Preparazione di particelle nucleosomiche complessate con fattori di riparazione del DNA per la determinazione strutturale della microscopia crioelettronica

Riepilogo

Questo protocollo delinea in dettaglio la preparazione di complessi nucleosomiali utilizzando due metodi di preparazione del campione per il congelamento delle griglie TEM.

Abstract

La riparazione del DNA nel contesto della cromatina è poco conosciuta. Studi biochimici che utilizzano particelle nucleosomiche del nucleosoma, l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina, mostrano che la maggior parte degli enzimi di riparazione del DNA rimuove il danno al DNA a tassi ridotti rispetto al DNA libero. I dettagli molecolari su come gli enzimi di riparazione dell'escissione di base (BER) riconoscono e rimuovono il danno al DNA nei nucleosomi non sono stati chiariti. Tuttavia, i dati biochimici BER dei substrati nucleosomiali suggeriscono che il nucleosoma presenta diverse barriere strutturali a seconda della posizione della lesione del DNA e dell'enzima. Ciò indica che i meccanismi impiegati da questi enzimi per rimuovere il danno al DNA nel DNA libero possono essere diversi da quelli impiegati nei nucleosomi. Dato che la maggior parte del DNA genomico è assemblato in nucleosomi, sono necessarie informazioni strutturali di questi complessi. Ad oggi, la comunità scientifica manca di protocolli dettagliati per eseguire studi strutturali tecnicamente fattibili di questi complessi. Qui, forniamo due metodi per preparare un complesso di due enzimi BER geneticamente fusi (polimerasi β e AP Endonucleasi1) legati a un gap a singolo nucleotide vicino all'entrata-uscita del nucleosoma per la determinazione strutturale della crio-microscopia elettronica (crio-EM). Entrambi i metodi di preparazione del campione sono compatibili per la vetrificazione di griglie di qualità tramite congelamento a tuffo. Questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per preparare altri complessi nucleosomiali con diversi fattori BER, fattori di trascrizione pionieristici ed enzimi modificanti la cromatina.

Introduzione

Il DNA eucariotico è organizzato e compattato dalle proteine istoniche, formando la cromatina. La particella nucleosomica (NCP) costituisce l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina che regola l'accessibilità alle proteine leganti il DNA per la riparazione, la trascrizione e la replicazione del DNA¹. Sebbene la prima struttura cristallina a raggi X del PCN sia stata risolta per la prima volta più di due decenni fa² e molte altre strutture del PCN siano state pubblicate da 3,4,5,6^, i meccanismi di riparazione del DNA nei substrati nucleosomiali non sono ancora stati delineati. Scoprire i dettagli molecolari alla base della riparazione del DNA nella cromatina richiederà la caratterizzazione strutturale dei componenti partecipanti per comprendere come le caratteristiche strutturali locali del PCN regolano le attività di riparazione del DNA. Ciò è particolarmente importante nel contesto della riparazione per escissione di base (BER), dato che gli studi biochimici con enzimi BER suggeriscono meccanismi unici di riparazione del DNA nei nucleosomi che dipendono dai requisiti strutturali enzimatici specifici per la catalisi e dalla posizione strutturale della lesione del DNA all'interno del nucleosoma 7,8,9,10,11,12,13 . Dato che il BER è un processo vitale di riparazione del DNA, vi è un notevole interesse a colmare queste lacune, stabilendo al contempo un punto di partenza da cui possono essere condotti altri studi strutturali tecnicamente fattibili che coinvolgono complessi nucleosomiali rilevanti.

Cryo-EM sta rapidamente diventando il metodo di scelta per risolvere la struttura tridimensionale (3D) di complessi la cui preparazione su larga scala di campioni omogenei è impegnativa. Sebbene la progettazione e la purificazione di NCP complessati con un fattore di riparazione del DNA (NCP-DRF) richiedano probabilmente un'ottimizzazione su misura, la procedura qui presentata per generare e congelare un complesso NCP-DRF stabile fornisce dettagli su come ottimizzare il campione e la preparazione della griglia crio-EM. Due flussi di lavoro (non mutuamente esclusivi) illustrati nella Figura 1 e i dettagli specifici nel protocollo identificano i passaggi critici e forniscono strategie per l'ottimizzazione di tali passaggi. Questo lavoro spingerà il campo della cromatina e della riparazione del DNA in una direzione in cui l'integrazione degli studi biochimici con quelli strutturali diventa tecnicamente fattibile per comprendere meglio i meccanismi molecolari della riparazione nucleosomica del DNA.

