Freilandfähiger Candidatus liberibacter asiaticus-Nachweis mittels Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurde eine schnelle, empfindliche und tragbare Nachweismethode für Candidatus Liberibacter asiaticus entwickelt, die auf Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a basiert.

Zusammenfassung

Die Früherkennung von Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) durch Zitrusbauern erleichtert ein frühzeitiges Eingreifen und verhindert die Ausbreitung von Krankheiten. Eine einfache Methode zur schnellen und tragbaren Huanglongbing (HLB) -Diagnose wird hier vorgestellt, die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und einen Fluoreszenzreporter kombiniert, der die Nukleaseaktivität des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a) -Systems nutzt. Die Sensitivität dieser Technik ist viel höher als die PCR. Darüber hinaus zeigte diese Methode ähnliche Ergebnisse wie qPCR, wenn Blattproben verwendet wurden. Im Vergleich zu herkömmlichen CLas-Nachweismethoden kann das hier vorgestellte Nachweisverfahren in 90 min abgeschlossen werden und arbeitet in einem isothermen Zustand, der den Einsatz von PCR-Geräten nicht erfordert. Darüber hinaus können die Ergebnisse durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld visualisiert werden.

Einleitung

Huanglongbing (HLB) ist eine der problematischsten Zitruskrankheiten weltweit¹. HLB wird durch die phloemkolonisierenden und anspruchsvollen Bakterien Candidatus Liberibacter spp. verursacht, einschließlich Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus und Ca. L. americanus ². Die häufigste HLB-assoziierte Art in China und den USA ist CLas, die durch asiatische Zitruspsylliden (Diaphorina citri) oder durch Pfropfen übertragen^{wird 3}. Nach der Infektion mit CLas zeigen Zitrusbäume einen Wachstumsrückgang bis zum Tod². Die häufigsten Symptome von Zitrusblättern, die mit CLas infiziert sind, sind fleckige Flecken, grüne Inseln (kleine kreisförmige dunkelgrüne Punkte), erhöhte korkige Adern auf dickeren und ledrigen Blättern und ungleichmäßige vergilbte Triebe². Darüber hinaus erscheinen mit CLas infizierte Früchte klein und schief².

Da keine Zitrussorte gegen HLB resistent ist und es keine therapeutische Heilung für HLB gibt, erfordert die Prävention von HLB die Quarantäne und Isolierung von CLas-positiven Zitrusbäumen ^2,3. Daher ist die Früherkennung entscheidend für die Überwachung und Quarantäne, um die Ausbreitung von CLas zu verhindern und wirtschaftliche Verluste zu minimieren³. Darüber hinaus ist ein empfindlicher CLas-Nachweis aufgrund des niedrigen Titers von CLas in Pflanzen im frühen Stadium der Infektion erforderlich³. In China wird die CLas-Erkennung in der Regel von bestimmten zertifizierten Testzentren durchgeführt. Der Erkennungsprozess dauert jedoch in der Regel mindestens 1 Woche und die Erkennungsgebühr ist teuer. Um die HLB-Inzidenz zu überwachen,

Verschiedene Technologien wurden angewendet, um HLB ^4,5,6,7,8,9 zu diagnostizieren. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und quantitative PCR (qPCR) sind aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Spezifität die am häufigsten verwendeten Werkzeuge für den CLas-Nachweis ^4,5. Diese Technologien hängen jedoch stark von teuren Instrumenten und hochqualifiziertem Personal ab. Darüber hinaus wurden mehrere isotherme Amplifikationsmethoden, wie die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP), aufgrund ihrer Einfachheit, Schnelligkeit und niedrigen Kosten als attraktive Alternativen zu herkömmlichen PCR-Methoden entwickelt ^8,9,10. Es ist jedoch schwierig, sie anzuwenden, um CLas aufgrund der unspezifischen Verstärkungssignale genau zu erkennen, was zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann.

