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要約

このプロトコルは、TEMグリッドを凍結するためのサンプル調製の2つの方法を使用したヌクレオソーム複合体の調製について詳細に概説しています。

要約

クロマチンの文脈でのDNA修復はよく理解されていません。クロマチンの基本繰り返し単位であるヌクレオソームコア粒子を用いた生化学的研究では、ほとんどのDNA修復酵素が遊離DNAと比較してDNA損傷を減少した速度で除去することが示されています。塩基除去修復(BER)酵素がヌクレオソームのDNA損傷をどのように認識して除去するかについての分子の詳細は解明されていません。しかし、ヌクレオソーム基質の生化学的BERデータは、ヌクレオソームがDNA病変の位置と酵素に応じて異なる構造障壁を提示することを示唆しています。これは、遊離DNAのDNA損傷を除去するためにこれらの酵素によって使用されるメカニズムが、ヌクレオソームで採用されているメカニズムとは異なる可能性があることを示しています。ゲノムDNAの大部分がヌクレオソームに集合していることを考えると、これらの複合体の構造情報が必要です。今日まで、科学界はこれらの複合体の技術的に実行可能な構造研究を実行するための詳細なプロトコルを欠いています。ここでは、クライオ電子顕微鏡(クライオEM)構造決定のために、ヌクレオソームの出入り付近の一塩基ギャップに結合した2つの遺伝子融合BER酵素(ポリメラーゼβとAPエンドヌクレアーゼ1)の複合体を調製する2つの方法を提供します。どちらのサンプル調製方法も、プランジ凍結 による 品質グリッドのガラス化に対応しています。このプロトコルは、異なるBER因子、パイオニア転写因子、およびクロマチン修飾酵素を有する他のヌクレオソーム複合体を調製するための出発点として使用できます。

概要

真核生物のDNAはヒストンタンパク質によって組織化および圧縮され、クロマチンを形成します。ヌクレオソームコア粒子(NCP)は、DNA修復、転写、および複製のためのDNA結合タンパク質へのアクセスを調節するクロマチンの基本的な繰り返し単位を構成します1。NCPの最初のX線結晶構造は20年以上前に最初に解決され2、3,4,5,6以降、NCPの構造はさらに多くのものが発表されていますが、ヌクレオソーム基質のDNA修復メカニズムはまだ解明されていません。クロマチンのDNA修復の根底にある分子の詳細を明らかにするには、NCPの局所的な構造的特徴がDNA修復活性をどのように調節しているかを理解するために、関与する成分の構造特性評価が必要です。BER酵素を用いた生化学的研究により、触媒作用のための酵素特異的構造要件およびヌクレオソーム内のDNA病変の構造位置に依存するヌクレオソーム内のユニークなDNA修復メカニズムが示唆されていることを考えると、これは塩基除去修復(BER)の文脈において特に重要である7,8,9,10,11,12,13。.BERが重要なDNA修復プロセスであることを考えると、これらのギャップを埋めると同時に、関連するヌクレオソーム複合体を含む他の技術的に実行可能な構造研究を実施できる出発点を確立することにかなりの関心があります。

クライオ電子顕微鏡は、均質なサンプルの大規模な調製が困難な複合体の3次元(3D)構造を解くための選択方法に急速になりつつあります。DNA修復因子(NCP-DRF)と複合体を形成したNCPの設計と精製には、カスタマイズされた最適化が必要になる可能性がありますが、安定したNCP-DRF複合体を生成および凍結するためのここで紹介する手順では、サンプルとクライオEMグリッド調製を最適化する方法の詳細を説明します。 図 1 に示す 2 つのワークフロー (相互に排他的ではありません) とプロトコルの具体的な詳細は、重要なステップを識別し、これらのステップを最適化するための戦略を提供します。この研究は、ヌクレオソームDNA修復の分子メカニズムをよりよく理解するために、構造研究で生化学的に補完することが技術的に実現可能になる方向にクロマチンとDNA修復分野を推進します。