Protocollo

1. Assemblare le particelle del nucleo del nucleosoma tramite dialisi salina

NOTA: La preparazione di particelle nucleosomiche utilizzando proteine istoniche ricombinanti per studi strutturali è stata ampiamente descritta in dettaglio da altri^14,15,16. Seguire la purificazione degli istoni ricombinanti di X. laevis e dell'assemblaggio di ottameri istonici descritti da altri^14,15 e assemblare il substrato nucleosomico come descritto di seguito.

1. Acquistare tre oligonucleotidi (elencati nella Tabella 1) alla scala indicata: UND-197mer, 161mer, 35mer.
   1. PAGE purifica gli ultrameri (197mer e 161mer) come descritto¹⁷.
      1. Quantità equimolari di ricottura di oligonucleotidi in tampone di ricottura 1x (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Ad esempio, mescolare 40 μL di 161-mer [166,7 μM]; 8 μL di 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μL di filamento comp 197-mer [408,2 μM]; 10 μL di tampone di ricottura 10x e 10,9 μL di dH₂O.
         NOTA: è fondamentale controllare la reazione di ricottura con un gradiente di temperatura. Vedere la Tabella 2 per i dettagli sul gradiente di temperatura.
2. Eseguire ricostituzioni su piccola scala (scala di un fattore di 1/57 dell'esempio mostrato di seguito per un volume finale di 50 μL) per determinare il rapporto tra DNA e ottamero istonico (i rapporti di partenza tipici di DNA:ottamero sono i seguenti: 1:0.9, 1:1.1, 1:1.2, 1:2; mostrato in Figura 2A); È fondamentale determinare empiricamente questo rapporto con ricostituzioni su piccola scala.
   1. Dopo aver determinato questo rapporto, preparare una ricostituzione su larga scala. Ad esempio, mescolare 32,9 μL di DNA-197 bp [99,4 μM]; 1647,1 μL di TE (1x); 1120 μL di 5 M NaCl e 62,3 μL di ottamero istonico WT [2,56 μM].
3. Effettuare tamponi per dialisi: RB_basso e RB_alto come descritto rispettivamente nella Tabella 3 e nella Tabella 4; impostare le ricostituzioni come descritto in precedenza¹⁴.
   1. Trasferire il tubo di dialisi nel becher contenente RB_alto e lasciare che la dialisi proceda, agitando delicatamente, per 16 ore o fino a quando 2 L RB_basso non sia stato trasferito nel becher di scarico.
4. Trasferire il tubo di dialisi in un becher da 1 L contenente tampone RB_50mM (Tabella 5) e lasciare che il campione dializzi per almeno 3 ore o durante la notte.
   1. Valutare l'efficienza di ricostituzione su un gel non denaturante in poliacrilammide al 6%, assicurandosi che ci sia meno del 10% di DNA libero e una singola banda NCP; conservare i PCN a 4 °C. Vedere la Figura 2A (corsia 5) e la Figura 2B per i risultati rappresentativi ottimali della ricostituzione.