RNA-gesteuerter CRISPR/Cas (Clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-assoziierter) Endonuklease-basierter Nukleinsäurenachweis wurde aufgrund seiner hohen Sensitivität, Spezifität und Zuverlässigkeit als molekulardiagnostische Technologie der nächsten Generation entwickelt^11,12,13,14. Diese CRISPR/Cas-Diagnostiktechnologien beruhen auf der kollateralen Nukleaseaktivität von Cas-Proteinen, um einzelsträngige DNA (ssDNA) zu spalten, die mit einem fluoreszierenden Reporter und einem Fluoreszenzlöscher an jedem Ende der Oligonukleotide modifiziert wurde, sowie einer Fluoreszenzdetektionsvorrichtung zur Erfassung des freigesetzten Fluoreszenzreporters^11,12 . Die Nukleaseaktivität mehrerer Cas-Effektoren, die durch den CRISPR-RNA (crRNA)-Zielduplex aktiviert werden, kann die umgebende Nicht-Ziel-ssDNA¹¹ wahllos spalten. CRISPR-Cas12a (auch Cpf 1 genannt), ein CRISPR/Cas-System der Klasse 2 Typ V-A, weist im Vergleich zu Cas9 mehrere Vorteile auf, wie z. B. eine geringere Fehlanpassungstoleranz und eine größere Spezifität¹³. Das Cas12a/crRNA-System wurde für den sensitiven und spezifischen Nachweis der Nukleinsäuren humanpathogener und phytopathogener 14,15,16,17,18 eingesetzt. Daher sollte die Verwendung des Cas12a/crRNA-Systems den genauen und empfindlichen Nachweis der Nukleinsäure von CLas ermöglichen.

Cas12a allein ist theoretisch nicht empfindlich genug, um niedrige Konzentrationen von Nukleinsäuren nachzuweisen. Um seine Detektionsempfindlichkeit zu verbessern, wird der CRISPR-Cas12a-Nachweis daher typischerweise mit einem isothermen Amplifikationsschritt^14,15 kombiniert. Die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) ermöglicht eine empfindliche und schnelle isotherme DNA-Amplifikation in einem Temperaturbereich von 37 °C bis 42 °C¹⁹.

Eine Detektionsplattform namens DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), die die DNase-Aktivität von Cas12a mit RPA und einer Fluoreszenzanzeige kombiniert, wurde kürzlich entwickelt¹² und es wurde gezeigt, dass sie Nukleinsäure mit höherer Empfindlichkeit detektiert²⁰. Darüber hinaus kann das von den positiven Proben emittierte Fluoreszenzsignal durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld beobachtet werden.

Da wir DNA mit RPA amplifizierten, crRNA entwickelten, die auf das CLas-21-spezifische Gen nrdB (Ribonukleotidreduktase β-Untereinheit) abzielt, und die DNase-Aktivität des Cas12a-Proteins verwendeten, nannten wir diese CLas-Nachweismethode CLas-DETECTR. Im Vergleich zu bestehenden CLas-Erkennungsmethoden ist CLas-DETECTR schnell, genau, empfindlich und einsetzbar.

Protokoll

1. Aufbau des CLas-DETECTR

HINWEIS: Die Konstruktion von CLas-DETECTR ist ein vierstufiger Prozess: Lösungsvorbereitung, Gesamt-DNA-Isolierung von Zitrusfrüchten, isotherme DNA-Amplifikation und Ergebnisvisualisierung. Das Schema des CLas-DETECTR-Assays ist in Abbildung 1A dargestellt.