プロトコル

1. 塩析透析によるヌクレオソームコア粒子のアセンブル化

注:構造研究のための組換えヒストンタンパク質を用いたヌクレオソームコア粒子の調製は、他の14,15,16によって詳細に説明されています。14、15他に記載の組換えX. laevisヒストンおよびヒストン八量体アセンブリの精製に従い、以下に記載されるようにヌクレオソーム基質をアセンブルする。

  1. 示されたスケールで3つのオリゴヌクレオチド( 表1に記載)を購入します:UND-197mer、161mer、35mer。
    1. PAGEは、17に記載のウルトラマー(197merおよび161mer)を精製する。
      1. 1xアニーリングバッファー(10 mM Tris-Cl、pH 8.0、50 mM NaCl)中の等モル量のオリゴヌクレオチドのアニール。例えば、40 μLの161量体[166.7 μM]を混合します。8 μL の 35 量体 [292.4 μM];16.8 μL の 197 量体コンプストランド [408.2 μM];10 μLの10xアニールバッファーと10.9 μLのdH2O。
        注:アニーリング反応を温度勾配で制御することが重要です。温度勾配の詳細については 、表2 を参照してください。
  2. 少量の再構成(最終容量50 μLの場合、以下に示す例の1/57倍のスケール)を実行して、DNAとヒストン八量体の比率を決定します(DNA:八量体の典型的な開始比は次のとおりです:1:0.9、1:1.1、1:1.2、1:2; 図2Aを参照)。この比率は、小規模な再構成で経験的に決定することが重要です。
    1. この比率が決定されたら、大規模な再構成を準備します。例えば、32.9 μL の DNA-197 bp [99.4 μM] を混合します。1647.1 μL の TE (1x);1120 μLの5 M NaCl、および62.3 μLのWTヒストン八量体[2.56 μM]。
  3. 透析バッファーを作る:表3と表4に記載されているように、それぞれRB低とRB高。前述のように再構成を設定します14.
    1. 透析チューブをRBハイを含むビーカーに移し、穏やかに攪拌しながら、16時間、または2 L RBロー が廃ビーカーに移されるまで透析を進行させます。
  4. 透析チューブをRB50mM バッファー(表5)を含む1 Lビーカーに移し、サンプルを少なくとも3時間または一晩透析します。
    1. 6%ポリアクリルアミド非変性ゲルの再構成効率を評価し、10%未満の遊離DNAと単一のNCPバンドがあることを確認します。NCPは4°Cで保存してください。 代表的な最適な再構成結果については、図 2A (レーン5)および 図2B を参照してください。