2. Preparare il complesso del fattore di riparazione NCP-NA (NCP-DRF)

1. Purificazione mediante elettroforesi su gel preparativo
   NOTA: Questo metodo è il più laborioso (dei due descritti) e, sebbene sia efficace nel rimuovere le specie ad alto peso molecolare (HMW) (Figura 6A) a causa dell'elevato fattore di diluizione, può portare ad un certo smontaggio, come mostrato nella Figura 7A (NCP prep cell out lane), rilasciando DNA. Tuttavia, fino al 25% di DNA libero è ancora compatibile con gli studi crio-EM. A causa dell'elevata diluizione, utilizzare questo metodo per purificare solo il PCN, piuttosto che l'intero complesso.
   1. Preparare 70 ml di soluzione di gel di poliacrilammide non denaturante al 6% in 0,2x TBE, utilizzando soluzione di gel di poliacrilammide 37,5: 1, acrilammide: bisacrilammide. Versare un gel cilindrico con raggio esterno di 28 mm e polimerizzare durante la notte.
   2. Assemblare l'apparecchio di funzionamento del gel preparativo, utilizzando una membrana per dialisi con un cutoff di 6-8 kDa MW. Utilizzare 0,25x TBE come buffer di corsa e 1x buffer di eluizione (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Pre-eseguire il gel cilindrico a una costante di 12 W per 1 ora e raccogliere le frazioni che fanno funzionare la pompa peristaltica ad una portata di circa 1 mL/min.
      NOTA: Se non è disponibile un rivelatore UV per identificare le frazioni contenenti DNA, è possibile eseguire un esperimento di screening con ³²P-NCP per identificare le frazioni di interesse. Mantenendo tutte le condizioni uguali, gli NCP non etichettati possono quindi essere purificati senza un rilevatore UV.
   3. Concentrare i 2,8 mL di NCP a 250 μL utilizzando un filtro centrifugo (cutoff MW 30 kDa) e caricare sul gel preparativo ed elettroforeso per un totale di 6 ore. A 2 ore, quando lo xilene cianolo ha esaurito il gel, iniziare a raccogliere 1,5 mL di frazioni.
      NOTA: A 2,5 ore, le frazioni saranno libere dallo xilene cianolo; il DNA (197mer) eluisce a circa 3-3,5 ore, e ci si aspetta che il NCP eluisca a 4,5-5 h.
   4. Analizzare le frazioni di interesse su un gel di poliacrilammide non denaturante al 6%. Raggruppare le frazioni contenenti il PCN e concentrare immediatamente con un filtro centrifugo (cutoff MW 30 kDa) a 1 mg/ml. Il giorno successivo, valutare la qualità del PCN su un gel non denaturante in poliacrilammide al 6% prima di complessare con il fattore di riparazione del DNA (DRF) di interesse.
   5. Incubare il PCN e il DRF di interesse sul ghiaccio per 15 minuti utilizzando un buffer ottimale per il complesso specifico. Ad esempio, miscelare 1.000 μL di NCP [1,2 μM]; 260 μL di tampone legante 5x (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂), 22 μL di 3 M KCl e 18 μL di MBP- Pol β-APE1 [338 μM].
      NOTA: La temperatura e la forza ionica a cui è realizzato il complesso potrebbero richiedere un'ottimizzazione per diversi complessi.
   6. Aggiungere glutaraldeide (appena aperta; EM) ad una concentrazione finale dello 0,005%. Pertanto, a questa reazione, aggiungere 26,8 μL di glutaraldeide allo 0,25% con 13,2 μL di dH₂O. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 13 minuti.
   7. Tempra con 1 M Tris-Cl, pH 7,5, fino ad una concentrazione finale di 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Concentrare a ~50 μL e sostituire il tampone con 1x tampone di congelamento: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 utilizzando una colonna di dissalazione.
      ATTENZIONE: La glutaraldeide può causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi; È dannoso se ingerito ed è tossico se inalato. Indossare un camice da laboratorio, occhiali, guanti e maneggiare la glutaraldeide in una cappa aspirante e indossare una maschera.
      NOTA: È fondamentale eseguire la reazione di reticolazione in un grande volume con il PCN a questa concentrazione inferiore. Precedenti tentativi di reticolazione, anche a questa concentrazione di glutaraldeide, ma ad un NCP concentrato 10 volte superiore, hanno portato all'aggregazione del campione e alla sovra-reticolazione come indicato dalla SDS PAGE e dalla cromatografia ad esclusione dimensionale. Queste griglie non avevano particelle distinguibili con solo grumi (Figura 5D,E).
   8. Determinare le assorbanze a OD 280 e OD 260 e concentrarsi ulteriormente se necessario per raggiungere 1,3-3 mg / ml, sulla base di OD 280 (rapporto tipico di OD_{260 / OD 280} = 1,7-2 produce particelle buone). Per questo piccolo volume di 50 μL, il metodo migliore per ridurre la perdita di campione è quello di creare un pulsante di dialisi con un coperchio di un tubo da 1,7 mL coperto da una membrana di dialisi (cutoff di 6-8 kDa MW), tagliando il fondo del tubo e utilizzando il bordo del tubo per sigillare la membrana sulla parte superiore del coperchio.
   9. Posizionare il pulsante di dialisi contenente il campione sopra un letto di glicole polietilenico, con la membrana rivolta verso il basso (controllare i progressi ogni 2 minuti). Questo metodo è preferibile quando la concentrazione necessaria è inferiore o uguale a 2,5 volte per evitare di diluire o perdere il campione nel concentratore. È fondamentale preparare immediatamente le griglie crio-EM del complesso dopo questo passaggio.
2. Cromatografia di purificazione mediante esclusione dimensionale
   1. Il giorno prima del congelamento, lavare ed equilibrare una colonna di esclusione dimensionale con 60 mL di dH₂O, seguita da 80 mL di tampone congelante (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) per una notte ad una velocità di 0,4 mL/min. Utilizzando i PCN subito dopo la ricostituzione, preparare lo stesso complesso utilizzando quantità 2,5 volte maggiori come segue: miscelare 2.500 μL di NCP [1,2 μM]; 650 μL di tampone legante 5x; 45 μL di MBP-Pol β-APE1 [338 μM] e 55 μL di 3M KCl.
   2. Incubare la miscela su ghiaccio senza reticolante per 15 min. Quindi, aggiungere glutaraldeide a una concentrazione finale dello 0,005% come descritto nel metodo del gel preparativo. In questo caso, tuttavia, concentrare il complesso in un filtro centrifugo pre-equilibrato (con tampone di congelamento) a circa 120 μL.
   3. Analizzare immediatamente le frazioni di picco e concentrare quelle contenenti gli istoni e MBP-Pol β-APE1 come indicato in precedenza. Vedere la Figura 5A,B,C per ottenere risultati positivi utilizzando il metodo di esclusione delle dimensioni e la Figura 7 utilizzando entrambi i metodi.