1. Lösungsvorbereitung
   1. Puffer A: 20 mM NaOH in 6% PEG 200 vorbereiten. Für 100 ml 113 mg NaOH und 6 g PEG 200 in 80 ml_H2Oin einer Flasche geben. Die Flasche in einem Wasserbad bei 60 °C inkubieren, bis sich das gesamte PEG 200 aufgelöst hat. Dann fügen Sie H₂O zu einem Volumen von 100 ml hinzu.
   2. Lösung B vorbereiten: Für jede Reaktion werden 10 μL RPA-Puffer, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr und 3,9 μL_ddH2Ozu einem Endvolumen von 15,5 μL hinzugefügt.
      HINWEIS: F-RPA-RNRf und R-RPA-RNRr sind die Primer, die im Assay gegen das nrdB-Gen verwendet werden. Siehe Tabelle 1 für die Reihenfolge.
   3. Lösung C vorbereiten: Für jede Reaktion werden 1 μL ssDNA-Reporter, 3 μL NEB-Puffer 3.1, 1 μL crRNA, 4 μL Cas12a und 11 μL_ddH2Ozu einem Endvolumen von 20 μL hinzugefügt.
      HINWEIS: Wenn viele Proben zu erkennen sind, stellen Sie eine große Menge Lösung B und Lösung C her und aliquoten Sie später.
2. Totale DNA-Isolierung von Zitrusfrüchten
   HINWEIS: Um Zeit zu sparen und diese Methode für den CLas-Nachweis im Feld geeignet zu machen, wurde der auf alkalischem Polyethylenglykol (PEG) basierende Ansatz verwendet, um rohe Pflanzenextrakte für die DNA-Amplifikation zu erhalten^22,23
   1. In diesem Protokoll wurden Zitrusblätter verwendet. Stanzen Sie zuerst fünf Blattscheiben von einem Blatt. Als nächstes legen Sie die Blattscheiben in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 200 μL Puffer A hinzu.
      HINWEIS: Reinigen Sie die Blätter auf dem Feld zuerst, wenn Staub sie bedeckt. Die Blattscheiben können mit dem Deckel des 1,5-ml-Röhrchens abgeschnitten werden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Andere Zitrusgewebe wie Wurzeln, Stängel, Früchte und Blumen können ebenfalls in diesem Protokoll verwendet werden.
   2. Schleifen Sie die Blattscheiben manuell mit einem Kunststoffstab, bis sie glatt sind.
   3. Lassen Sie die Röhre 10 min ungestört. Verwenden Sie dann den Überstand für die DNA-Amplifikation.
      HINWEIS: Der Assay kann hier pausiert werden, und die rohen Pflanzenextrakte, die mit der alkalischen PEG-Methode extrahiert wurden, können bei −20 °C für mindestens 1 Jahr gelagert werden. Die im Video gezeigten Newhall-Süßorangenbäume (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) wurden in einem Topf angebaut, der mit einer Mischung aus 9/3/1 (v / v / v) Torferde / Vermiculit / Perlit gefüllt war, und in einem Gewächshaus auf dem Campus der Gannan Normal University, Jiangxi, China, gepflegt. Die HLB-infizierten Bäume wurden durch Pfropfen mit CLas-positiven Newhall-Knospen geimpft. Die HLB-infizierten und HLB-nicht infizierten Bäume wurden mittels PCR bestätigt. CLas wurde unter Verwendung des Primerpaares (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) nachgewiesen, das auf das CLas-spezifische Markergen nrdB abzielt. Auf der anderen Seite können charakteristische HLB-Symptome, fleckige Flecken und gelbliche Blätter auf CLas-positiven, aber nicht auf CLas-negativen Bäumen gefunden werden.
3. Isotherme DNA-Amplifikation
   1. 1 μL des Überstands aus Schritt 1.2.3 und 1 μL MgOAc (14 mM Endkonzentration) in Lösung B geben und gut mischen.
   2. Im Labor inkubieren Sie sie in einem einfachen Inkubator bei 37 °C für 15 min.
      HINWEIS: Halten Sie die Röhrchen im Feld 15 Minuten lang in der Hand. Es wird auch empfohlen, Röhrchen in einem einfachen Inkubator bei 37 °C für 15 min zu inkubieren, wenn die Bedingungen dies zulassen.
4. Visualisierung der Ergebnisse
   1. 10 μl der Mischung aus Schritt 1.3.2 in Lösung C geben und gut mischen.
   2. Inkubieren Sie sie in einem 37 °C Inkubator für 60 min.
   3. Tragen Sie eine Schutzbrille und beobachten Sie das grüne Fluoreszenzsignal, das vom mit 5' 6-Fluorescein markierten ssDNA-Reporter bei 5' und dem Fluoreszenzlöscher bei 3' durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät (Anregungswellenlänge: 440 nm, Emissionswellenlänge: 500 nm) freigesetzt wird.
      HINWEIS: grünes Fluoreszenzsignal kann mehrere Tage dauern, es ist besser,
      ACHTUNG: Das vom Fluoreszenzdetektionsgerät emittierte Licht ist schädlich für die Augen. Stellen Sie sicher, dass Sie eine Schutzbrille tragen, bevor Sie die Ergebnisse beobachten.