2. NCP-DNA修復因子複合体(NCP-DRF)を調製する

  1. 分取ゲル電気泳動による精製
    注:この方法は(説明されている2つのうち)最も労働集約的であり、高分子量(HMW)種(図 6A)希釈係数が高いため、に示すように分解が発生する可能性があります 図 7A (NCP調製セルアウトレーン)、DNAを放出する。ただし、最大25%の遊離DNAは、クライオEM研究と互換性があります。希釈率が高いため、この方法を使用して、複合体全体ではなくNCPのみを精製します。
    1. ポリアクリルアミドゲル溶液37.5:1、アクリルアミド:ビスアクリルアミドを使用して、0.2x TBE中の6%非変性ポリアクリルアミドゲル溶液70 mLを調製します。外半径28 mmの円筒形ゲルを注ぎ、一晩重合します。
    2. 6〜8 kDaのMWカットオフを有する透析膜を使用して、分取ゲル実行装置を組み立てる。ランニングバッファーとして0.25x TBEを使用し、1x 溶出バッファー(50 mM KCl、10 mM HEPES、pH 7.5)を使用します。円筒形ゲルを一定の12 Wで1時間事前に実行し、蠕動ポンプを約1 mL / minの流量で作動させている画分を収集します。
      注:UV検出器を使用してDNAを含む画分を同定できない場合は、 32P-NCPを使用したスクリーニング実験を実行して、目的の画分を同定できます。すべての条件を同じに保つことで、標識されていないNCPはUV検出器なしで精製できます。
    3. 遠心フィルター(MWカットオフ30 kDa)を使用して2.8 mLのNCPを250 μLに濃縮し、分取ゲルと電気泳動に合計6時間ロードします。2時間後、キシレンシアノールがゲルからなくなったら、1.5mL画分の収集を開始します。
      注:2.5時間で、フラクションはキシレンシアノールがなくなります。DNA(197mer)は約3〜3.5時間で溶出し、NCPは4.5〜5時間で溶出すると予想されます。
    4. 6%非変性ポリアクリルアミドゲルで目的の画分を分析します。NCPを含む画分をプールし、直ちに遠心フィルター(MWカットオフ30kDa)で1mg/mLまで濃縮する。翌日、目的のDNA修復因子(DRF)と複合体形成する前に、6%ポリアクリルアミド非変性ゲルでNCPの品質を評価します。
    5. NCPと目的のDRFを氷上で、特定の複合体に最適なバッファーを使用して15分間インキュベートします。例えば、1,000 μL の NCP [1.2 μM] を混合します。260 μLの5x結合バッファー(250 mM HEPES、pH 8、500 mM KCl、25 mM MgCl2)、22 μLの3 M KCl、および18 μLのMBP-Pol β-APE1 [338 μM]。
      注:錯体が作られる温度とイオン強度は、異なる錯体に対して最適化が必要な場合があります。
    6. グルタルアルデヒドを追加します(開封したて;EMグレード)を最終濃度0.005%まで。したがって、この反応に、26.8 μLの0.25%グルタルアルデヒドと13.2 μLのdH2Oを加え、よく混合し、室温で13分間インキュベートします。
    7. 1 M トリス-Cl、pH 7.5、終濃度20 mM Tris-Cl、pH 7.5までクエンチします。~50 μLまで濃縮し、脱塩カラムを使用して1x凍結バッファー(50 mM KCl、10 mM HEPES、pH 7.5)でバッファーを交換します。
      注意: グルタルアルデヒドは、重度の皮膚火傷や目の損傷を引き起こす可能性があります。飲み込むと有害であり、吸入すると有毒です。白衣、ゴーグル、手袋を着用し、ヒュームフードでグルタルアルデヒドを処理し、マスクを着用してください。
      注:この低濃度のNCPと架橋反応を大量に行うことが重要です。架橋の以前の試みは、この濃度のグルタルアルデヒドでさえ、しかし10倍高い濃度のNCPでは、SDS PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって示されるように、サンプルの凝集および過剰架橋をもたらした。これらのグリッドには、塊だけの識別可能な粒子はありませんでした(図5D、E)。
    8. OD 280およびOD260の吸光度を決定し、必要に応じてOD280に基づいて1.3〜3 mg / mLに達するようにさらに濃縮します(OD260 / OD 280 = 1.7-2の典型的な比率は良好な粒子を生成します)。 この50μLの小容量の場合、サンプル損失を減らす最良の方法は、透析膜(6〜8 kDa MWカットオフ)で覆われた1.7 mLチューブの蓋付きの透析ボタンを作成し、チューブの底部を切断し、チューブのリムを使用して蓋の上部にあるメンブレンをシールすることです。
    9. サンプルを含む透析ボタンをポリエチレングリコールベッドの上に置き、膜を下に向けてください(2分ごとに進行状況を確認します)。この方法は、濃縮器でサンプルが希釈または失われるのを避けるために、必要な濃度が2.5倍以下の場合に推奨されます。このステップの後、複合体のクライオEMグリッドを直ちに準備することが重要です。
  2. サイズ排除クロマトグラフィーによる精製
    1. 凍結の前日に、サイズ排除カラムを60 mLのdH2Oで洗浄し、平衡化した後、80 mLの凍結バッファー(50 mM KCl、10 mM HEPES、pH 8)を0.4 mL/minの速度で一晩平衡化します。再構成直後にNCPを使用して、次のように2.5倍の量を使用して同じ複合体を調製します:2,500 μLのNCP [1.2 μM]を混合します。650 μLの5x結合バッファー;45 μL のMBP-Pol β-APE1 [338 μM] および 55 μL の 3M KCl
    2. 混合物を架橋剤なしで氷上で15分間インキュベートします。次いで、グルタルアルデヒドを、分取ゲル法に記載されるように最終濃度0.005%となるように添加する。ただし、この場合は、事前に平衡化された(凍結バッファーを含む)遠心フィルターで複合体を約120 μLまで濃縮します。
    3. ピーク画分を直ちに分析し、前述のようにヒストンとMBP-Pol β-APE1を含む画分を濃縮します。サイズ除外法を使用した場合の正常な結果については 、図 5A、B、C および両方の方法を使用した 場合の図 7 を参照してください。

