CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 사용한 현장 배치 가능 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 검출

요약

이 연구에서는 CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 기반으로 하는 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스에 대한 빠르고 민감하며 휴대 가능한 검출 방법이 개발되었습니다.

초록

감귤류 재배자에 의한 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(CLas)의 조기 발견은 조기 개입을 촉진하고 질병의 확산을 예방합니다. 재조합 효소 중합 효소 증폭과 군집된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복/CRISPR 관련 12a(CRISPR-Cas12a) 시스템의 뉴클레아제 활성을 활용하는 형광 리포터를 결합한 신속하고 휴대 가능한 황룡빙(HLB) 진단을 위한 간단한 방법이 여기에 제시됩니다. 이 기술의 감도는 PCR보다 훨씬 높습니다. 또한, 이 방법은 잎 샘플을 사용했을 때 qPCR과 유사한 결과를 보였다. 기존의 CLas 검출 방법과 비교하여 여기에 제시된 검출 방법은 90 분 안에 완료 할 수 있으며 PCR 기계를 사용할 필요가없는 등온 조건에서 작동합니다. 또한 현장에서 휴대용 형광 검출 장치를 통해 결과를 시각화 할 수 있습니다.

서문

황룡빙(HLB)은 전 세계적으로 가장 문제가 되는 감귤류 질병 중 하나입니다¹. HLB는 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(CLas), Ca. L. 아프리카누스 및 Ca. L. 아메리카누스²를 포함하는 체관부 집락화 및 까다로운 박테리아 칸디다투스 리베리박터 종에 의해 발생합니다. 중국과 미국에서 가장 널리 퍼진 HLB 관련 종은 아시아 감귤류 프실라(Diaphorina citri) 또는 접목을 통해 전염되는 CLas입니다.³. CLas에 감염된 후 감귤 나무는 죽을 때까지 성장 감소를 보여줍니다². CLas에 감염된 감귤류 잎의 일반적인 증상은 얼룩덜룩 한 얼룩, 녹색 섬 (작은 원형 짙은 녹색 점), 두껍고 가죽 같은 잎에 융기 된 코르키 정맥, 불균일 한 황변 싹²입니다. 또한 CLas에 감염된 과일은 작고 편향된 것처럼 보입니다².

감귤류 품종은 HLB에 내성이 없고 HLB에 대한 치료법이 없기 때문에 HLB를 예방하려면 CLas 양성 감귤류 나무의 격리 및 분리가 필요합니다 ^2,3. 따라서 CLas의 확산을 방지하고 경제적 손실을 최소화하기 위해 모니터링 및 격리에 조기 발견이 중요합니다³. 또한, 감염 초기 단계에서 식물에서 CLas의 낮은 역가로 인해 민감한 CLas 검출이 필요합니다³. 중국에서 CLas 검출은 일반적으로 인증된 특정 테스트 센터에서 수행됩니다. 그러나 탐지 과정은 일반적으로 최소 1 주일이 걸리며 탐지 수수료가 비쌉니다. 따라서 HLB 발생률을 모니터링하는 데 도움이 됩니다.

HLB 4,5,6,7,8,9를 진단하기 위해 다양한 기술이 적용되었습니다. 중합효소연쇄반응(PCR) 및 정량적 PCR(qPCR)은 높은 감도와^{특이성으로} 인해 CLas 검출에 가장 많이 사용되는 도구입니다^4,5. 그러나 이러한 기술은 값비싼 기기와 고도로 숙련된 인력에 크게 의존합니다. 또한, 루프 매개 등온 증폭 (LAMP)과 같은 여러 등온 증폭 방법은 단순성, 신속성 및 저렴한 비용으로 인해 기존 PCR 방법에 대한 매력적인 대안으로 개발되었습니다 ^8,9,10. 그러나 비특이적 증폭 신호로 인해 CLas를 정확하게 검출하기 위해 이를 적용하는 것은 어렵고 위양성 결과를 유발할 수 있습니다.

