Détection de Candidatus liberibacter asiaticus déployable sur le terrain à l’aide de l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a

Résumé

Dans ce travail, une méthode de détection rapide, sensible et portable pour Candidatus Liberibacter asiaticus basée sur l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a a été développée.

Résumé

La détection précoce de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) par les producteurs d’agrumes facilite l’intervention précoce et prévient la propagation de la maladie. Une méthode simple pour le diagnostic rapide et portable de Huanglongbing (HLB) est présentée ici qui combine l’amplification de la polymérase recombinase et un rapporteur fluorescent utilisant l’activité nucléase du système grappé régulièrement espacé de courtes répétitions palindromiques / 12a associé à CRISPR (CRISPR-Cas12a). La sensibilité de cette technique est beaucoup plus élevée que la PCR. De plus, cette méthode a donné des résultats similaires à la qPCR lorsque des échantillons de feuilles ont été utilisés. Par rapport aux méthodes de détection CLas conventionnelles, la méthode de détection présentée ici peut être complétée en 90 minutes et fonctionne dans un état isotherme qui ne nécessite pas l’utilisation de machines PCR. De plus, les résultats peuvent être visualisés à l’aide d’un dispositif portatif de détection fluorescente sur le terrain.

Introduction

Huanglongbing (HLB) est l’une des maladies d’agrumes les plus problématiques au monde¹. Le HLB est causé par les bactéries fastidieuses et colonisatrices du phloème Candidatus Liberibacter spp., y compris Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus et Ca. L. americanus² . L’espèce associée au HLB la plus répandue en Chine et aux États-Unis est CLas, qui est transmise par les psylles asiatiques des agrumes (Diaphorina citri) ou par greffe³. Après avoir été infectés par CLas, les agrumes montrent un déclin de croissance jusqu’à la mort². Les symptômes courants des feuilles d’agrumes infectées par les CLas sont des marbrures tachetées, des îles vertes (petits points circulaires vert foncé), des nervures liégeuses surélevées sur des feuilles plus épaisses et coriaces et des pousses jaunissantes non uniformes². De plus, les fruits infectés par CLas apparaissent petits et déséquilibrés².

Étant donné qu’aucune variété d’agrumes n’est résistante au HLB et qu’il n’existe pas de remède thérapeutique pour le HLB, la prévention du HLB nécessite la mise en quarantaine et l’isolement des agrumes CLas positifs ^2,3. Par conséquent, la détection précoce est essentielle pour la surveillance et la quarantaine afin de prévenir la propagation des NCas et de minimiser les pertes économiques³. En outre, la détection sensible de CLas est nécessaire en raison du faible titre de CLas dans les plantes au début de l’infection³. En Chine, la détection CLas est généralement effectuée par certains centres de test certifiés. Cependant, le processus de détection prend généralement au moins 1 semaine et les frais de détection sont coûteux. Par conséquent, pour aider à surveiller l’incidence de la HLB

Diverses technologies ont été appliquées pour diagnostiquer HLB 4,5,6,7,8,9. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) et la PCR quantitative (qPCR) sont les outils les plus utilisés pour la détection de CLas en raison de leur sensibilité et de leur spécificité^{élevées 4,5}. Cependant, ces technologies reposent fortement sur des instruments coûteux et un personnel hautement qualifié. En outre, plusieurs méthodes d’amplification isotherme, telles que l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP), ont été développées comme alternatives attrayantes aux méthodes conventionnelles de PCR en raison de leur simplicité, de leur rapidité et de leur faible coût ^8,9,10. Cependant, il est difficile de les appliquer pour détecter avec précision les CLas en raison des signaux d’amplification non spécifiques, ce qui peut entraîner des résultats faussement positifs.

La détection d’acides nucléiques à base d’endonucléase guidée par ARN CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) a été développée en tant que technologie de diagnostic moléculaire de nouvelle génération en raison de sa sensibilité, de sa spécificité et de sa fiabilité^{élevées 11,12,13,14}. Ces technologies de diagnostic CRISPR/Cas reposent sur l’activité nucléase collatérale des protéines Cas pour cliver l’ADN simple brin (ADNss) modifié avec un rapporteur fluorescent et un quencher de fluorescence à chaque extrémité des oligonucléotides, ainsi qu’un dispositif de détection de fluorescence pour capturer le rapporteur fluorescent libéré^11,12 . L’activité nucléase de plusieurs effecteurs Cas activés par le duplex cible de l’ARN CRISPR (ARNcr) peut cliver sans discernement l’ADNss^{non cible environnant 11}. CRISPR-Cas12a (également appelé Cpf 1), un système CRISPR/Cas de type V-A de classe 2, présente plusieurs avantages par rapport au Cas9, tels qu’une tolérance aux incompatibilités plus faible et une plus grande spécificité¹³. Le système Cas12a/ARNcr a été appliqué pour la détection sensible et spécifique des acides nucléiques des pathogènes humains et des phytopathogènes 14,15,16,17,18. Par conséquent, l’utilisation du système Cas12a/crRNA devrait permettre la détection précise et sensible de l’acide nucléique de CLas.

