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要約

本研究では、CRISPR-Cas12aと組み合わせたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅に基づくカン ディダトゥス ・リベリバクター・アジアティカスの迅速、高感度、かつポータブルな検出法を開発しました。

要約

柑橘類栽培者による カンジダトゥス ・リベリバクター・アジアティカス(CLas)の早期発見は、早期介入を促進し、病気の蔓延を防ぎます。ここでは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅と、クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復/CRISPR関連12a(CRISPR-Cas12a)システムのヌクレアーゼ活性を利用した蛍光レポーターを組み合わせた、迅速でポータブルな黄龍峰(HLB)診断のための簡単な方法を紹介します。この技術の感度はPCRよりもはるかに高いです。さらに、この方法は、葉サンプルを使用した場合のqPCRと同様の結果を示しました。従来のCLas検出法と比較して、ここで紹介した検出方法は90分で完了し、PCR装置を使用する必要のない等温条件で動作します。さらに、結果は現場でハンドヘルド蛍光検出装置を介して視覚化することができます。

概要

黄龍峰(HLB)は、世界で最も問題のある柑橘類の病気の1つです1。HLBは、師部コロニー形成および潔癖性細菌カン ディダトゥ ス・リベリバクター属( Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)、 Ca. L. africanus、 Ca. L. americanus2を含む。中国と米国で最も一般的なHLB関連種はCLasであり、これはアジアの柑橘類のオオバコ(Diaphorina citri)または接ぎ木によって伝染します3。CLasに感染した後、柑橘類の木は死ぬまで成長の低下を示します2。CLasに感染した柑橘類の葉の一般的な症状は、しみのあるまだら、緑色の島(小さな円形の濃い緑色の点)、厚くて革のような葉の隆起したコルク状の静脈、および不均一な黄変芽です2。さらに、CLasに感染した果物は小さくて偏っているように見えます2。

HLBに耐性のある柑橘類の品種はなく、HLBの治療法もないため、HLBの予防にはCLas陽性の柑橘類の木の検疫と分離が必要です2,3。したがって、CLasの蔓延を防ぎ、経済的損失を最小限に抑えるための監視と検疫には、早期発見が重要です3。さらに、感染初期の植物ではCLasの力価が低いため、高感度のCLas検出が必要です3。中国では、CLas検出は通常、特定の認定テストセンターによって実施されます。ただし、検出プロセスには通常少なくとも1週間かかり、検出料金は高額です。したがって、HLB発生率の監視を支援するために

HLB 4,5,6,7,8,9を診断するために様々な技術が適用されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と定量PCR(qPCR)は、その高い感度と特異性により、CLas検出に最もよく使用されるツールです4,5。ただし、これらのテクノロジーは、高価な機器と高度なスキルを持つ人材に大きく依存しています。さらに、ループ媒介等温増幅(LAMP)などのいくつかの等温増幅法は、その単純さ、迅速性、および低コストのために、従来のPCR法の魅力的な代替手段として開発されています8,9,10。しかし、非特異的な増幅シグナルによりCLasを正確に検出するためにそれらを適用することは困難であり、偽陽性の結果を引き起こす可能性があります。

RNAガイド下CRISPR/Cas(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復/CRISPR関連)エンドヌクレアーゼベースの核酸検出は、その高い感度、特異性、および信頼性により、次世代の分子診断技術として開発されました11,12,13,14。これらのCRISPR/Cas診断技術は、Casタンパク質の側副ヌクレアーゼ活性に依存して、オリゴヌクレオチドの両端にある蛍光レポーターと蛍光消光物質で修飾された一本鎖DNA(ssDNA)を切断し、放出された蛍光レポーターを捕捉する蛍光検出装置を備えています11,12。.CRISPR RNA(crRNA)標的二重鎖によって活性化されるいくつかのCasエフェクターのヌクレアーゼ活性は、周囲の非標的ssDNAを無差別に切断することができる11。クラス2型V-A CRISPR/CasシステムであるCRISPR-Cas12a(Cpf 1とも呼ばれる)は、Cas9と比較して、ミスマッチ耐性が低く、特異性が高いなど、いくつかの利点を示しています13。Cas12a/crRNAシステムは、ヒト病原体および植物病原体の核酸の高感度かつ特異的な検出に適用されています14,15,16,17,18。したがって、Cas12a/crRNAシステムを利用することで、CLasの核酸を正確かつ高感度に検出できるはずです。