RNA 유도 CRISPR/CAS(클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복/CRISPR 관련) 엔도뉴클레아제 기반 핵산 검출은 높은 감도, 특이성 및 신뢰성 11,12,13,14로 인해 차세대 분자 진단 기술로 개발되었습니다. 이러한 CRISPR/Cas 진단 기술은 Cas 단백질의 부수적인 뉴클레아제 활성에 의존하여 올리고뉴클레오티드의 각 말단에 있는 형광 리포터와 형광 소광제로 변형된 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 절단하고 방출된 형광 리포터^11,12를 캡처하는 형광 검출 장치에 의존합니다. . CRISPR RNA (crRNA) 표적 듀플렉스에 의해 활성화된 몇몇 Cas 이펙터의 뉴클레아제 활성은 주변의 비표적 ssDNA¹¹을 무차별적으로 절단할 수 있다. 클래스 2 유형 V-A CRISPR/CAS 시스템인 CRISPR-Cas12a(Cpf 1이라고도 함)는 Cas9에 비해 낮은 불일치 허용 오차 및 더 큰 특이성¹³과 같은 몇 가지 이점을 보여줍니다. Cas12a/crRNA 시스템은 인간 병원체 및 식물병원체^{14,15,16,17,18}의 핵산의 민감하고 특이적인 검출을 위해 적용되었습니다. 따라서 Cas12a/crRNA 시스템을 활용하면 CLas 핵산을 정확하고 민감하게 검출할 수 있습니다.

Cas12a 단독은 이론적으로 낮은 수준의 핵산을 검출할 만큼 민감하지 않습니다. 따라서 검출 감도를 향상시키기 위해 CRISPR-Cas12a 검출은 일반적으로 등온 증폭 단계^14,15와 결합됩니다. 재조합 중합효소 증폭 (RPA)은 37°C 내지 42°C의 온도 범위에서 민감하고 신속한 등온 DNA 증폭을 가능하게 한다¹⁹.

Cas12a의 DNase 활성과 RPA 및 형광 판독을 결합한 DETECTR(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)라는 검출 플랫폼이 최근에 고안되었으며¹² 더 높은 감도의 핵산을 검출하는 것으로 나타났습니다²⁰. 또한 양성 샘플에서 방출된 형광 신호는 현장에서 휴대용 형광 검출 장치를 통해 관찰할 수 있습니다.

RPA로 DNA를 증폭하고, CLas²¹에 특이적인 5카피 nrdB(리보뉴클레오티드 환원효소 β-서브유닛) 유전자를 표적으로 하는 crRNA를 설계하고, Cas12a 단백질의 DNase 활성을 사용했기 때문에 이를 CLas 검출 방법을 CLas-DETECTR라고 불렀습니다. 기존 CLas 검출 방법과 비교하여 CLas-DETECTR는 빠르고 정확하며 민감하고 배포가 가능합니다.

프로토콜

1. 클라스 탐정의 건설

참고: CLas-DETECTR의 구성은 용액 준비, 감귤류 총 DNA 분리, 등온 DNA 증폭 및 결과 시각화의 4단계 프로세스입니다. CLas-DETECTR 분석의 개략도는 그림 1A에 나와 있습니다.