Cas12a seul n’est pas théoriquement assez sensible pour détecter de faibles niveaux d’acides nucléiques. Par conséquent, pour améliorer sa sensibilité de détection, la détection CRISPR-Cas12a est généralement combinée avec une étape d’amplification isotherme^14,15. L’amplification de la polymérase recombinase (RPA) permet une amplification sensible et rapide de l’ADN isotherme dans une plage de température de 37 °C à 42 °C¹⁹.

Une plate-forme de détection appelée DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) qui combine l’activité DNase de Cas12a avec RPA et une lecture de fluorescence a été récemment conçue¹² et a montré qu’elle détectait les acides nucléiques avec une sensibilité plus élevée²⁰. De plus, le signal de fluorescence émis par les échantillons positifs peut être observé grâce à un dispositif portatif de détection de fluorescence sur le terrain.

Puisque nous avons amplifié l’ADN avec la RPA, conçu l’ARNcr ciblant le gène nrdB (ribonucléotide réductase β sous-unité) en cinq copies spécifique de CLas²¹, et utilisé l’activité DNase de la protéine Cas12a, nous avons appelé cette méthode de détection CLas CLas-DETECTR. Comparé aux méthodes de détection CLas existantes, CLas-DETECTR est rapide, précis, sensible et déployable.

Protocole

1. Construction du CLas-DETECTR

REMARQUE: La construction de CLas-DETECTR est un processus en quatre étapes: préparation de la solution, isolement de l’ADN total des agrumes, amplification isotherme de l’ADN et visualisation des résultats. Le schéma du test CLas-DETECTR est illustré à la figure 1A.

1. Préparation de la solution
   1. Préparer le tampon A : 20 mM de NaOH dans du PEG 200 à 6 %. Pour 100 mL, ajouter 113 mg de NaOH et 6 g de PEG 200 dans 80 mL de_H2Odans une bouteille. Incuber la bouteille au bain-marie à 60 °C jusqu’à dissolution de tout le PEG 200. Ensuite, ajoutez H₂O à un volume de 100 mL.
   2. Préparer la solution B : Pour chaque réaction, ajouter 10 μL de tampon RPA, 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr et 3,9 μL de_ddH2Ojusqu’à un volume final de 15,5 μL.
      REMARQUE : F-RPA-RNRf et R-RPA-RNRr sont les amorces utilisées dans le test contre le gène nrdB . Voir le tableau 1 pour la séquence.
   3. Préparer la solution C : Pour chaque réaction, ajouter 1 μL de rapporteur d’ADNs, 3 μL de tampon NEB 3.1, 1 μL d’ARNcr, 4 μL de Cas12a et 11 μL de_ddH2Ojusqu’à un volume final de 20 μL.
      REMARQUE: S’il y a beaucoup d’échantillons à détecter, faire un grand volume de solution B et de solution C, et aliquote plus tard.
2. Isolement total de l’ADN des agrumes
   NOTE: Pour gagner du temps et rendre cette méthode adaptée à la détection de CLas sur le terrain, l’approche à base de polyéthylène glycol alcalin (PEG) a été utilisée pour obtenir des extraits bruts de plantes pour l’amplification de l’ADN^22,23
   1. Les feuilles d’agrumes ont été utilisées dans ce protocole. Tout d’abord, frappez cinq disques de feuilles d’une feuille. Ensuite, placez les disques foliaires dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et ajoutez 200 μL de tampon A.
      REMARQUE: Sur le terrain, nettoyez d’abord les feuilles si de la poussière les recouvre. Les disques foliaires peuvent être coupés à l’aide du couvercle du tube de 1,5 mL pour éviter la contamination croisée. D’autres tissus d’agrumes, tels que les racines, les tiges, les fruits et les fleurs, peuvent également être utilisés dans ce protocole.
   2. Broyer les disques de feuilles manuellement jusqu’à consistance lisse avec une tige en plastique.
   3. Laissez le tube intact pendant 10 min. Ensuite, utilisez le surnageant pour l’amplification de l’ADN.
      REMARQUE: Le test peut être interrompu ici, et les extraits bruts de plantes qui ont été extraits par la méthode alcaline-PEG peuvent être conservés à -20 ° C pendant au moins 1 an. Les orangers doux de Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) montrés dans la vidéo ont été cultivés dans un pot rempli d’un mélange de terre de tourbe / vermiculite / perlite 9/3/1 (v / v / v) et maintenus dans une serre située sur le campus de l’Université normale de Gannan, Jiangxi, Chine. Les arbres infectés par HLB ont été inoculés par greffe avec des bourgeons de Newhall CLas positifs. Les arbres infectés et non infectés par HLB ont été confirmés par PCR. CLas a été détecté à l’aide de la paire d’amorces (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) ciblant le gène marqueur spécifique de CLas nrdB. De l’autre côté, des symptômes caractéristiques de HLB, des marbrures tachetées et des feuilles jaunies peuvent être trouvés sur les arbres CLas positifs, mais pas sur les arbres CLas négatifs.
3. Amplification isotherme de l’ADN
   1. Ajouter 1 μL du surnageant de l’étape 1.2.3 et 1 μL de MgOAc (concentration finale de 14 mM) dans la solution B et bien mélanger.
   2. En laboratoire, incuber dans un incubateur simple à 37 °C pendant 15 min.
      NOTE: Sur le terrain, tenez les tubes en main pendant 15 min. Il est également suggéré d’incuber des tubes dans un incubateur simple à 37 °C pendant 15 min si les conditions le permettent.
4. Visualisation des résultats
   1. Ajouter 10 μL du mélange de l’étape 1.3.2 dans la solution C et bien mélanger.
   2. Incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 60 min.
   3. Portez des lunettes de protection et observez le signal de fluorescence vert émis par le rapporteur d’ADNss marqué avec 5' 6-Fluorescein à 5' et l’inhibiteur de fluorescence à 3' à travers un dispositif de détection fluorescent portatif (longueur d’onde d’excitation: 440 nm, longueur d’onde d’émission: 500 nm).
      REMARQUE: le signal de fluorescence verte peut durer plusieurs jours, il est préférable de
      ATTENTION : La lumière émise par le dispositif de détection de fluorescence est nocive pour les yeux. Assurez-vous de porter des lunettes de protection avant d’observer les résultats.

