamer zu bestimmen (typische Ausgangsverhältnisse von DNA:Oktamer sind wie folgt: 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2; dargestellt in Abbildung 2A); Es ist wichtig, dieses Verhältnis empirisch mit kleinräumigen Rekonstitutionen zu bestimmen.
   1. Nachdem dieses Verhältnis bestimmt wurde, bereiten Sie eine groß angelegte Rekonstitution vor. Mischen Sie beispielsweise 32,9 μl DNA-197 bp [99,4 μM]; 1647,1 μl TE (1x); 1120 μl 5 M NaCl und 62,3 μl WT-Histon-Oktamer [2,56 μM].
3. Stellen Sie Dialysepuffer her: RB_niedrig und RB_hoch , wie in Tabelle 3 bzw. Tabelle 4 beschrieben; Richten Sie die Rekonstitutionen wie zuvor beschrieben ein¹⁴.
   1. Das Dialyseröhrchen wird in das Becherglas mit_{RB high} gegeben und die Dialyse unter leichtem Rühren 16 h lang fortgesetzt oder bis 2 L RB_low in das Becherglas überführt wurden.
4. Das Dialyseröhrchen wird in ein 1-Liter-Becherglas mit RB_{50 mM} Puffer (Tabelle 5) überführt und die Probe mindestens 3 h oder über Nacht dialysieren lassen.
   1. Bewerten Sie die Rekonstitutionseffizienz auf einem nicht denaturierenden 6%igen Polyacrylamid-Gel, um sicherzustellen, dass weniger als 10% freie DNA und eine einzelne NCP-Bande vorhanden sind. NCPs bei 4 °C lagern. Siehe Abbildung 2A (Spur 5) und Abbildung 2B für repräsentative optimale Rekonstitutionsergebnisse.