1. 용액 준비
   1. 완충액 A: 6% PEG 200 중 20 mM NaOH를 준비한다. 100mL의 경우 113mg의 NaOH와 6g의 PEG 200을 병에 80mL의 H_2O에 넣습니다. 병을 모든 PEG 200이 용해될 때까지 60°C의 수조에서 인큐베이션한다. 그런 다음 H₂O를 100mL의 부피에 첨가하십시오.
   2. 용액 B 준비: 각 반응에 대해 10μL의 RPA 완충액, 0.8μL의 F-RPA-RNRf, 0.8μL의 R-RPA-RNRr 및 3.9μL의_ddH2O를 최종 부피 15.5μL에 추가합니다.
      참고: F-RPA-RNRf 및 R-RPA-RNRr은 nrdB 유전자에 대한 분석에 사용되는 프라이머입니다. 순서는 표 1 을 참조하십시오.
   3. 용액 C 준비: 각 반응에 대해 1μL의 ssDNA 리포터, 3μL의 NEB 완충액 3.1, 1μL의 crRNA, 4μL의 Cas12a 및 11μL의_ddH2O를 최종 부피 20μL에 첨가합니다.
      알림: 검출할 샘플이 많은 경우 많은 양의 용액 B와 용액 C를 만들고 나중에 부분 표본을 만드십시오.
2. 감귤류 총 DNA 분리
   참고: 시간을 절약하고 이 방법을 현장 CLas 검출에 적합하게 만들기 위해 알칼리성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기반 접근 방식을 사용하여 DNA 증폭을 위한 조식물 추출물을 얻었습니다.^22,23
   1. 감귤류 잎이이 프로토콜에 사용되었습니다. 먼저 잎에서 5 개의 잎 디스크를 펀칭합니다. 다음으로 잎 디스크를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 넣고 200μL의 버퍼 A를 추가합니다.
      알림: 현장에서 잎을 덮고있는 먼지가있는 경우 먼저 잎을 청소하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 1.5mL 튜브의 뚜껑을 사용하여 잎 디스크를 자를 수 있습니다. 뿌리, 줄기, 과일 및 꽃과 같은 다른 감귤류 조직도 이 프로토콜에 사용될 수 있습니다.
   2. 플라스틱 막대로 부드러워 질 때까지 리프 디스크를 수동으로 연마하십시오.
   3. 튜브를 10분 동안 그대로 두십시오. 이어서, DNA 증폭을 위해 상청액을 사용한다.
      참고 : 여기서 분석을 일시 중지 할 수 있으며 알칼리성 -PEG 방법으로 추출 된 조식물 추출물은 최소 20 년 동안 -1 ° C에서 보관할 수 있습니다. 비디오에 나오는 뉴홀 스위트 오렌지(Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) 나무는 9/3/1(v/v/v) 이탄 토양/질석/펄라이트가 혼합된 화분에서 재배되었으며 중국 장시성 간난 사범대학 캠퍼스에 위치한 유리온실에서 관리되었습니다. HLB에 감염된 나무는 CLas 양성 뉴홀 새싹을 접목하여 접종했습니다. HLB 감염 및 HLB 비감염 트리를 PCR로 확인하였다. CLas는 CLas 특이적 마커 유전자 nrdB를 표적으로 하는 프라이머 쌍(F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr)을 사용하여 검출하였다. 반면에 특징적인 HLB 증상, 얼룩덜룩 한 얼룩 및 황변하는 잎은 CLas 양성 나무에서 발견 될 수 있지만 CLas 음성 나무에서는 발견되지 않습니다.
3. 등온 DNA 증폭
   1. 단계 1.2.3으로부터의 상청액 1 μL와 MgOAc (14 mM 최종 농도) 1 μL를 용액 B에 첨가하고 잘 혼합한다.
   2. 실험실에서 37 ° C의 간단한 인큐베이터에서 15 분 동안 배양하십시오.
      알림: 현장에서 튜브를 손에 들고 15분 동안 잡습니다. 또한 조건이 허용하는 경우 37 ° C의 간단한 인큐베이터에서 15 분 동안 튜브를 배양하는 것이 좋습니다.
4. 결과 시각화
   1. 단계 1.3.2의 혼합물 10μL를 용액 C에 첨가하고 잘 혼합한다.
   2. 37 ° C 인큐베이터에서 60 분 동안 배양하십시오.
   3. 고글을 착용하고 휴대용 형광 검출 장치(여기 파장: 440nm, 발광 파장: 500nm)를 통해 5' 6-Fluorescein at 5'로 표지된 ssDNA 리포터와 3'에서 형광 소광제에서 방출되는 녹색 형광 신호를 관찰합니다.
      참고: 녹색 형광 신호는 며칠 동안 지속될 수 있으므로
      주의: 형광 검출 장치에서 방출되는 빛은 눈에 해롭습니다. 결과를 관찰하기 전에 고글을 착용하십시오.

