Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a

Resumo

Neste trabalho, foi desenvolvido um método de detecção rápido, sensível e portátil de Candidatus Liberibacter asiaticus baseado na amplificação da recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a.

Resumo

A detecção precoce de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por citricultores facilita a intervenção precoce e previne a propagação da doença. Um método simples para o diagnóstico rápido e portátil de Huanglongbing (HLB) é apresentado aqui que combina amplificação da recombinase polimerase e um repórter fluorescente utilizando a atividade nuclease do sistema palindrômico curto agrupado regularmente interespaçado/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a). A sensibilidade desta técnica é muito maior do que a PCR. Além disso, este método mostrou resultados semelhantes à qPCR quando as amostras foliares foram utilizadas. Em comparação com os métodos convencionais de detecção de CLas, o método de detecção aqui apresentado pode ser concluído em 90 min e funciona em uma condição isotérmica que não requer o uso de máquinas de PCR. Além disso, os resultados podem ser visualizados através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente no campo.

Introdução

O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças cítricas mais problemáticas do mundo¹. O HLB é causado pela bactéria colonizadora de floemas e fastidiosa Candidatus Liberibacter spp., incluindo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus ². A espécie associada ao HLB mais prevalente na China e nos EUA é a CLas, que é transmitida por psilídeos cítricos asiáticos (Diaphorina citri) ou por enxerto³. Após serem infectadas por CLas, as árvores cítricas demonstram declínio de crescimento até a morte². Os sintomas comuns das folhas cítricas infectadas com CLas são manchas manchadas, ilhas verdes (pequenos pontos circulares verde-escuros), veias de cortiça levantadas em folhas mais grossas e coriáceas e brotos amarelados não uniformes². Além disso, os frutos infectados com CLas parecem pequenos e desequilibrados².

Como nenhuma variedade cítrica é resistente ao HLB e não há cura terapêutica para o HLB, a prevenção do HLB requer a quarentena e o isolamento de citros CLas-positivos ^2,3. Portanto, a detecção precoce é fundamental para o monitoramento e a quarentena para evitar a disseminação de CLas e minimizar as perdas econômicas³. Além disso, a detecção de CLas sensíveis é necessária devido ao baixo título de CLas em plantas durante o estágio inicial da infecção³. Na China, a detecção de CLas é geralmente conduzida por certos centros de teste certificados. No entanto, o processo de detecção geralmente leva pelo menos 1 semana, e a taxa de detecção é cara. Portanto, para ajudar a monitorar a incidência de HLB

Diversas tecnologias têm sido aplicadas para diagnosticar o HLB 4,5,6,7,8,9. A reação em cadeia da polimerase (PCR) e a PCR quantitativa (qPCR) são as ferramentas mais utilizadas para a detecção de CLas devido à sua alta sensibilidade e especificidade ^4,5. No entanto, essas tecnologias dependem fortemente de instrumentos caros e pessoal altamente qualificado. Além disso, vários métodos de amplificação isotérmica, como a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), têm sido desenvolvidos como alternativas atraentes aos métodos convencionais de PCR devido à sua simplicidade, rapidez e baixo custo ^8,9,10. No entanto, é um desafio aplicá-los para detectar com precisão CLas devido aos sinais de amplificação não específicos, o que pode causar resultados falso-positivos.

A detecção de ácido nucleico à base de endonuclease CRISPR/Cas guiada por RNA (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas/associadas a CRISPR) foi desenvolvida como uma tecnologia de diagnóstico molecular de última geração devido à sua alta sensibilidade, especificidade e confiabilidade 11,12,13,14. Essas tecnologias de diagnóstico CRISPR/Cas dependem da atividade nuclease colateral das proteínas Cas para clivar o DNA de fita simples (ssDNA) modificado com um repórter fluorescente e um quencher de fluorescência em cada extremidade dos oligonucleotídeos, bem como um dispositivo de detecção de fluorescência para capturar o repórter fluorescente liberado^11,12 . A atividade nuclease de vários efetores de Cas ativados pelo duplex alvo de RNA CRISPR (crRNA) pode clivar indiscriminadamente o ssDNA não-alvo circundante¹¹. O CRISPR-Cas12a (também chamado de Cpf 1), um sistema CRISPR/CAS tipo classe 2 do tipo 2, demonstra diversas vantagens em relação ao Cas9, como menor tolerância à incompatibilidade e maior especificidade¹³. O sistema Cas12a/crRNA tem sido aplicado para a detecção sensível e específica dos ácidos nucleicos de patógenos e fitopatógenos humanos 14,15,16,17,18. Portanto, a utilização do sistema Cas12a/crRNA deve permitir a detecção precisa e sensível do ácido nucleico de CLas.