2. Test de spécificité

REMARQUE : Pour tester la spécificité de CLas-DETECTR, la bactérie de la rhizosphère Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) et la souche 1440 de Burkholderia stabilis isolées en laboratoire²⁴ ont été soumises au test CLas-DETECTR.

NOTE: Candidatus Liberibacter (CLas) ne peut pas être cultivé. On ne peut obtenir de l’ADN CLas qu’à partir de l’extraction de l’ADN génomique de tissus d’agrumes infectés par CLas. Xcc est l’agent causal d’une autre maladie importante des agrumes, le chancre des agrumes. La souche 1440 de Burkholderia stabilis est une bactérie anti-Xcc isolée en laboratoire. Par conséquent, des souches pures pour ces trois bactéries ont été utilisées.

1. Extraire l’ADN génomique bactérien (ADNg) à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique bactérien suivant le protocole du fabricant. Utilisez l’eau comme témoin négatif.
2. Effectuer la PCR à l’aide de bandes de tube PCR de 0,2 mL avec des bouchons optiques dans un mélange réactionnel de 25 μL contenant 1 μL de F-RPA-RNRf, 1 μL de R-RPA-RNRr, 12,5 μL d’Ex Taq Version 2.0 plus colorant, 1 μL de matrice d’ADN et 9,5 μL de H₂O.
   1. Utiliser les conditions de réaction de cyclage thermique suivantes: 1 min à 98 °C; suivi de 35 cycles de 10 s à 98 °C, 30 s à 55 °C, 15 s à 72 °C; puis 10 min à 72 °C ; et maintenir à 16 °C.
   2. Exécutez les produits PCR sur du gel d’agarose à 1% à 120 V pendant 15 min.
3. Effectuer la qPCR dans un mélange réactionnel de 20 μL contenant 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr, 10 μL de 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL de la matrice d’ADN et 7,4 μL de_H2O.
   1. Utiliser les conditions de réaction de cyclage thermique suivantes: 30 s à 95 °C; suivi de 45 cycles de 5 s à 95 °C et de 32 s à 60 °C; puis un étage de courbe de fusion de 15 s à 95 °C, 1 min à 60 °C et 15 s à 95 °C.
   2. Inclure trois répétitions techniques dans chaque répétition.
4. Exécutez la méthode CLas-DETECTR en suivant les étapes 1.1 à 1.4.