2. 특이성 시험

참고: CLas-DETECTR의 특이성을 테스트하기 위해 실험실²⁴에서 분리된 근권 박테리아 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101, 크산토모나스 시트리 아종 시트리(Xcc) 및 부르크홀데리아 스태빌리스 균주 1440을 CLas-DETECTR 테스트를 실시했습니다.

참고: 칸디다투스 리베리박터(CLas)는 배양할 수 없습니다. CLas에 감염된 감귤류 조직에서 게놈 DNA를 추출해야만 CLas DNA를 얻을 수 있습니다. Xcc 는 또 다른 중요한 감귤류 질병 인 감귤류 구내염의 원인 인자입니다. Burkholderia stabilis 균주 1440은 실험실에서 분리 된 항 Xcc 박테리아입니다. 따라서이 세 가지 박테리아 모두에 대한 순수한 균주가 사용되었습니다.

1. 제조업체의 프로토콜에 따라 박테리아 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 박테리아 게놈 DNA(gDNA)를 추출합니다. 물을 음성 대조군으로 사용하십시오.
2. 1 μL의 F-RPA-RNRf, 1 μL의 R-RPA-RNRr, 12.5 μL의 Ex Taq 버전 2.0 플러스 염료, 1 μL의 DNA 주형 및 9.5 μL의 H 2 O를 포함하는 25 μL 반응 혼합물에서 광학 캡이 있는_0.2mL PCR 튜브 스트립을 사용하여 PCR을 수행합니다.
   1. 다음의 열 사이클링 반응 조건을 사용한다: 98°C에서 1분; 98 °C에서 10 초, 55 °C에서 30 초, 72 °C에서 15 초의 35 사이클; 그런 다음 72°C에서 10분; 16 °C에서 유지하십시오.
   2. PCR 산물을 120V에서 15분 동안 1% 아가로스 겔에서 실행합니다.
3. 0.8μL의 F-RPA-RNRf, 0.8μL의 R-RPA-RNRr, 10μL의 2x TB 그린 프리믹스 Ex Taq II(Tli RNaseH Plus), 1μL의 DNA 주형, 및 7.4μL의_H2O를 포함하는 20μL 반응 혼합물에서 qPCR을 수행합니다.
   1. 다음의 열 순환 반응 조건을 사용하십시오: 95°C에서 30초; 95 °C에서 5 초 및 60 °C에서 32 초의 45 사이클; 이어서 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 95°C에서 15초의 용융 곡선 단계를 가한다.
   2. 각 반복에 세 가지 기술 반복을 포함합니다.
4. 1.1–1.4단계에 따라 CLas-DETECTR 방법을 수행합니다.

