Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus desplegable en campo mediante amplificación de polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a

Resumen

En este trabajo, se desarrolló un método de detección rápido, sensible y portátil para Candidatus Liberibacter asiaticus basado en la amplificación de la polimerasa recombinasa combinada con CRISPR-Cas12a.

Resumen

La detección temprana de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por los productores de cítricos facilita la intervención temprana y previene la propagación de la enfermedad. Aquí se presenta un método simple para el diagnóstico rápido y portátil de Huanglongbing (HLB) que combina la amplificación de la polimerasa recombinasa y un reportero fluorescente que utiliza la actividad nucleasa del sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas / 12a asociado a CRISPR (CRISPR-Cas12a). La sensibilidad de esta técnica es mucho mayor que la PCR. Además, este método mostró resultados similares a la qPCR cuando se utilizaron muestras de hojas. En comparación con los métodos de detección de CLas convencionales, el método de detección presentado aquí se puede completar en 90 minutos y funciona en una condición isotérmica que no requiere el uso de máquinas de PCR. Además, los resultados se pueden visualizar a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil en el campo.

Introducción

Huanglongbing (HLB) es una de las enfermedades de los cítricos más problemáticas en todo el mundo¹. El HLB es causado por la bacteria colonizadora de floemas y fastidiosa Candidatus Liberibacter spp., incluyendo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus y Ca. L. americanus² . La especie asociada al HLB más prevalente en China y los EE.UU. es CLas, que se transmite por psílidos asiáticos de los cítricos (Diaphorina citri) o a través de injertos³. Después de ser infectados por CLas, los árboles de cítricos muestran una disminución del crecimiento hasta la muerte². Los síntomas comunes de las hojas de cítricos infectadas con CLas son moteado con manchas, islas verdes (pequeños puntos circulares de color verde oscuro), venas corchosas elevadas en hojas más gruesas y coriáceas, y brotes amarillentos no uniformes². Además, las frutas infectadas con CLas aparecen pequeñas y desequilibradas².

Dado que ninguna variedad de cítricos es resistente al HLB y no existe cura terapéutica para el HLB, la prevención del HLB requiere la cuarentena y el aislamiento de los cítricos CLas-positivos ^2,3. Por lo tanto, la detección temprana es crítica para el monitoreo y la cuarentena para prevenir la propagación de CLas y minimizar las pérdidas económicas³. Además, se necesita la detección sensible de CLas debido al bajo título de CLas en las plantas durante la etapa temprana de la infección³. En China, la detección de CLas generalmente es realizada por ciertos centros de prueba certificados. Sin embargo, el proceso de detección generalmente toma al menos 1 semana, y la tarifa de detección es costosa. Por lo tanto, para ayudar a monitorear la incidencia de HLB

Se han aplicado diversas tecnologías para diagnosticar HLB 4,5,6,7,8,9. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR cuantitativa (qPCR) son las herramientas más utilizadas para la detección de CLas debido a su alta sensibilidad y especificidad ^4,5. Sin embargo, esas tecnologías dependen en gran medida de instrumentos costosos y personal altamente calificado. Además, varios métodos de amplificación isotérmica, como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), han sido desarrollados como alternativas atractivas a los métodos convencionales de PCR debido a su simplicidad, rapidez y bajo costo ^8,9,10. Sin embargo, es difícil aplicarlos para detectar con precisión CLas debido a las señales de amplificación no específicas, que pueden causar resultados falsos positivos.

La detección de ácidos nucleicos basada en endonucleasa basada en CRISPR/Cas (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas regularmente / asociadas a CRISPR) se ha desarrollado como una tecnología de diagnóstico molecular de próxima generación debido a su alta sensibilidad, especificidad y confiabilidad^11,12,13,14. Estas tecnologías de diagnóstico CRISPR/Cas se basan en la actividad nucleasa colateral de las proteínas Cas para escindir ADN monocatenario (ssDNA) modificado con un reportero fluorescente y un extintor de fluorescencia en cada extremo de los oligonucleótidos, así como un dispositivo de detección de fluorescencia para capturar el reportero fluorescente liberado^11,12 . La actividad nucleasa de varios efectores Cas activados por el dúplex diana de ARN CRISPR (crRNA) puede escindir indiscriminadamente el ssDNA¹¹ circundante no diana. CRISPR-Cas12a (también llamado Cpf 1), un sistema CRISPR/Cas de clase 2 tipo V-A, demuestra varias ventajas en comparación con Cas9, como una menor tolerancia al desajuste y una mayor especificidad¹³. El sistema Cas12a/crRNA ha sido aplicado para la detección sensible y específica de los ácidos nucleicos de patógenos humanos y fitopatógenos 14,15,16,17,18. Por lo tanto, la utilización del sistema Cas12a / crRNA debería permitir la detección precisa y sensible del ácido nucleico de CLas.