2. Bereiten Sie den NCP-DNA-Reparaturfaktor-Komplex (NCP-DRF) vor

1. Aufreinigung durch präparative Gelelektrophorese
   HINWEIS: Diese Methode ist die arbeitsintensivste (der beiden beschriebenen) und obwohl sie bei der Entfernung von Spezies mit hohem Molekulargewicht (HMW) (Abbildung 6A) aufgrund des hohen Verdünnungsfaktors kann es zu einer gewissen Demontage kommen, wie in Abbildung 7A (NCP-Vorbereitungszelle aus der Spur), Freisetzung von DNA. Bis zu 25% freie DNA ist jedoch immer noch mit Kryo-EM-Studien kompatibel. Verwenden Sie diese Methode aufgrund der hohen Verdünnung, um nur den NCP und nicht den gesamten Komplex zu reinigen.
   1. Bereiten Sie 70 ml 6%ige nicht denaturierende Polyacrylamid-Gellösung in 0,2x TBE unter Verwendung von Polyacrylamid-Gellösung 37,5:1, Acrylamid:Bisacrylamid vor. Gießen Sie ein zylindrisches Gel mit einem Außenradius von 28 mm und polymerisieren Sie über Nacht.
   2. Montieren Sie die präparative Gellaufvorrichtung unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem Cutoff von 6-8 kDa MW. Verwenden Sie 0,25x TBE als Laufpuffer und 1x Elutionspuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Lassen Sie das zylindrische Gel 1 Stunde lang bei konstanten 12 W vorlaufen und sammeln Sie Fraktionen, die die Peristaltikpumpe mit einer Durchflussrate von ca. 1 ml/min betreiben.
      HINWEIS: Wenn kein UV-Detektor zur Identifizierung von DNA-haltigen Fraktionen zur Verfügung steht, kann ein Screening-Experiment mit ³²P-NCP durchgeführt werden, um die interessierenden Fraktionen zu identifizieren. Unter Beibehaltung aller Bedingungen können unmarkierte NCPs dann ohne UV-Detektor gereinigt werden.
   3. Die 2,8 ml NCP werden mit einem Zentrifugalfilter (MW-Cutoff 30 kDa) auf 250 μl konzentriert und insgesamt 6 h lang auf das präparative Gel und die Elektrophorese geladen. Nach 2 Stunden, wenn das Xylolcyanol aus dem Gel ausgelaufen ist, beginnen Sie mit dem Sammeln von 1,5-ml-Fraktionen.
      HINWEIS: Nach 2,5 h sind die Fraktionen frei von Xylolcyanol; Die DNA (197mer) eluiert nach etwa 3-3,5 h, und es wird erwartet, dass das NCP nach 4,5-5 h eluiert.
   4. Analysieren Sie die interessierenden Fraktionen auf einem 6% nicht denaturierenden Polyacrylamidgel. Pool-Fraktionen, die das NCP enthalten, und sofort mit einem Zentrifugalfilter (MW-Cutoff 30 kDa) auf 1 mg/ml konzentrieren. Bewerten Sie am nächsten Tag die Qualität des NCP auf einem nicht denaturierenden 6%igen Polyacrylamid-Gel, bevor Sie mit dem gewünschten DNA-Reparaturfaktor (DRF) komplexieren.
   5. Inkubieren Sie den NCP und den DRF von Interesse 15 Minuten lang auf Eis mit einem optimalen Puffer für den spezifischen Komplex. Mischen Sie beispielsweise 1.000 μl NCP [1,2 μM]; 260 μl 5x Bindungspuffer (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂), 22 μl 3 M KCl und 18 μl MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
      HINWEIS: Die Temperatur und die Ionenstärke, bei der der Komplex hergestellt wird, müssen möglicherweise für verschiedene Komplexe optimiert werden.
   6. Fügen Sie Glutaraldehyd hinzu (frisch geöffnet; EM-Gehalt) bis zu einer Endkonzentration von 0,005 %. Fügen Sie daher zu dieser Reaktion 26,8 μl 0,25% Glutaraldehyd mit 13,2 μl dH₂O hinzu. Gut mischen und 13 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   7. Abschrecken mit 1 M Tris-Cl, pH 7,5, bis zu einer Endkonzentration von 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Konzentrat auf ~50 μL und Austausch des Puffers mit 1x Gefrierpuffer: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 unter Verwendung einer Entsalzungssäule.
      ACHTUNG: Glutaraldehyd kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen; Es ist schädlich, wenn es verschluckt wird, und es ist giftig, wenn es eingeatmet wird. Tragen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille, Handschuhe und behandeln Sie Glutaraldehyd in einem Abzug und tragen Sie eine Maske.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Vernetzungsreaktion in einem großen Volumen mit dem NCP in dieser niedrigeren Konzentration durchzuführen. Frühere Versuche der Vernetzung, selbst bei dieser Konzentration von Glutaraldehyd, aber bei einem 10-fach höher konzentrierten NCP, führten zu einer Aggregation der Probe und einer Übervernetzung, wie durch SDS PAGE und Größenausschlusschromatographie angezeigt. Diese Gitter hatten keine erkennbaren Partikel mit nur Klumpen (Abbildung 5D, E).
   8. Bestimmen Sie die Absorptionen bei OD 280 und OD 260 und konzentrieren Sie sich bei Bedarf weiter, um 1,3-3 mg/ml zu erreichen, basierend auf OD 280 (typisches Verhältnis von OD_{260 / OD 280} = 1,7-2 ergibt gute Partikel). Für dieses kleine Volumen von 50 μl besteht die beste Methode zur Reduzierung des Probenverlusts darin, einen Dialyseknopf mit einem Deckel aus einem 1,7-ml-Röhrchen herzustellen, das von einer Dialysemembran bedeckt ist (6-8 kDa MW Cutoff), den Boden des Röhrchens zu schneiden und den Rand des Röhrchens zu verwenden, um die Membran oben auf dem Deckel abzudichten.
   9. Legen Sie den Dialyseknopf mit der Probe mit der Membran nach unten auf ein Polyethylenglykolbett (überprüfen Sie den Fortschritt alle 2 Minuten). Diese Methode wird bevorzugt, wenn die erforderliche Konzentration kleiner oder gleich dem 2,5-fachen ist, um eine Verdünnung oder einen Verlust der Probe im Konzentrator zu vermeiden. Es ist wichtig, sofort nach diesem Schritt Kryo-EM-Gitter des Komplexes vorzubereiten.
2. Aufreinigung durch Größenausschlusschromatographie
   1. Am Tag vor dem Einfrieren eine Größenausschlusssäule mit 60 ml dH₂O, gefolgt von 80 ml Gefrierpuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) über Nacht mit einer Geschwindigkeit von 0,4 ml/min waschen und äquilibrieren. Bereiten Sie den gleichen Komplex mit NCPs direkt nach der Rekonstitution mit 2,5-mal größeren Mengen wie folgt vor: Mischen Sie 2.500 μl NCP [1,2 μM]; 650 μl 5-facher Bindungspuffer; 45 μl MBP-Pol β-APE1 [338 μM] und 55 μl 3M KCl.
   2. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang auf Eis ohne Vernetzer. Fügen Sie dann Glutaraldehyd zu einer Endkonzentration von 0,005% hinzu, wie in der präparativen Gelmethode beschrieben. In diesem Fall wird der Komplex jedoch in einem voräquilibrierten (mit Gefrierpuffer) Zentrifugalfilter auf ca. 120 μL eingeengt.
   3. Analysieren Sie sofort die Peakfraktionen und konzentrieren Sie die Fraktionen, die die Histone und MBP-Pol β-APE1 enthalten, wie zuvor angegeben. Siehe Abbildung 5A, B, C für erfolgreiche Ergebnisse mit der Größenausschlussmethode und Abbildung 7 mit beiden Methoden.