3. 감도 비교

1. CLas DETECTR의 민감도를 테스트하기 위해, 상기 설명된 바와 같이, PCR, CLas-DETECTR 및 qPCR을 사용하여 일련의 CLas DNA 단편 희석물을 검출한다.
2. 4 μL의 F-RNR, 4 μL의 R-RNR, 50 μL의 PrimeSTAR Max Premix, 2 μL의 DNA 주형, 및 40 μL의_H2O를 함유하는 100 μL 반응 혼합물에서 프라이머 세트 F-RNR 및 R-RNR을 사용하여 nrdB로부터 1,060 bp 길이의 DNA 세그먼트를 증폭시키고, 열 사이클링 반응 조건(98°C에서 30초; 이어서 98°C에서 10초씩 35사이클, 55 °C에서 15 초, 72 °C에서 30 초; 그런 다음 72°C에서 10분; 및 16°C에서 유지).
   참고 : nrdB (리보 뉴클레오티드 환원 효소 β- 서브 유닛) 유전자는 CLas²¹에 특이 적입니다. 프라이머 세트 F-RNR 및 R-RNR을 사용하여 CLas 양성 감귤류 gDNA로부터 nrdB 앰플리콘을 쉽게 얻을 수 있습니다. 프라이머 세트 F-RNR 및 R-RNR은 1,060bp nrdB 단편을 증폭하는 반면, 프라이머 세트 F-RPA-RNR 및 R-RPA-RNR은 1,060bp nrdB 단편의 일부인 nrdB 유전자의 104bp 단편을 증폭한다.
3. 제조업체 설명서에 따라 DNA 젤 추출 키트로 PCR 제품을 정제합니다.
4. nrdB 앰플리콘을 함유하는 PCR 산물을 멸균된_ddH2O로 희석한다.
5. 시판되는 온라인 DNA 복제 수와 희석 계산기를 사용하여 nrdB 유전자의 복제 수를 계산합니다.
6. 2.01 × 10⁶ 카피 / μL, 2.01 × 10⁵ 카피 / μL, 2.01 × 10⁴ 카피 / μL, 2.01 × 10³ 카피 / μL, 2.01 × 10 2 카피 / μL, 2.01 × 10 1 카피 / μL, 2.01 × 10⁰ 카피 / μL 및 2.01 × ^10-1 카피 / μL의 CLas DNA 단편을 포함하는 DNA 희석액을 준비합니다.

4. 샘플 검출

참고: 특이성 및 민감도 테스트 후 CLas-DETECTR 방법을 사용하여 중국 장시성 간난 사범 대학교 캠퍼스의 생식질 자원 보육원에서 자란 Newhall 달콤한 오렌지 나무에서 수집된 필드 잎 샘플에서 CLas의 존재를 감지했습니다. 결과를 확인하기 위해 qPCR을 수행하였다.

1. 총 15 그루의 나무를 테스트하십시오. 물을 음성 대조군으로 사용하십시오.
2. 위에서 설명한 대로 CLas-DETECTR 및 qPCR 방법을 수행합니다.
   참고: 감귤류에서 CLas의 고르지 않은 분포 특성으로 인해 HLB 증상을 보이는 잎을 우선적으로 수집했습니다. 나무가 건강해 보이면 잎을 무작위로 수집CLas-DETECTR 시스템이 올바르게 작동합니다.

결과

여기에서는 RPA와 CRISPR-Cas12a 시스템을 결합하여 현장에서 HLB를 진단하는 휴대용 플랫폼인 CLas-DETECTR에 대해 설명했습니다. CLas-DETECTR의 스키마는 그림 1A에 나와 있습니다.

CLas의 존재가 PCR에 의해 확인 된 HLB 감염 및 HLB에 감염되지 않은 Newhall 트리 (그림 1B)의 잎 샘플 (그림 1C)을 CLas-DETECTR 테스트를 받았을 때, H...

토론

이 연구는 RPA와 CRISPR-Cas12a 시스템을 결합한 CLas-DETECTR라는 이름의 CLas를 탐지하는 신속하고 이식 가능한 방법을 제시합니다. 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. CLas-DETECTR는 특이성과 민감도로 CLas를 검출합니다(그림 2 및 그림 3). 또한 CLas-DETECTR은 뉴홀 리프 샘플을 사용하여 qPCR과 동일한 감도로 CLas를 검출합니다(

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit	Corning	09319KE1	China
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit	Solarbio	D1600	China
EnGen LbCas12a	TOLOBIO	32104-01	China
Ex Taq Version 2.0 plus dye	TaKaRa	RR902A	China
Handheld fluorescent detection device	LUYOR	3415RG	China
Hole puncher	Deli	114	China
Magnesium acetate, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	UK
NaOH	SCR	10019718	China
NEB buffer 3.1	NEB	B7203	USA
PCR strip tubes	LABSELECT	PST-0208-FT-C	China
PEG 200	Sigma	P3015	USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras	TaKaRa	R045A	China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	New England Biolabs	N0550S	USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	TaKaRa	RR820B	China
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT	UK