3. Congelare il complesso nucleosomico

1. Dopo aver acceso il congelatore e riempito l'umidificatore con 50 ml di dH₂O, impostare la temperatura della camera a 22 °C e H_R (umidità) al 98%. Posizionare la tazza di etano e la tazza di azoto liquido (contenente una scatola di griglia etichettata) nei rispettivi supporti di spazio.
2. Coprire la tazza di etano con il dosatore del coperchio di etano e versare con attenzione l'azoto liquido (LN2) su di essa, riempiendo anche la tazza LN 2 con LN₂. Quando il livello di LN₂ si è stabilizzato e raggiunge il 100% e una temperatura di -180 °C, aprire con attenzione la valvola di etano e riempire la tazza di etano fino a formare una bolla sul coperchio trasparente. Rimuovere il dosatore di etano.
3. Posizionare due carte da filtro sul dispositivo assorbente e fissarle con un anello metallico. Vai alla configurazione e utilizza i seguenti parametri per il blotting: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; selezionare A-plunge e fare clic su OK.
4. Nella schermata principale, fai clic su Carica pinze e caricale con una griglia con il lato carbonio / applicazione rivolto verso sinistra (preparato come prima). Calibrare la pinza regolando l'asse Z per garantire una macchia solida. Fare clic su Camera inferiore e applicare 3 μL del complesso (1,3-3 mg/ml; OD₂₈₀). Fare clic su Macchia/A-plunge. Questo ruoterà la griglia per cancellare dalla parte anteriore e immergerà congelarla.
5. Trasferire e conservare la griglia nella scatola della griglia nella camera LN₂ . Quando tutte e quattro le griglie sono state congelate e posizionate nella scatola della griglia, ruotare il coperchio in posizione neutra, dove tutte le griglie sono coperte dal coperchio, e serrare la vite. Le griglie possono essere memorizzate in LN₂ fino all'avvio dello screening.