Cas12a solo no es teóricamente lo suficientemente sensible como para detectar niveles bajos de ácidos nucleicos. Por lo tanto, para mejorar su sensibilidad de detección, la detección de CRISPR-Cas12a se combina típicamente con un paso de amplificación isotérmica^14,15. La amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) permite la amplificación isotérmica sensible y rápida del ADN en un rango de temperatura de 37 °C a 42 °C¹⁹.

Una plataforma de detección llamada DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) que combina la actividad DNasa de Cas12a con RPA y una lectura de fluorescencia ha sido ideada recientemente¹² y se ha demostrado que detecta ácido nucleico con mayor sensibilidad²⁰. Además, la señal de fluorescencia emitida por las muestras positivas se puede observar a través de un dispositivo portátil de detección de fluorescencia en el campo.

Dado que amplificamos el ADN con RPA, diseñamos crRNA dirigido al gen nrdB (ribonucleonucleotide reductase β- subunidad) de cinco copias específico para CLas²¹, y empleamos la actividad DNasa de la proteína Cas12a, llamamos a este método de detección CLas CLas-DETECTR. En comparación con los métodos de detección de CLas existentes, CLas-DETECTR es rápido, preciso, sensible e implementable.

Protocolo

1. Construcción del CLas-DETECTR

NOTA: La construcción de CLas-DETECTR es un proceso de cuatro pasos: preparación de la solución, aislamiento de ADN total cítrico, amplificación isotérmica del ADN y visualización de resultados. El esquema del ensayo CLas-DETECTR se ilustra en la Figura 1A.

1. Preparación de la solución
   1. Preparar el tampón A: 20 mM NaOH en 6% PEG 200. Para 100 ml, agregue 113 mg de NaOH y 6 g de PEG 200 en 80 ml de_H2Oen una botella. Incubar el frasco en un baño maría a 60 °C hasta que se disuelva todo el PEG 200. Luego, agregue_H2Oa un volumen de 100 ml.
   2. Preparar la solución B: Para cada reacción, añadir 10 μL de tampón RPA, 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr y 3,9 μL de_ddH2Oa un volumen final de 15,5 μL.
      NOTA: F-RPA-RNRf y R-RPA-RNRr son los cebadores utilizados en el ensayo contra el gen nrdB . Consulte la Tabla 1 para la secuencia.
   3. Preparar la solución C: Para cada reacción, añadir 1 μL de ssDNA reporter, 3 μL de tampón NEB 3.1, 1 μL de crRNA, 4 μL de Cas12a y 11 μL de_ddH2Oa un volumen final de 20 μL.
      NOTA: Si hay muchas muestras para detectar, haga un gran volumen de solución B y solución C, y alícuota más tarde.
2. Aislamiento de ADN total de cítricos
   NOTA: Para ahorrar tiempo y hacer que este método sea adecuado para la detección de CLas de campo, se utilizó el enfoque basado en polietilenglicol alcalino (PEG) para obtener extractos de plantas crudas para la amplificación de ADN^22,23
   1. Las hojas de cítricos se utilizaron en este protocolo. Primero, perfore cinco discos de hojas de una hoja. A continuación, coloque los discos de hoja en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y agregue 200 μL de tampón A.
      NOTA: En el campo, limpie las hojas primero si hay polvo cubriéndolas. Los discos de las hojas se pueden recortar utilizando la tapa del tubo de 1,5 ml para evitar la contaminación cruzada. Otros tejidos cítricos, como raíces, tallos, frutas y flores, también se pueden usar en este protocolo.
   2. Moler los discos de hojas manualmente hasta que queden suaves con una varilla de plástico.
   3. Deje el tubo sin molestias durante 10 minutos. Luego, use el sobrenadante para la amplificación del ADN.
      NOTA: El ensayo se puede pausar aquí, y los extractos de plantas crudas que se extrajeron por el método alcalino-PEG se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos 1 año. Los árboles de naranja dulce Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) que se muestran en el video se cultivaron en una maceta llena de una mezcla de tierra de turba / vermiculita / perlita 9/3/1 (v / v / v) y se mantuvieron en un invernadero ubicado en el campus de la Universidad Normal de Gannan, Jiangxi, China. Los árboles infectados con HLB fueron inoculados por injerto con brotes de Newhall positivos para CLas. Los árboles infectados con HLB y no infectados con HLB fueron confirmados por PCR. CLas se detectó utilizando el par de cebadores (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) dirigido al gen marcador específico de CLas nrdB. Por otro lado, los síntomas característicos de HLB, moteado con manchas y hojas amarillentas se pueden encontrar en árboles CLas-positivos pero no en CLas-negativos.
3. Amplificación isotérmica del ADN
   1. Añadir 1 μL del sobrenadante de la etapa 1.2.3 y 1 μL de MgOAc (concentración final de 14 mM) en la solución B y mezclar bien.
   2. En el laboratorio, incubarlos en una incubadora simple a 37 °C durante 15 min.
      NOTA: En el campo, sostenga los tubos en la mano durante 15 minutos. También se sugiere incubar tubos en una incubadora simple a 37 °C durante 15 min si las condiciones lo permiten.
4. Visualización de resultados
   1. Añadir 10 μL de la mezcla del paso 1.3.2 en la solución C y mezclar bien.
   2. Incubarlos en una incubadora a 37 °C durante 60 min.
   3. Use gafas y observe la señal de fluorescencia verde liberada por el reportero ssDNA etiquetado con 5' 6-fluoresceína a 5' y el apagador de fluorescencia a 3' a través de un dispositivo de detección fluorescente portátil (longitud de onda de excitación: 440 nm, longitud de onda de emisión: 500 nm).
      NOTA: la señal de fluorescencia verde puede durar varios días, es mejor
      PRECAUCIÓN: La luz emitida por el dispositivo de detección de fluorescencia es perjudicial para los ojos. Asegúrese de usar gafas antes de observar los resultados.