3. Comparaison de sensibilité

1. Pour tester la sensibilité de CLas DETECTR, détecter une série de dilutions de fragments d’ADN CLas en utilisant PCR, CLas-DETECTR et qPCR, comme décrit ci-dessus.
2. Amplifier un segment d’ADN d’une longueur de 1 060 bp à partir de nrdB à l’aide du jeu d’amorces F-RNR et R-RNR dans un mélange réactionnel de 100 μL contenant 4 μL de F-RNR, 4 μL de R-RNR, 50 μL de PrimeSTAR Max Premix, 2 μL de matrice d’ADN et 40 μL de_H2O, suivant les conditions de réaction du cycle thermique (30 s à 98 °C; suivi de 35 cycles de 10 s à 98 °C, 15 s à 55 °C, 30 s à 72 °C; puis 10 min à 72 °C ; et tenir à 16 °C).
   REMARQUE : Le gène nrdB (ribonucléotide réductase β sous-unité) est spécifique au CLas²¹. On peut facilement obtenir l’amplicon nrdB à partir de l’ADNg d’agrumes CLas positif en utilisant l’ensemble d’amorces F-RNR et R-RNR. L’ensemble d’amorces F-RNR et R-RNR amplifie un fragment nrdB de 1 060 pb, tandis que l’ensemble d’amorces F-RPA-RNR et R-RPA-RNR amplifie un fragment de 104 pb du gène nrdB, qui est la partie du fragment nrdB de 1 060 pb.
3. Purifiez les produits PCR avec un kit d’extraction de gel ADN suivant le manuel du fabricant.
4. Diluer les produits PCR contenant les amplicons nrdB avec du_ddH2Ostérilisé.
5. Calculez le numéro de copie du gène nrdB à l’aide du numéro de copie d’ADN et du calculateur de dilution disponibles dans le commerce.
6. Préparer des dilutions d’ADN contenant 2,01 × 10⁶ copies/μL, 2,01 × 10⁵ copies/μL, 2,01 × 10⁴ copies/μL, 2,01 × 10³ copies/μL, 2,01 × 10 2 copies/μL, 2,01 × 10¹ copies/μL, 2,01 × 10⁰ copies/μL et^2,01 × 10⁻¹ copies/μL de fragment d’ADN CLas.

4. Détection des échantillons

NOTE: Après le test de spécificité et de sensibilité, la méthode CLas-DETECTR a été utilisée pour détecter la présence de CLas dans les échantillons de feuilles prélevés sur des orangers de Newhall cultivés dans la pépinière de ressources en germoplasme sur le campus de l’Université normale de Gannan, Jiangxi, Chine. Une qPCR a été effectuée pour vérifier les résultats.

1. Testez un total de 15 arbres. Utilisez l’eau comme témoin négatif.
2. Exécutez les méthodes CLas-DETECTR et qPCR comme décrit ci-dessus.
   REMARQUE: En raison des caractéristiques de distribution inégale des CLas dans les agrumes, les feuilles présentant des symptômes de HLB ont été collectées en priorité. Si un arbre avait l’air en bonne santé, les feuilles étaient collectées au hasardLe système CLas-DETECTR fonctionne correctement.

Résultats

Ici, nous avons décrit une plate-forme portable, CLas-DETECTR, combinant les systèmes RPA et CRISPR-Cas12a pour diagnostiquer HLB sur le terrain. Le schéma de CLas-DETECTR est illustré à la figure 1A.

Lorsque des échantillons de feuilles provenant d’arbres de Newhall infectés et non infectés par HLB (figure 1B), pour lesquels la présence de CLas a été confirmée par PCR (figure 1C), ont été soumis au test CLas-DETECTR, un signal de fluorescence vert...

Discussion

Cette étude présente une méthode rapide et portable de détection des CLas nommée CLas-DETECTR, qui combine les systèmes RPA et CRISPR-Cas12a. Le flux de travail est illustré à la figure 1. CLas-DETECTR détecte les CLas avec spécificité et sensibilité (Figure 2 et Figure 3). De plus, en utilisant des échantillons de feuilles de Newhall, CLas-DETECTR détecte les CLas avec la même sensibilité que la qPC...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit	Corning	09319KE1	China
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit	Solarbio	D1600	China
EnGen LbCas12a	TOLOBIO	32104-01	China
Ex Taq Version 2.0 plus dye	TaKaRa	RR902A	China
Handheld fluorescent detection device	LUYOR	3415RG	China
Hole puncher	Deli	114	China
Magnesium acetate, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	UK
NaOH	SCR	10019718	China
NEB buffer 3.1	NEB	B7203	USA
PCR strip tubes	LABSELECT	PST-0208-FT-C	China
PEG 200	Sigma	P3015	USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras	TaKaRa	R045A	China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	New England Biolabs	N0550S	USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	TaKaRa	RR820B	China
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT	UK