Preparazione di particelle nucleosomiche complessate con fattori di riparazione del DNA per la determinazione strutturale della microscopia crioelettronica

Riepilogo

Questo protocollo delinea in dettaglio la preparazione di complessi nucleosomiali utilizzando due metodi di preparazione del campione per il congelamento delle griglie TEM.

Abstract

La riparazione del DNA nel contesto della cromatina è poco conosciuta. Studi biochimici che utilizzano particelle nucleosomiche del nucleosoma, l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina, mostrano che la maggior parte degli enzimi di riparazione del DNA rimuove il danno al DNA a tassi ridotti rispetto al DNA libero. I dettagli molecolari su come gli enzimi di riparazione dell'escissione di base (BER) riconoscono e rimuovono il danno al DNA nei nucleosomi non sono stati chiariti. Tuttavia, i dati biochimici BER dei substrati nucleosomiali suggeriscono che il nucleosoma presenta diverse barriere strutturali a seconda della posizione della lesione del DNA e dell'enzima. Ciò indica che i meccanismi impiegati da questi enzimi per rimuovere il danno al DNA nel DNA libero possono essere diversi da quelli impiegati nei nucleosomi. Dato che la maggior parte del DNA genomico è assemblato in nucleosomi, sono necessarie informazioni strutturali di questi complessi. Ad oggi, la comunità scientifica manca di protocolli dettagliati per eseguire studi strutturali tecnicamente fattibili di questi complessi. Qui, forniamo due metodi per preparare un complesso di due enzimi BER geneticamente fusi (polimerasi β e AP Endonucleasi1) legati a un gap a singolo nucleotide vicino all'entrata-uscita del nucleosoma per la determinazione strutturale della crio-microscopia elettronica (crio-EM). Entrambi i metodi di preparazione del campione sono compatibili per la vetrificazione di griglie di qualità tramite congelamento a tuffo. Questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per preparare altri complessi nucleosomiali con diversi fattori BER, fattori di trascrizione pionieristici ed enzimi modificanti la cromatina.

Introduzione

Il DNA eucariotico è organizzato e compattato dalle proteine istoniche, formando la cromatina. La particella nucleosomica (NCP) costituisce l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina che regola l'accessibilità alle proteine leganti il DNA per la riparazione, la trascrizione e la replicazione del DNA¹. Sebbene la prima struttura cristallina a raggi X del PCN sia stata risolta per la prima volta più di due decenni fa² e molte altre strutture del PCN siano state pubblicate da 3,4,5,6^, i mecca....

Protocollo

1. Assemblare le particelle del nucleo del nucleosoma tramite dialisi salina

NOTA: La preparazione di particelle nucleosomiche utilizzando proteine istoniche ricombinanti per studi strutturali è stata ampiamente descritta in dettaglio da altri^14,15,16. Seguire la purificazione degli istoni ricombinanti di X. laevis e dell'assemblaggio di ottameri istonici descritti da altri^14,15 e assemblare il substrato nucleosomico come descritto di seguito.

1. Acquistare ....

Risultati

NCP correttamente assemblati (Figura 2) sono stati utilizzati per creare un complesso con una proteina di fusione ricombinante di MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Per determinare il rapporto tra NCP e MBP-Polβ-APE1 per formare un complesso stabile, abbiamo eseguito saggi di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) (Figura 4), che hanno mostrato una banda spostata singolarmente del NCP con un eccesso molare di 5 volte di MBP-Pol.......

Discussione

Un protocollo specifico per purificare il fattore di riparazione del DNA dipenderà dall'enzima di interesse. Tuttavia, ci sono alcune raccomandazioni generali, tra cui l'uso di metodi ricombinanti per l'espressione e la purificazione delle proteine¹⁸; se la proteina di interesse è troppo piccola (<50 kDa), la determinazione della struttura da parte della crio-EM era stata quasi impossibile fino a tempi più recenti attraverso l'uso di sistemi di fusione¹⁹, scaffold legant.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES; pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15630080
1 M MgCl2	Thermo Fisher Scientific	AM9530G
10x TBE	Bio-rad	1610733
25% glutaraldehyde	Fisher Scientific	50-262-23
3 M KCl	Thermo Fisher Scientific	043398.K2
491 prep cell	Bio-rad	1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)	Millipore Sigma	Z717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)	Millipore Sigma	UFC8030
AutoGrid Tweezers	Ted Pella	47000-600
Automatic Plunge Freezer	Leica	Leica EM GP
C-1000 touch thermocycler	Bio-rad	1851148
C-clips and rings	Thermo Fisher	6640--6640
Clipping station	SubAngostrom	SCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)	Fisher Scientific	15370752
Diamond Tweezers	Techni-Pro	758TW0010
dsDNA	Integrated DNA techonologies	N/A
FEI Titan Krios	Thermo Fisher	KRIOSG4TEM
FPLC purification system	AKTA Pure	29018224
Fraction collector Model 2110	Bio-rad	7318122
Glow Discharge Cleaning System	Ted Pella	91000S
Grid Boxes	SubAngostrom	PB-E
Grid Storage Accessory Pack	SubAngostrom	GSAX
Liquid Ethane	N/A	N/A
Liquid Nitrogen	N/A	N/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pump	Gilson	F155008
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	EC6695BOX
Pipetman	Gilson	FA10002M
Pipette tips (VWR) Low Retention	VWR	76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1)	Bio-rad	1610158
polyethylene glycol (PEG)	Millipore Sigma	P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500	Millipore Sigma	PURX35050
Purified recombinant DNA repair factor	N/A	N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids	Quantifoil	N1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamer	N/A	N/A
Spring clipping tools	SubAngostrom	CSA-01
Superdex 200 column 10/300	Millipore Sigma	GE28-9909-44
Transmission Electron Microscope	Thermo Fisher	Talos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I	Ted Pella	47000-500
UltraPure Glycerol	Thermo Fisher Scientific	15514011
Vitrobot	Thermo Fisher	Mark IV System
Whatman Filter paper (55 mM)	Cytiva	1005-055
Xylene cyanol	Thermo Fisher Scientific	440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL	Thermo Fisher Scientific	89877