2. Spezifitätstest

HINWEIS: Um die Spezifität von CLas-DETECTR zu testen, wurden das Rhizosphärenbakterium Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) und Burkholderia stabilis Stamm 1440, die im Labor²⁴ isoliert wurden, dem CLas-DETECTR-Test unterzogen.

HINWEIS: Candidatus Liberibacter (CLas) kann nicht kultiviert werden. CLas-DNA kann man nur aus der Extraktion genomischer DNA aus mit CLas infiziertem Zitrusgewebe gewinnen. Xcc ist der Erreger einer anderen wichtigen Zitruskrankheit, Zitruskrebs. Burkholderia stabilis Stamm 1440 ist ein Anti-Xcc-Bakterium , das im Labor isoliert wurde. Daher wurden für alle diese drei Bakterien reine Stämme verwendet.

1. Extrahieren Sie die bakterielle genomische DNA (gDNA) mit einem bakteriellen genomischen DNA-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie Wasser als Negativkontrolle.
2. Die PCR wird unter Verwendung von 0,2-ml-PCR-Röhrchenstreifen mit optischen Kappen in einem 25-μL-Reaktionsgemisch durchgeführt, das 1 μL F-RPA-RNRf, 1 μL R-RPA-RNRr, 12,5 μL Ex Taq Version 2.0 plus Farbstoff, 1 μL DNA-Vorlage und 9,5 μL_H2Oenthält.
   1. Verwenden Sie die folgenden thermischen Reaktionsbedingungen: 1 min bei 98 °C; gefolgt von 35 Zyklen von 10 s bei 98 °C, 30 s bei 55 °C, 15 s bei 72 °C; dann 10 min bei 72 °C; und bei 16 °C halten.
   2. Lassen Sie die PCR-Produkte 15 Minuten lang auf 1% Agarosegel bei 120 V laufen.
3. Die qPCR wird in einem 20-μL-Reaktionsgemisch durchgeführt, das 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr, 10 μL 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL der DNA-Vorlage und 7,4 μL_H2Oenthält.
   1. Verwenden Sie die folgenden thermischen Reaktionsbedingungen: 30 s bei 95 °C; gefolgt von 45 Zyklen von 5 s bei 95 °C und 32 s bei 60 °C; und dann eine Schmelzkurvenstufe von 15 s bei 95 °C, 1 min bei 60 °C und 15 s bei 95 °C.
   2. Fügen Sie jeder Wiederholung drei technische Wiederholungen hinzu.
4. Führen Sie die CLas-DETECTR-Methode gemäß den Schritten 1.1 bis 1.4 aus.