Cas12a単独では、低レベルの核酸を検出するのに十分な感度は理論的にありません。したがって、その検出感度を向上させるために、CRISPR−Cas12a検出は、典型的には等温増幅ステップ14、15と組み合わされる。リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)は、37°Cから42°Cの温度範囲で高感度かつ迅速な等温DNA増幅を可能にします19。

Cas12aのDNase活性とRPAおよび蛍光読み出しを組み合わせたDETECTR(DNAエンドヌクレアーゼ標的CRISPR トランス レポーター)と呼ばれる検出プラットフォームが最近考案され12 、より高感度で核酸を検出することが示されています20。さらに、陽性サンプルから放出された蛍光シグナルは、現場でハンドヘルド蛍光検出装置を介して観察することができる。

RPAでDNAを増幅し、CLas21に特異的な5コピーnrdB(リボヌクレオチド還元酵素β-サブユニット)遺伝子を標的とするcrRNAを設計し、Cas12aタンパク質のDNase活性を利用したことから、このCLas検出法をCLas-DETECTRと名付けました。既存のCLas検出方法と比較して、CLas-DETECTRは高速、正確、高感度、および展開可能です。

プロトコル

1. クラスディテクタの構築

注:CLas-DETECTRの構築は、溶液調製、柑橘類の全DNA単離、等温DNA増幅、および結果の視覚化の4段階のプロセスです。CLas-DETECTRアッセイの概略図を 図1Aに示す。

  1. 溶液調製
    1. バッファーA:6%PEG200中の20 mM NaOHを調製します。100 mLの場合、113 mgのNaOHと6 gのPEG 200をボトル内の80 mLのH2Oに加えます。すべてのPEG200が溶解するまで、60°Cの水浴中でボトルをインキュベートします。次いで、H2Oを100mLの容量に添加する。
    2. 溶液Bの調製:各反応について、10 μLのRPAバッファー、0.8 μLのF-RPA-RNRf、0.8 μLのR-RPA-RNRr、および3.9 μLのddH2Oを最終容量15.5 μLに加えます。
      注:F-RPA-RNRfおよびR-RPA-RNRrは、 NRDB 遺伝子に対するアッセイで使用されるプライマーです。シーケンスについては 、表 1 を参照してください。
    3. 溶液Cの調製:各反応について、1 μLのssDNAレポーター、3 μLのNEBバッファー3.1、1 μLのcrRNA、4 μLのCas12a、および11 μLのddH2Oを最終容量20 μLに加えます。
      注:検出するサンプルが多い場合は、溶液Bと溶液Cを大量に作成し、後で分注します。
  2. 柑橘類の全DNA単離
    注:時間を節約し、この方法をフィールドCLas検出に適したものにするために、アルカリポリエチレングリコール(PEG)ベースのアプローチを使用して、DNA増幅用の粗植物抽出物を取得しました22,23。
    1. このプロトコルでは柑橘類の葉が使用されました。まず、葉から5枚のリーフディスクを打ち抜きます。次に、リーフディスクを1.5 mLの微量遠心チューブに入れ、200 μLのバッファーAを加えます。
      注意: 畑では、葉を覆うほこりがある場合は、最初に葉を掃除してください。リーフディスクは、クロスコンタミネーションを避けるために、1.5 mLチューブの蓋を使用してクリップできます。根、茎、果物、花などの他の柑橘類の組織もこのプロトコルで使用できます。
    2. プラスチック棒で滑らかになるまでリーフディスクを手動で挽きます。
    3. チューブを10分間邪魔しないでください。次に、上清をDNA増幅に使用します。
      注:アッセイはここで一時停止することができ、アルカリPEG法によって抽出された粗植物抽出物は、少なくとも1年間-20°Cで保存することができます。ビデオに示されているニューホールスイートオレンジ(Citrus sinensis Osbeck var. Newhall)の木は、9/3/1(v / v / v)泥炭土壌/バーミキュライト/パーライトの混合物で満たされたポットで栽培され、中国江西省の甘南師範大学のキャンパスにある温室で維持されました。HLBに感染した樹木には、CLas陽性のニューホール芽を接種して接種しました。HLB感染樹とHLB非感染樹をPCRで確認した。CLasは、CLas特異的マーカー遺伝子 nrdBを標的とするプライマーペア(F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr)を用いて検出した。一方、特徴的なHLB症状、しみのある斑点、および黄変葉は、CLas陽性の木には見られますが、CLas陰性の木には見られません。
  3. 等温DNA増幅
    1. ステップ1.2.3の上清1 μLとMgOAc(終濃度14 mM)1 μLをB液に加え、よく混合します。
    2. ラボで、37°Cのシンプルなインキュベーターで15分間インキュベートします。
      注意: 現場で、チューブを手に15分間保持します。また、条件が許せば、37°Cの単純なインキュベーターで15分間チューブをインキュベートすることをお勧めします。
  4. 結果の視覚化
    1. ステップ1.3.2の混合物10 μLを溶液Cに加え、よく混合します。
    2. 37°Cのインキュベーターで60分間インキュベートします。
    3. ゴーグルを着用し、5'に5'6-フルオレセインで標識されたssDNAレポーターから放出される緑色の蛍光シグナルを、3'で蛍光消光器をハンドヘルド蛍光検出装置(励起波長:440 nm、発光波長:500 nm)で観察します。
      注:緑色の蛍光シグナルは数日間続くことがあります、それはより良いです
      注意: 蛍光検出装置から発せられる光は目に有害です。結果を観察する前に、必ずゴーグルを着用してください。