3. Nukleosomalkomplex einfrieren

1. Nach dem Einschalten des Gefrierschranks und dem Befüllen des Luftbefeuchters mit 50 ml dH₂O stellen Sie die Kammertemperatur auf 22 °C und H_R (Luftfeuchtigkeit) auf 98% ein. Stellen Sie den Ethanbecher und den Flüssigstickstoffbecher (mit einer beschrifteten Gitterbox) in die entsprechenden Platzhalter.
2. Decken Sie den Ethanbecher mit dem Ethandeckelspender ab und gießen Sie vorsichtig flüssigen Stickstoff (LN2) darüber, während Sie den LN 2-Becher gleichzeitig mit LN₂ füllen. Wenn sich der LN_2-Füllstand stabilisiert hat und 100 % und eine Temperatur von -180 °C erreicht hat, öffnen Sie vorsichtig das Ethanventil und füllen Sie den Ethanbecher, bis er eine Blase auf dem durchsichtigen Deckel bildet. Entfernen Sie den Ethanspender.
3. Legen Sie zwei Filterpapiere auf das Löschgerät und sichern Sie sie mit einem Metallring. Gehen Sie zum Setup und verwenden Sie die folgenden Parameter für das Blotting: 0 Pre-Blot, 3 s Blot, 0 Post-Blot; Wählen Sie A-Plunge und klicken Sie auf OK.
4. Klicken Sie auf dem Hauptbildschirm auf Pinzette laden und laden Sie sie mit einem Gitter mit der Carbon-/Anwendungsseite nach links (wie zuvor vorbereitet). Kalibrieren Sie die Pinzette und stellen Sie die Z-Achse ein, um einen festen Fleck zu gewährleisten. Klicken Sie auf Untere Kammer und tragen Sie 3 μl des Komplexes (1,3-3 mg/ml; OD₂₈₀). Klicken Sie auf Blot/A-plunge. Dadurch wird das Gitter so gedreht, dass es von vorne abdeckt, und es wird eingefroren.
5. Übertragen und lagern Sie das Gitter in der Gitterbox in der LN_2-Kammer . Wenn alle vier Gitter eingefroren und in die Gitterbox gelegt wurden, drehen Sie den Deckel in die neutrale Position, in der alle Gitter vom Deckel bedeckt sind, und ziehen Sie die Schraube fest. Gitter können in LN₂ gespeichert werden, bis die Siebung eingeleitet wird.

4. Bildschirmraster

1. Bevor Sie die Proben in das Mikroskop einlegen, legen Sie die verglasten Gitter auf einen Ring und befestigen Sie sie mit einem C-Clip. Führen Sie diesen Clipping-Vorgang unter LN₂ in einem feuchtigkeitskontrollierten Raum durch, um eine Eiskontamination zu vermeiden.
2. Legen Sie beim Einlegen des Mikroskops die Gitter in eine Kassette mit 12 Steckplätzen ein. Legen Sie die Kassette in eine Nanocab-Kapsel und laden Sie sie in den Autoloader. Der Autoloader-Robotermechanismus leitet den Prozess ein.
3. Übertragen Sie das Gitter von der Kassette auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie den Tisch auf euzentrische Höhe ein, indem Sie den Tisch um 10° wackeln und gleichzeitig die Z-Höhe verschieben, bis eine minimale planare Verschiebung in den Bildern beobachtet wird.
4. Sobald die euzentrische Höhe erreicht ist, beginnen Sie mit der Bildgebung. Erhalten Sie zunächst den Atlas, indem Sie ein 3 x 3-Montagebild des Rasters aufnehmen, in dem jede Montage mit 62-facher Vergrößerung aufgenommen wird. Wählen Sie drei Quadrate unterschiedlicher Größe; Nehmen Sie die euzentrische Höhe und nehmen Sie dann das Bild mit 210-facher Vergrößerung auf.
5. Sobald ein Quadrat abgebildet ist, wählen Sie jeweils ein Loch von der Kante, in der Mitte und dazwischen innerhalb der Quadrate. Stellen Sie jedes Loch mit 2600-facher Vergrößerung dar.
6. Vor der Aufnahme dieses Bildes mit hoher Vergrößerung erfolgt der Autofokus in einem Versatz des Abbildungsbereichs. Nehmen Sie das Bild mit hoher Vergrößerung aus der Mitte des Lochs mit 36.000-facher Vergrößerung und einer Belichtungszeit von 7,1 s, 60 Bildern, einer Größe von 1,18 Pixel und einer Unschärfe von 3 μm auf. Repräsentative Bilder des Screenings finden Sie in Abbildung 5, Abbildung 6 und Abbildung 7.