2. Prueba de especificidad

NOTA: Para probar la especificidad de CLas-DETECTR, la bacteria de la rizosfera Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) y Burkholderia stabilis cepa 1440 aislada en el laboratorio²⁴ se sometieron a la prueba CLas-DETECTR.

NOTA: Candidatus Liberibacter (CLas) no se puede cultivar. Solo se puede obtener ADN CLas a partir de la extracción de ADN genómico de tejidos cítricos infectados con CLas. Xcc es el agente causal de otra importante enfermedad de los cítricos, el cancro de los cítricos. Burkholderia stabilis cepa 1440 es una bacteria anti-Xcc aislada en el laboratorio. Por lo tanto, se utilizaron cepas puras para estas tres bacterias.

1. Extraiga el ADN genómico bacteriano (ADNg) utilizando un kit de extracción de ADN genómico bacteriano siguiendo el protocolo del fabricante. Use el agua como un control negativo.
2. Realizar PCR utilizando tiras de tubo de PCR de 0,2 ml con tapas ópticas en una mezcla de reacción de 25 μL que contiene 1 μL de F-RPA-RNRf, 1 μL de R-RPA-RNRr, 12,5 μL de Ex Taq Versión 2.0 más colorante, 1 μL de plantilla de ADN y 9,5 μL de_H2O.
   1. Utilice las siguientes condiciones de reacción de ciclo térmico: 1 min a 98 °C; seguido de 35 ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 55 °C y 15 s a 72 °C; luego 10 min a 72 °C; y mantener a 16 °C.
   2. Ejecute los productos de PCR en gel de agarosa al 1% a 120 V durante 15 min.
3. Realizar qPCR en una mezcla de reacción de 20 μL que contiene 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr, 10 μL de 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL de la plantilla de ADN y 7,4 μL de_H2O.
   1. Utilice las siguientes condiciones de reacción de ciclo térmico: 30 s a 95 °C; seguido de 45 ciclos de 5 s a 95 °C y 32 s a 60 °C; y luego una etapa de curva de fusión de 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C y 15 s a 95 °C.
   2. Incluye tres repeticiones técnicas en cada repetición.
4. Realice el método CLas-DETECTR siguiendo los pasos 1.1–1.4.