3.ヌクレオソーム複合体を凍結する

  1. プランジフリーザーの電源を入れ、加湿器に50mLのdH2Oを充填した後、チャンバー温度を22°C、HR( 湿度)を98%に設定します。エタンカップと液体窒素カップ(ラベル付きのグリッドボックスを含む)をそれぞれのスペースホルダーに入れます。
  2. エタンカップをエタン蓋ディスペンサーで覆い、その上に液体窒素(LN2)を慎重に注ぎ、LN2 カップにLN2を満たします。LN2 レベルが安定して100%に達し、温度が-180°Cになったら、エタンバルブを慎重に開き、透明な蓋に気泡が形成されるまでエタンカップを満たします。エタンディスペンサーを取り外します。
  3. 2枚のろ紙を吸い取り装置の上に置き、金属リングで固定します。セットアップに移動し、ブロッティングに次のパラメーターを使用します:0プレブロット、3秒ブロット、0ポストブロット; Aプランジ を選択し、[ OK]をクリックします。
  4. メイン画面で、Load Forcepsをクリックし、カーボン/塗布側を左に向けてグリッドをロードします(前と同じように準備しました)。Z軸を調整して鉗子を調整し、しっかりとしたしみを確保します。 下部チャンバー をクリックし、3 μLの複合体(1.3-3 mg / mL;OD280)。 ブロット/Aプランジをクリックします。これにより、グリッドが回転して正面から吸い取られ、急落してフリーズします。
  5. グリッドを移し、LN2 チャンバーのグリッドボックスに保管します。4つのグリッドすべてが凍結してグリッドボックスに配置されたら、すべてのグリッドが蓋で覆われているニュートラル位置に蓋を回転させ、ネジを締めます。グリッドは、スクリーニングが開始されるまで LN2 に保管できます。

4.スクリーングリッド

  1. サンプルを顕微鏡にロードする前に、ガラス化グリッドをリング上に置き、Cクリップを使用して固定します。氷の汚染を避けるために、湿度管理された部屋でLN2 の下でこのクリッピングプロセスを実行します。
  2. 顕微鏡をロードするときは、グリッドを12スロットカセットに挿入します。カセットをナノキャブカプセルにシャトルし、オートローダーにロードします。オートローダのロボット メカニズムがプロセスを開始します。
  3. グリッドをカセットから顕微鏡ステージに移します。ステージを10°ぐらつき、同時に画像に最小の平面シフトが観察されるまでZ高さを移動して、ステージをユーセントリック高さに調整します。
  4. ユーセントリックの高さに達したら、イメージングを開始します。まず、グリッドの3 x 3モンタージュ画像を撮影し、各モンタージュを62倍の倍率で撮影してアトラスを取得します。さまざまなサイズの3つの正方形を選びます。ユーセントリックの高さを取り、210倍の倍率で画像化します。
  5. 正方形が画像化されたら、正方形内のエッジ、中央、およびその間のそれぞれから1つの穴を選択します。各穴を2600倍の倍率で画像化します。
  6. この高倍率画像を撮影する前に、オートフォーカスは撮像領域のオフセットで発生します。穴の中心から36,000倍の倍率、7.1秒の露光時間、60フレーム、1.18ピクセルサイズ、3μmのデフォーカスで高倍率の画像を撮影します。スクリーニングの代表的な画像を図5、図6、および図7に参照してください。