Cas12a sozinho não é teoricamente sensível o suficiente para detectar baixos níveis de ácidos nucleicos. Portanto, para melhorar sua sensibilidade de detecção, a detecção de CRISPR-Cas12a é tipicamente combinada com uma etapa de amplificação isotérmica^14,15. A amplificação da recombinase polimerase (RPA) permite a amplificação sensível e rápida do DNA isotérmico em uma faixa de temperatura de 37 °C a 42 °C¹⁹.

Uma plataforma de detecção chamada DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) que combina a atividade da DNase de Cas12a com RPA e uma leitura de fluorescência foi recentemente concebida¹² e demonstrou detectar ácido nucleico com maior sensibilidade²⁰. Além disso, o sinal de fluorescência emitido pelas amostras positivas pode ser observado através de um dispositivo portátil de detecção de fluorescência no campo.

Como amplificamos o DNA com RPA, projetamos crRNA visando o gene nrdB de cinco cópias (ribonucleotídeo redutase β- subunidade) específico para CLas²¹ e empregamos a atividade DNase da proteína Cas12a, chamamos esse método de detecção de CLas de CLas-DETECTR. Em comparação com os métodos de detecção CLas existentes, o CLas-DETECTR é rápido, preciso, sensível e implantável.

Protocolo

1. Construção do CLas-DETECTR

NOTA: A construção do CLas-DETECTR é um processo de quatro etapas: preparação da solução, isolamento do DNA total dos citros, amplificação isotérmica do DNA e visualização dos resultados. O esquema do ensaio CLas-DETECTR é ilustrado na Figura 1A.

1. Preparação da solução
   1. Preparar tampão A: 20 mM de NaOH em 6% de PEG 200. Para 100 ml, adicione 113 mg de NaOH e 6 g de PEG 200 em 80 ml de H₂O num frasco. Incubar o frasco em banho-maria a 60 °C até que todo o PEG 200 esteja dissolvido. Em seguida, adicione H₂O a um volume de 100 mL.
   2. Preparar a solução B: Para cada reacção, adicionar 10 μL de tampão RPA, 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr e 3,9 μL de ddH₂O a um volume final de 15,5 μL.
      NOTA: F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr são os primers utilizados no ensaio contra o gene nrdB . Consulte a Tabela 1 para a sequência.
   3. Preparar a solução C: Para cada reacção, adicionar 1 μL de ssDNA reporter, 3 μL de tampão NEB 3.1, 1 μL de crRNA, 4 μL de Cas12a e 11 μL de ddH₂O a um volume final de 20 μL.
      NOTA: Se houver muitas amostras para detectar, faça um grande volume de solução B e solução C e alíquota mais tarde.
2. Isolamento do DNA total dos citros
   NOTA: Para economizar tempo e tornar este método adequado para a detecção de CLas de campo, a abordagem alcalina à base de polietilenoglicol (PEG) foi utilizada para a obtenção de extratos brutos de plantas para amplificação de DNA^22,23
   1. Folhas cítricas foram utilizadas neste protocolo. Primeiro, soque cinco discos de folha de uma folha. Em seguida, coloque os discos foliares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 200 μL de tampão A.
      NOTA: No campo, limpe as folhas primeiro se houver poeira cobrindo-as. Os discos foliares podem ser cortados usando a tampa do tubo de 1,5 mL para evitar a contaminação cruzada. Outros tecidos cítricos, como raízes, caules, frutos e flores, também podem ser utilizados neste protocolo.
   2. Moer os discos das folhas manualmente até alisar com uma haste de plástico.
   3. Deixe o tubo intacto por 10 min. Em seguida, use o sobrenadante para amplificação do DNA.
      NOTA: O ensaio pode ser pausado aqui, e os extratos de plantas brutas que foram extraídos pelo método alcalino-PEG podem ser armazenados a -20 °C por pelo menos 1 ano. As árvores de laranja doce de Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) mostradas no vídeo foram cultivadas em um vaso preenchido com uma mistura de 9/3/1 (v/v/v) solo de turfa/vermiculita/perlita e mantidas em uma estufa localizada no campus da Universidade Normal de Gannan, Jiangxi, China. As árvores infectadas pelo HLB foram inoculadas por enxertia com brotos de Newhall CLas-positivos. As árvores infectadas e não infectadas pelo HLB foram confirmadas por PCR. A CLas foi detectada usando o par de iniciadores (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) visando o gene nrdB marcador específico da CLas. Por outro lado, sintomas característicos de HLB, manchas manchadas e folhas amareladas podem ser encontrados em árvores CLas-positivas, mas não em árvores CLas-negativas.
3. Amplificação isotérmica do DNA
   1. Adicionar 1 μL do sobrenadante da etapa 1.2.3 e 1 μL de MgOAc (concentração final de 14 mM) à solução B e misturar bem.
   2. No laboratório, incube-os em uma incubadora simples a 37 °C por 15 min.
      NOTA: No campo, segure os tubos na mão por 15 min. Sugere-se também incubar tubos em uma incubadora simples a 37 °C por 15 min, se as condições permitirem.
4. Visualização de resultados
   1. Adicionar 10 μL da mistura da fase 1.3.2 à solução C e misturar bem.
   2. Incubá-los em uma incubadora de 37 °C por 60 min.
   3. Use óculos de proteção e observe o sinal de fluorescência verde liberado do repórter ssDNA rotulado com 5' 6-Fluoresceína a 5' e o quencher de fluorescência a 3' através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente (comprimento de onda de excitação: 440 nm, comprimento de onda de emissão: 500 nm).
      NOTA: sinal de fluorescência verde pode durar vários dias, é melhor
      CUIDADO: A luz emitida pelo dispositivo de detecção de fluorescência é prejudicial aos olhos. Certifique-se de usar óculos antes de observar os resultados.