4. Griglie dello schermo

1. Prima di caricare i campioni al microscopio, posizionare le griglie vetrificate su un anello e fissarle usando una clip a C. Eseguire questo processo di clipping sotto LN₂ in una stanza con umidità controllata, per evitare la contaminazione da ghiaccio.
2. Quando si carica il microscopio, inserire le griglie in una cassetta a 12 slot. Spostare la cassetta in una capsula nanocab e caricarla nell'autoloader. Il meccanismo robotico del caricatore automatico avvia il processo.
3. Trasferire la griglia dalla cassetta allo stadio del microscopio. Regolare lo stadio all'altezza eucentrica oscillando lo stadio di 10° e contemporaneamente spostando l'altezza Z fino a quando non si osserva uno spostamento planare minimo nelle immagini.
4. Una volta raggiunta l'altezza eucentrica, inizia l'imaging. Innanzitutto, ottieni l'atlante scattando un'immagine di montaggio 3 x 3 della griglia, in cui ogni montaggio viene effettuato con un ingrandimento di 62x. Scegli tre quadrati di varie dimensioni; Prendi l'altezza eucentrica e poi l'immagine con ingrandimento 210x.
5. Una volta creata l'immagine di un quadrato, scegliete un foro ciascuno dal bordo, dal centro e tra i quadrati. Immagina ogni foro con un ingrandimento di 2600x.
6. Prima di acquisire questa immagine ad alto ingrandimento, la messa a fuoco automatica avviene con uno scostamento dell'area di imaging. Scatta l'immagine ad alto ingrandimento dal centro del foro con un ingrandimento di 36.000x e un tempo di esposizione di 7,1 s, 60 fotogrammi, dimensioni di 1,18 pixel e sfocatura di 3 μm. Vedere le immagini rappresentative dello screening nella Figura 5, nella Figura 6 e nella Figura 7.

Risultati

NCP correttamente assemblati (Figura 2) sono stati utilizzati per creare un complesso con una proteina di fusione ricombinante di MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Per determinare il rapporto tra NCP e MBP-Polβ-APE1 per formare un complesso stabile, abbiamo eseguito saggi di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) (Figura 4), che hanno mostrato una banda spostata singolarmente del NCP con un eccesso molare di 5 volte di MBP-Pol...

Discussione

Un protocollo specifico per purificare il fattore di riparazione del DNA dipenderà dall'enzima di interesse. Tuttavia, ci sono alcune raccomandazioni generali, tra cui l'uso di metodi ricombinanti per l'espressione e la purificazione delle proteine¹⁸; se la proteina di interesse è troppo piccola (<50 kDa), la determinazione della struttura da parte della crio-EM era stata quasi impossibile fino a tempi più recenti attraverso l'uso di sistemi di fusione¹⁹, scaffold legant...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES; pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15630080
1 M MgCl2	Thermo Fisher Scientific	AM9530G
10x TBE	Bio-rad	1610733
25% glutaraldehyde	Fisher Scientific	50-262-23
3 M KCl	Thermo Fisher Scientific	043398.K2
491 prep cell	Bio-rad	1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)	Millipore Sigma	Z717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)	Millipore Sigma	UFC8030
AutoGrid Tweezers	Ted Pella	47000-600
Automatic Plunge Freezer	Leica	Leica EM GP
C-1000 touch thermocycler	Bio-rad	1851148
C-clips and rings	Thermo Fisher	6640--6640
Clipping station	SubAngostrom	SCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)	Fisher Scientific	15370752
Diamond Tweezers	Techni-Pro	758TW0010
dsDNA	Integrated DNA techonologies	N/A
FEI Titan Krios	Thermo Fisher	KRIOSG4TEM
FPLC purification system	AKTA Pure	29018224
Fraction collector Model 2110	Bio-rad	7318122
Glow Discharge Cleaning System	Ted Pella	91000S
Grid Boxes	SubAngostrom	PB-E
Grid Storage Accessory Pack	SubAngostrom	GSAX
Liquid Ethane	N/A	N/A
Liquid Nitrogen	N/A	N/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pump	Gilson	F155008
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	EC6695BOX
Pipetman	Gilson	FA10002M
Pipette tips (VWR) Low Retention	VWR	76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1)	Bio-rad	1610158
polyethylene glycol (PEG)	Millipore Sigma	P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500	Millipore Sigma	PURX35050
Purified recombinant DNA repair factor	N/A	N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids	Quantifoil	N1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamer	N/A	N/A
Spring clipping tools	SubAngostrom	CSA-01
Superdex 200 column 10/300	Millipore Sigma	GE28-9909-44
Transmission Electron Microscope	Thermo Fisher	Talos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I	Ted Pella	47000-500
UltraPure Glycerol	Thermo Fisher Scientific	15514011
Vitrobot	Thermo Fisher	Mark IV System
Whatman Filter paper (55 mM)	Cytiva	1005-055
Xylene cyanol	Thermo Fisher Scientific	440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL	Thermo Fisher Scientific	89877