3. Comparación de sensibilidad

1. Para probar la sensibilidad de CLas DETECTR, detecte una serie de diluciones de fragmentos de ADN de CLas utilizando PCR, CLas-DETECTR y qPCR, como se describió anteriormente.
2. Amplificar un segmento de ADN con una longitud de 1.060 pb a partir de nrdB utilizando el conjunto de cebadores F-RNR y R-RNR en una mezcla de reacción de 100 μL que contenga 4 μL de F-RNR, 4 μL de R-RNR, 50 μL de PrimeSTAR Max Premix, 2 μL de plantilla de ADN y 40 μL de_H2O, siguiendo las condiciones de reacción de ciclo térmico (30 s a 98 °C; seguido de 35 ciclos de 10 s a 98 °C), 15 s a 55 °C, 30 s a 72 °C; luego 10 min a 72 °C; y mantener a 16 °C).
   NOTA: El gen nrdB (ribonucleotide reductase β- subunidad) es específico de CLas²¹. Se puede obtener fácilmente el amplicón nrdB del ADNg cítrico positivo para CLas utilizando el conjunto de cebadores F-RNR y R-RNR. El conjunto de cebadores F-RNR y R-RNR amplifica un fragmento nrdB de 1.060 pb, mientras que el conjunto de cebadores F-RPA-RNR y R-RPA-RNR amplifica un fragmento de 104 pb del gen nrdB, que es la parte del fragmento nrdB de 1.060 pb.
3. Purificar los productos de PCR con un kit de extracción de gel de ADN siguiendo el manual del fabricante.
4. Diluir los productos de PCR que contienen los amplicones nrdB con_ddH2Oesterilizado.
5. Calcule el número de copias del gen nrdB utilizando el número de copia de ADN en línea disponible comercialmente y la calculadora de dilución.
6. Preparar diluciones de ADN que contengan 2,01 × 10⁶ copias/μL, 2,01 × 10⁵ copias/μL, 2,01 × 10⁴ copias/μL, 2,01 × 10³ copias/μL, 2,01 × 10 2 copias/μL, 2,01 × 10¹ copias/μL, 2,01 × 10⁰ copias/μL y^2,01 × 10⁻¹ copias/μL de fragmento de ADN CLas.

4. Detección de muestras

NOTA: Después de la prueba de especificidad y sensibilidad, se utilizó el método CLas-DETECTR para detectar la presencia de CLas en las muestras de hojas de campo recolectadas de naranjos dulces Newhall cultivados en el vivero de recursos de germoplasma en el campus de la Universidad Normal de Gannan, Jiangxi, China. Se realizó una qPCR para verificar los resultados.

1. Prueba un total de 15 árboles. Use el agua como un control negativo.
2. Realice los métodos CLas-DETECTR y qPCR como se describió anteriormente.
   NOTA: Debido a las características de distribución desigual de CLas en cítricos, las hojas que mostraban síntomas de HLB se recolectaron como prioridad. Si un árbol parecía saludable, las hojas se recogían aleatoriamenteEl sistema CLas-DETECTR funciona correctamente.

Resultados

Aquí, hemos descrito una plataforma portátil, CLas-DETECTR, que peina los sistemas RPA y CRISPR-Cas12a para diagnosticar HLB en el campo. El esquema de CLas-DETECTR se ilustra en la figura 1A.

Cuando las muestras de hojas de los árboles Newhall infectados con HLB y no infectados con HLB (Figura 1B), para los cuales la presencia de CLas se confirmó mediante PCR (Figura 1C), se sometieron a la prueba CLas-DETECTR, se observó una señal de fluorescencia verde en...

Discusión

Este estudio presenta un método rápido y portátil para detectar CLas denominado CLas-DETECTR, que combina los sistemas RPA y CRISPR-Cas12a. El flujo de trabajo se ilustra en la figura 1. CLas-DETECTR detecta CLas con especificidad y sensibilidad (Figura 2 y Figura 3). Además, utilizando muestras de hojas de Newhall, CLas-DETECTR detecta CLas con la misma sensibilidad que la qPCR (Figura 4

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit	Corning	09319KE1	China
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit	Solarbio	D1600	China
EnGen LbCas12a	TOLOBIO	32104-01	China
Ex Taq Version 2.0 plus dye	TaKaRa	RR902A	China
Handheld fluorescent detection device	LUYOR	3415RG	China
Hole puncher	Deli	114	China
Magnesium acetate, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	UK
NaOH	SCR	10019718	China
NEB buffer 3.1	NEB	B7203	USA
PCR strip tubes	LABSELECT	PST-0208-FT-C	China
PEG 200	Sigma	P3015	USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras	TaKaRa	R045A	China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	New England Biolabs	N0550S	USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	TaKaRa	RR820B	China
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT	UK