2. Teste de especificidade

NOTA: Para testar a especificidade do CLas-DETECTR, a bactéria rizosfera Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) e Burkholderia stabilis cepa 1440 isoladas no laboratório²⁴ foram submetidas ao teste CLas-DETECTR.

NOTA: Candidatus Liberibacter (CLas) não pode ser cultivado. Só se pode obter DNA CLas a partir da extração de DNA genômico de tecidos cítricos infectados com CLas. Xcc é o agente causal de outra importante doença cítrica, o cancro cítrico. Burkholderia stabilis cepa 1440 é uma bactéria anti-Xcc isolada em laboratório. Portanto, cepas puras para todas essas três bactérias foram usadas.

1. Extraia o DNA genômico bacteriano (gDNA) usando um kit de extração de DNA genômico bacteriano seguindo o protocolo do fabricante. Use a água como um controle negativo.
2. Realizar PCR utilizando tiras de tubo de PCR de 0,2 mL com tampas ópticas em uma mistura de reação de 25 μL contendo 1 μL de F-RPA-RNRf, 1 μL de R-RPA-RNRr, 12,5 μL de Ex Taq Versão 2.0 mais corante, 1 μL de molde de DNA e 9,5 μL de H₂O.
   1. Utilizar as seguintes condições de reacção de ciclo térmico: 1 min a 98 °C; seguido de 35 ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 55 °C, 15 s a 72 °C; em seguida, 10 min a 72 °C; e segurar a 16 °C.
   2. Execute os produtos de PCR em gel de agarose a 1% a 120 V por 15 min.
3. Realizar qPCR em uma mistura de reação de 20 μL contendo 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr, 10 μL de 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL do molde de DNA e 7,4 μL de H₂O.
   1. Utilizar as seguintes condições de reacção de ciclo térmico: 30 s a 95 °C; seguido de 45 ciclos de 5 s a 95 °C e 32 s a 60 °C; e, em seguida, um estágio de curva de fusão de 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C e 15 s a 95 °C.
   2. Inclua três repetições técnicas em cada repetição.
4. Execute o método CLas-DETECTR seguindo as etapas 1.1–1.4.