3. Sensitivitätsvergleich

1. Um die Empfindlichkeit von CLas DETECTR zu testen, detektieren Sie eine Reihe von CLas-DNA-Fragmentverdünnungen mittels PCR, CLas-DETECTR und qPCR, wie oben beschrieben.
2. Amplifizieren Sie ein DNA-Segment mit einer Länge von 1.060 bp aus nrdB unter Verwendung des Primersets F-RNR und R-RNR in einem 100 μL Reaktionsgemisch, das 4 μL F-RNR, 4 μL R-RNR, 50 μL PrimeSTAR Max Premix, 2 μL DNA-Vorlage und 40 μL_{H2O enthält}, nach den thermischen Reaktionsbedingungen (30 s bei 98 °C; gefolgt von 35 Zyklen von 10 s bei 98 °C, 15 s bei 55 °C, 30 s bei 72 °C; dann 10 min bei 72 °C; und bei 16 °C halten).
   HINWEIS: Das nrdB (Ribonukleotidreduktase β- Untereinheit) Gen ist spezifisch für^{CLas 21}. Man kann das nrdB-Amplikon leicht aus CLas-positiver Citrus-gDNA mit dem Primer-Set F-RNR und R-RNR erhalten. Das Primer-Set F-RNR und R-RNR amplifiziert ein 1.060 bp nrdB-Fragment, während das Primer-Set F-RPA-RNR und R-RPA-RNR ein 104 bp Fragment des nrdB-Gens amplifiziert, das der Teil des 1.060 bp nrdB-Fragments ist.
3. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem DNA-Gel-Extraktionskit gemäß dem Handbuch des Herstellers.
4. Die PCR-Produkte, die die nrdB-Amplicons enthalten, werden mit sterilisiertem_ddH2Overdünnt.
5. Berechnen Sie die Kopienzahl des nrdB-Gens unter Verwendung der handelsüblichen Online-DNA-Kopiennummer und des Verdünnungsrechners.
6. DNA-Verdünnungen mit 2,01 × 10⁶ Kopien/μL, 2,01 × 10⁵ Kopien/μL, 2,01 × 10⁴ Kopien/μL, 2,01 × 10³ Kopien/μL, 2,01 × 10 2 Kopien/μL, 2,01 × 10¹ Kopien/μL, 2,01 × 10⁰ Kopien/μL und^2,01 × 10−1 Kopien/μL CLas-DNA-Fragment enthalten.

4. Probenerkennung

HINWEIS: Nach dem Spezifitäts- und Sensitivitätstest wurde die CLas-DETECTR-Methode verwendet, um das Vorhandensein von CLas in den Feldblattproben nachzuweisen, die von Newhall-Süßorangenbäumen gesammelt wurden, die in der Keimplasma-Ressourcengärtnerei auf dem Campus der Gannan Normal University, Jiangxi, China, angebaut wurden. Eine qPCR wurde durchgeführt, um die Ergebnisse zu verifizieren.

1. Testen Sie insgesamt 15 Bäume. Verwenden Sie Wasser als Negativkontrolle.
2. Führen Sie die Methoden CLas-DETECTR und qPCR wie oben beschrieben aus.
   HINWEIS: Aufgrund der ungleichmäßigen Verteilungsmerkmale von CLas in Zitrusfrüchten wurden Blätter mit HLB-Symptomen vorrangig gesammelt. Wenn ein Baum gesund aussah, wurden die Blätter zufällig gesammeltCLas-DETECTR-System funktioniert korrekt.

Ergebnisse

Hier haben wir eine tragbare Plattform, CLas-DETECTR, beschrieben, die die RPA- und CRISPR-Cas12a-Systeme kombiniert, um HLB im Feld zu diagnostizieren. Das Schema von CLas-DETECTR ist in Abbildung 1A dargestellt.

Wenn Blattproben von HLB-infizierten und HLB-nicht infizierten Newhall-Bäumen (Abbildung 1B), für die das Vorhandensein von CLas durch PCR bestätigt wurde (Abbildung 1C), dem CLas-DETECTR-Test unterzogen wurden, wurde ein grünes Fluoreszenzsignal in ...

Diskussion

Diese Studie stellt eine schnelle und tragbare Methode zum Nachweis von CLas namens CLas-DETECTR vor, die die Systeme RPA und CRISPR-Cas12a kombiniert. Der Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. CLas-DETECTR erkennt CLas mit Spezifität und Sensitivität (Abbildung 2 und Abbildung 3). Darüber hinaus detektiert CLas-DETECTR mithilfe von Newhall-Blattproben CLas mit der gleichen Empfindlichkeit wie qPCR (

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit	Corning	09319KE1	China
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit	Solarbio	D1600	China
EnGen LbCas12a	TOLOBIO	32104-01	China
Ex Taq Version 2.0 plus dye	TaKaRa	RR902A	China
Handheld fluorescent detection device	LUYOR	3415RG	China
Hole puncher	Deli	114	China
Magnesium acetate, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	UK
NaOH	SCR	10019718	China
NEB buffer 3.1	NEB	B7203	USA
PCR strip tubes	LABSELECT	PST-0208-FT-C	China
PEG 200	Sigma	P3015	USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras	TaKaRa	R045A	China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder	New England Biolabs	N0550S	USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	TaKaRa	RR820B	China
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT	UK