2.特異性試験

注:CLas-DETECTRの特異性をテストするために、ラボ24で分離された根圏細菌アグロバクテリウムツメファシエンスGV3101、キサントモナスシトリ亜種シトリ(Xcc)、およびバークホルデリアスタビリス株1440をCLas-DETECTRテストにかけました。

注:カンディダトゥス・リベリバクター(CLas)は培養できません。CLasに感染した柑橘類組織からのゲノムDNAの抽出からのみCLas DNAを得ることができます。 Xcc は、別の重要な柑橘類の病気である柑橘類の潰瘍の原因物質です。 バークホルデリア・スタビリス 株1440は、実験室で単離された抗Xcc 細菌である。したがって、これら3つの細菌すべてに純粋な株が使用されました

  1. メーカーのプロトコルに従って、細菌ゲノムDNA抽出キットを使用して細菌ゲノムDNA(gDNA)を抽出します。ネガティブコントロールとして水を使用してください。
  2. 1 μLのF-RPA-RNRf、1 μLのR-RPA-RNRr、12.5 μLのEx Taqバージョン2.0と色素、1 μLのDNAテンプレート、および9.5 μLのH 2 Oを含む25 μLの反応混合物中で、光学キャップ付きの0.2mL PCRチューブストリップを使用してPCRを実行します。
    1. 以下の熱サイクル反応条件を使用する:98°Cで1分間;その後、98°Cで10秒、55°Cで30秒、72°Cで15秒の35サイクルが続きます。その後、72°Cで10分間;16°Cで保持します。
    2. PCR産物を1%アガロースゲルで120 Vで15分間実行します。
  3. 0.8 μLのF-RPA-RNRf、0.8 μLのR-RPA-RNRr、10 μLの2x TBグリーンプレミックスEx Taq II(Tli RNaseH Plus)、1 μLのDNAテンプレート、および7.4 μLのH2Oを含む20 μLの反応混合物でqPCRを実行します。
    1. 以下の熱サイクル反応条件を使用する:95°Cで30秒;続いて、95°Cで5秒、60°Cで32秒の45サイクル。その後、95°Cで15秒、60°Cで1分、95°Cで15秒のメルトカーブステージ。
    2. 各繰り返しに 3 つの技術的な繰り返しを含めます。
  4. CLas-DETECTR メソッドを手順 1.1 から 1.4 に従って実行します。