3. Comparação de sensibilidade

1. Para testar a sensibilidade do CLas DETECTR, detecte uma série de diluições de fragmentos de DNA CLas usando PCR, CLas-DETECTR e qPCR, conforme descrito acima.
2. Amplificar um segmento de DNA com um comprimento de 1.060 pb de nrdB usando o conjunto de iniciadores F-RNR e R-RNR em uma mistura de reação de 100 μL contendo 4 μL de F-RNR, 4 μL de R-RNR, 50 μL de PrimeSTAR Max Premix, 2 μL de molde de DNA e 40 μL de H₂O, seguindo as condições de reação de ciclo térmico (30 s a 98 °C; seguido por 35 ciclos de 10 s a 98 °C, 15 s a 55 °C, 30 s a 72 °C; em seguida, 10 min a 72 °C; e segurar a 16 °C).
   NOTA: O gene nrdB (ribonucleotídeo redutase β- subunidade) é específico para CLas²¹. Pode-se facilmente obter o amplificador nrdB do gDNA cítrico CLas positivo usando o conjunto de primer F-RNR e R-RNR. O conjunto de iniciadores F-RNR e R-RNR amplifica um fragmento nrdB de 1.060 pb, enquanto o conjunto de primer F-RPA-RNR e R-RPA-RNR amplifica um fragmento de 104 pb do gene nrdB, que é a parte do fragmento nrdB de 1.060 pb.
3. Purifice os produtos de PCR com um kit de extração de gel de DNA seguindo o manual do fabricante.
4. Diluir os produtos de PCR que contêm os amplificadores nrdB com ddH₂O esterilizado.
5. Calcule o número de cópias do gene nrdB usando o número de cópia de DNA on-line comercialmente disponível e a calculadora de diluição.
6. Preparar diluições de ADN contendo 2,01 × 10⁶ cópias/μL, 2,01 × 10⁵ cópias/μL, 2,01 × 10⁴ cópias/μL, 2,01 × 10³ cópias/μL, 2,01 × 10 2 cópias/μL, 2,01 × 10¹ cópias/μL, 2,01 × 10⁰ cópias/μL e^2,01 × 10⁻¹ cópias/μL de fragmento de ADN CLas.

4. Detecção de amostras

NOTA: Após o teste de especificidade e sensibilidade, o método CLas-DETECTR foi utilizado para detectar a presença de CLas nas amostras de folhas de campo coletadas de laranjeiras doces Newhall cultivadas no viveiro de recursos de germoplasma no campus da Universidade Normal de Gannan, Jiangxi, China. Uma qPCR foi realizada para verificar os resultados.

1. Teste um total de 15 árvores. Use a água como um controle negativo.
2. Execute os métodos CLas-DETECTR e qPCR conforme descrito acima.
   NOTA: Devido às características de distribuição desigual da CLas em citros, as folhas com sintomas de HLB foram coletadas prioritariamente. Se uma árvore parecia saudável, as folhas foram coletadas aleatoriamenteCLas-DETECTR sistema funciona corretamente.

Resultados

Aqui, descrevemos uma plataforma portátil, CLas-DETECTR, que vasculha os sistemas RPA e CRISPR-Cas12a para diagnosticar o HLB em campo. O esquema do CLas-DETECTR é ilustrado na Figura 1A.

Quando amostras foliares das árvores de Newhall infectadas e não infectadas por HLB (Figura 1B), para as quais a presença de CLas foi confirmada por PCR (Figura 1C), foram submetidas ao teste CLas-DETECTR, observou-se sinal de fluorescência verde na amostra infectada por HL...

Discussão

Este estudo apresenta um método rápido e portátil para detecção de CLas denominado CLas-DETECTR, que combina os sistemas RPA e CRISPR-Cas12a. O fluxo de trabalho é ilustrado na Figura 1. O CLas-DETECTR detecta CLas com especificidade e sensibilidade (Figura 2 e Figura 3). Além disso, usando amostras de folhas de Newhall, o CLas-DETECTR detecta CLas com a mesma sensibilidade que a qPCR (Fi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit	Corning	09319KE1	China
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit	Solarbio	D1600	China
EnGen LbCas12a	TOLOBIO	32104-01	China
Ex Taq Version 2.0 plus dye	TaKaRa	RR902A	China
Handheld fluorescent detection device	LUYOR	3415RG	China
Hole puncher	Deli	114	China
Magnesium acetate, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	UK
NaOH	SCR	10019718	China
NEB buffer 3.1	NEB	B7203	USA
PCR strip tubes	LABSELECT	PST-0208-FT-C	China
PEG 200	Sigma	P3015	USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras	TaKaRa	R045A	China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	New England Biolabs	N0550S	USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	TaKaRa	RR820B	China
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT	UK