結果

適切に組み立てられたNCP(図2)を使用して、MBP-Polβ-APE1の組換え融合タンパク質との複合体を作成しました(図3)。安定な複合体を形成するためのNCPとMBP-Polβ-APE1の比率を決定するために、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)(図4)を実施し、MBP-Polβ-APE1の5倍モル過剰でNCPの単一シフトバンドを示しました。この複合体を作る最適化...

ディスカッション

DNA修復因子を精製するための特定のプロトコルは、目的の酵素に依存するであろう。ただし、タンパク質の発現と精製のための組換え法の使用など、いくつかの一般的な推奨事項があります18。目的のタンパク質が小さすぎる(<50 kDa)場合、クライオEMによる構造決定は、融合システム19、ナノボディ結合足場20、およびイメージング戦略の?...

開示事項

著者は競合する利益を宣言しません。

謝辞

国立環境衛生科学研究所のクライオEMコアのマリオ・ボルニア博士とノースカロライナ大学チャペルヒル校のジョシュア・ストラウス博士のクライオEMグリッド準備の指導とトレーニングに感謝します。また、このプロジェクトの初期段階での技術支援を提供してくれたジュリアナ・メロ・ダ・フォンセカ・レゼンデ博士にも感謝します。故サミュエル・H・ウィルソン博士と彼の研究室メンバー、特にラジェンドラ・プラサド博士とヨーナス・ジャムセン博士の遺伝的融合APE1-Polβ複合体の精製に対する重要な貢献と支援に感謝します。国立衛生研究所 国立環境衛生研究所 学内研究プログラム[課題番号 Z01ES050158, Z01ES050159, K99ES031662-01]の支援を受けています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M HEPES; pH 7.5Thermo Fisher Scientific15630080
1 M MgCl2Thermo Fisher ScientificAM9530G
10x TBEBio-rad1610733
25% glutaraldehydeFisher Scientific50-262-23
3 M KClThermo Fisher Scientific043398.K2
491 prep cellBio-rad1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)Millipore SigmaZ717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa)Millipore SigmaUFC8030
AutoGrid TweezersTed Pella47000-600
Automatic Plunge FreezerLeicaLeica EM GP
C-1000 touch thermocyclerBio-rad1851148
C-clips and ringsThermo Fisher6640--6640
Clipping stationSubAngostromSCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa)Fisher Scientific15370752
Diamond TweezersTechni-Pro758TW0010
dsDNAIntegrated DNA techonologiesN/A
FEI Titan KriosThermo FisherKRIOSG4TEM
FPLC purification systemAKTA Pure29018224
Fraction collector Model 2110Bio-rad7318122
Glow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S
Grid BoxesSubAngostromPB-E
Grid Storage Accessory PackSubAngostromGSAX
Liquid EthaneN/AN/A
Liquid NitrogenN/AN/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pumpGilsonF155008
NanodropThermo Fisher ScientificND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein GelsThermo Fisher ScientificEC6695BOX
PipetmanGilsonFA10002M
Pipette tips (VWR) Low RetentionVWR76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1)Bio-rad1610158
polyethylene glycol (PEG)Millipore SigmaP4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500Millipore SigmaPURX35050
Purified recombinant DNA repair factorN/AN/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh GridsQuantifoilN1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamerN/AN/A
Spring clipping toolsSubAngostromCSA-01
Superdex 200 column 10/300Millipore SigmaGE28-9909-44
Transmission Electron MicroscopeThermo FisherTalos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-ITed Pella47000-500
UltraPure GlycerolThermo Fisher Scientific15514011
VitrobotThermo FisherMark IV System
Whatman Filter paper (55 mM)Cytiva1005-055
Xylene cyanolThermo Fisher Scientific440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µLThermo Fisher Scientific89877

参考文献

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