3. 感度比較

  1. CLas DETECTRの感度をテストするには、上記のように、PCR、CLas-DETECTR、およびqPCRを使用して一連のCLas DNAフラグメント希釈を検出します。
  2. 4 μLのF-RNR、4 μLのR-RNR、50 μLのPrimeSTAR Maxプレミックス、2 μLのDNAテンプレート、および40 μLのH2Oを含む100 μLの反応混合物中で、プライマーセットF-RNRおよびR-RNRを使用して、nrdBから長さ1,060 bpのDNAセグメントを増幅します(98°Cで30秒、続いて98°Cで10秒を35サイクル、 55°Cで15秒、72°Cで30秒。その後、72°Cで10分間;16°C)で保持する。
    注: nrdB(リボヌクレオチドレダクターゼβ-サブユニット)遺伝子はCLas21に特異的です。プライマーセットF-RNRおよびR-RNRを用いて、CLas陽性の柑橘類gDNAから nrdB アンプリコンを容易に得ることができる。プライマーセットF-RNRおよびR-RNRは1,060 bp nrdBフラグメントを増幅し、プライマーセットF-RPA-RNRおよびR-RPA-RNRは、1,060 bp nrdBフラグメントの一部である nrdB 遺伝子の104 bpフラグメントを増幅します。
  3. メーカーのマニュアルに従って、DNAゲル抽出キットを使用してPCR産物を精製します。
  4. nrdBアンプリコンを含むPCR産物を滅菌したddH2Oで希釈します。
  5. 市販のオンラインDNAコピー数および希釈計算機を用いて nrdB 遺伝子のコピー数を計算する。
  6. CLas DNAフラグメントの2.01 × 106 コピー/μL、2.01 × 105 コピー/μL、2.01 × 104 コピー/μL、2.01 × 103 コピー/μL、2.01 ×10 2コピー/μL、2.01 × 101 コピー/μL、2.01 × 100 コピー/μL、および2.01 × 10-1 コピー/μLを含むDNA希釈液を調製します。

4. サンプル検出

注:特異性と感度のテストの後、CLas-DETECTR法を使用して、中国江西省の甘南師範大学のキャンパスにある生殖質資源保育園で栽培されたニューホールスイートオレンジの木から収集されたフィールドリーフサンプル中のCLasの存在を検出しました。結果を検証するためにqPCRを実施した。

  1. 合計15本の木をテストします。ネガティブコントロールとして水を使用してください。
  2. 上記のように、CLas-DETECTR メソッドおよび qPCR メソッドを実行します。
    注:カンキツのCLasの分布特性が不均一であるため、HLB症状を示す葉が優先的に収集されました。木が健康に見えた場合、葉はランダムに収集されましたCLas-DETECTRシステムは正しく機能します。

結果

ここでは、RPAシステムとCRISPR-Cas12aシステムを組み合わせて現場でHLBを診断するポータブルプラットフォームCLas-DETECTRについて説明しました。CLas-DETECTR のスキーマを 図 1A に示します。

PCRでCLasの存在が確認されたHLB感染ニューホール樹木の葉サンプル(図1B)(図1C)をCLas-DETECTRテストにかけると、HLB感染サン?...

ディスカッション

本研究では、RPAシステムとCRISPR-Cas12aシステムを組み合わせたCLas-DETECTRと名付けられたCLasを検出するための迅速でポータブルな方法を提示します。このワークフローを図 1 に示します。CLas-DETECTRは、特異性と感度でCLasを検出します(図2および図3)。さらに、ニューホールの葉サンプルを用いて、CLas-DETECTRはqPCRと同...

開示事項

著者は、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

この作業は、中国の国家重点研究開発プログラム(2021YFD1400805)、江西省の主要科学技術研究開発プログラム(20194ABC28007)、江西省教育局のプロジェクト(GJJ201449)、および江西省における現代農業科学研究の共同イノベーション(JXXTCX2015002(3+2)-003)によって財政的に支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AxyPrep DNA Gel Extraction KitCorning09319KE1China
Bacterial Genomic DNA Extraction KitSolarbioD1600China
EnGen LbCas12a TOLOBIO32104-01China
Ex Taq Version 2.0 plus dyeTaKaRaRR902AChina
Handheld fluorescent detection device LUYOR3415RGChina
Hole puncher Deli114China
Magnesium acetate, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
NaOHSCR10019718China
NEB buffer 3.1 NEBB7203USA
PCR strip tubesLABSELECTPST-0208-FT-CChina
PEG 200 SigmaP3015USA
PrimeSTAR Max DNA PolymerasTaKaRaR045AChina
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder New England BiolabsN0550SUSA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820BChina
TwistAmp BasicTwistDxTABAS03KITUK

参考文献

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