Ergebnisse

Richtig zusammengesetzte NCPs (Abbildung 2) wurden verwendet, um einen Komplex mit einem rekombinanten Fusionsprotein aus MBP-Polβ-APE1 herzustellen (Abbildung 3). Um das Verhältnis von NCP zu MBP-Polβ-APE1 zur Bildung eines stabilen Komplexes zu bestimmen, führten wir elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSA) durch (Abbildung 4), die eine einfach verschobene Bande des NCP mit einem 5-fachen molaren Überschuss an...

Diskussion

Ein spezifisches Protokoll zur Reinigung des DNA-Reparaturfaktors hängt von dem interessierenden Enzym ab. Es gibt jedoch einige allgemeine Empfehlungen, einschließlich der Verwendung rekombinanter Methoden zur Proteinexpression und -reinigung¹⁸; Wenn das interessierende Protein zu klein ist (<50 kDa), war die Strukturbestimmung durch Kryo-EM bis vor kurzem durch den Einsatz von Fusionssystemen¹⁹, Nanokörper-bindenden Gerüsten²⁰ und der Optimieru...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES; pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15630080
1 M MgCl2	Thermo Fisher Scientific	AM9530G
10x TBE	Bio-rad	1610733
25% glutaraldehyde	Fisher Scientific	50-262-23
3 M KCl	Thermo Fisher Scientific	043398.K2
491 prep cell	Bio-rad	1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)	Millipore Sigma	Z717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)	Millipore Sigma	UFC8030
AutoGrid Tweezers	Ted Pella	47000-600
Automatic Plunge Freezer	Leica	Leica EM GP
C-1000 touch thermocycler	Bio-rad	1851148
C-clips and rings	Thermo Fisher	6640--6640
Clipping station	SubAngostrom	SCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)	Fisher Scientific	15370752
Diamond Tweezers	Techni-Pro	758TW0010
dsDNA	Integrated DNA techonologies	N/A
FEI Titan Krios	Thermo Fisher	KRIOSG4TEM
FPLC purification system	AKTA Pure	29018224
Fraction collector Model 2110	Bio-rad	7318122
Glow Discharge Cleaning System	Ted Pella	91000S
Grid Boxes	SubAngostrom	PB-E
Grid Storage Accessory Pack	SubAngostrom	GSAX
Liquid Ethane	N/A	N/A
Liquid Nitrogen	N/A	N/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pump	Gilson	F155008
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	EC6695BOX
Pipetman	Gilson	FA10002M
Pipette tips (VWR) Low Retention	VWR	76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1)	Bio-rad	1610158
polyethylene glycol (PEG)	Millipore Sigma	P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500	Millipore Sigma	PURX35050
Purified recombinant DNA repair factor	N/A	N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids	Quantifoil	N1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamer	N/A	N/A
Spring clipping tools	SubAngostrom	CSA-01
Superdex 200 column 10/300	Millipore Sigma	GE28-9909-44
Transmission Electron Microscope	Thermo Fisher	Talos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I	Ted Pella	47000-500
UltraPure Glycerol	Thermo Fisher Scientific	15514011
Vitrobot	Thermo Fisher	Mark IV System
Whatman Filter paper (55 mM)	Cytiva	1005-055
Xylene cyanol	Thermo Fisher Scientific	440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL	Thermo Fisher Scientific	89877