Protocolos para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis

Resumen

Este artículo presenta los protocolos paso a paso para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis. Los pasos detallados proporcionados por este protocolo estandarizado servirán como una guía útil para generar moscas mutantes para estudios de genes funcionales en B. dorsalis.

Resumen

La mosca oriental de la fruta, Bactrocera dorsalis, es una especie de plaga altamente invasiva y adaptativa que causa daños a los cítricos y a más de 150 cultivos frutales en todo el mundo. Dado que las moscas adultas de la fruta tienen una gran capacidad de vuelo y las hembras ponen sus huevos debajo de las pieles de la fruta, los insecticidas que requieren contacto directo con la plaga generalmente funcionan mal en el campo. Con el desarrollo de herramientas de biología molecular y tecnología de secuenciación de alto rendimiento, muchos científicos están tratando de desarrollar estrategias de manejo de plagas respetuosas con el medio ambiente. Estos incluyen ARNi o pesticidas basados en la edición de genes que regulan a la baja o silencian los genes (objetivos moleculares), como los genes olfativos involucrados en el comportamiento de búsqueda, en varias plagas de insectos. Para adaptar estas estrategias para el control de la mosca oriental de la fruta, se necesitan métodos efectivos para la investigación genética funcional. Los genes con funciones críticas en la supervivencia y reproducción de B. dorsalis sirven como buenos objetivos moleculares para la eliminación y / o silenciamiento de genes. El sistema CRISPR/Cas9 es una técnica fiable utilizada para la edición de genes, especialmente en insectos. Este artículo presenta un método sistemático para la mutagénesis CRISPR / Cas9 de B. dorsalis, incluido el diseño y la síntesis de ARN guía, la recolección de embriones, la inyección de embriones, la cría de insectos y la detección de mutantes. Estos protocolos servirán como una guía útil para generar moscas mutantes para los investigadores interesados en estudios de genes funcionales en B. dorsalis.

Introducción

La mosca oriental de la fruta, Bactrocera dorsalis , es una especie cosmopolita de plaga de insectos que causa daños a más de 150 especies de cultivos frutales, incluyendo guayaba, mango, Eugenia spp., cereza de Surinam, cítricos, níspero y papaya¹. Los daños causados solo en la provincia de Guangdong (China) se estiman en más de 200 millones de yuanes. Las hembras adultas insertan sus huevos debajo de la piel de los frutos maduros o maduros, causando caries y abscisión del fruto, lo que disminuye la calidad del fruto y el rendimiento general del cultivo². Dado que las moscas adultas de la fruta tienen una gran capacidad de vuelo y sus larvas perforan la piel de la fruta, los insecticidas que requieren contacto directo con la plaga funcionan mal en el campo. Además, el uso extensivo de insecticidas ha aumentado la resistencia de B. dorsalis contra diversos productos químicos agrícolas, lo que dificulta aún más el control de estas plagas dañinas³. Por lo tanto, se necesita desesperadamente el desarrollo de estrategias de manejo de plagas efectivas y respetuosas con el medio ambiente.

Recientemente, con el desarrollo de herramientas biológicas moleculares y tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los científicos están tratando de desarrollar estrategias de manejo de plagas respetuosas con el medio ambiente, como el ARNi, que se dirigen a la funcionalidad de genes importantes (objetivos moleculares) de varias plagas de insectos. Los genes que son críticos para la supervivencia y reproducción de la plaga pueden identificarse a través de estudios genéticos funcionales y además sirven como posibles objetivos moleculares para la mejora de herramientas de manejo de plagas específicamente específicas y respetuosas con el medio ambiente⁴. Para adaptar tales estrategias al control de la mosca oriental de la fruta, se necesitan métodos efectivos para la investigación genética funcional.

El sistema de endonucleasa CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) fue descubierto inicialmente en bacterias y arqueas y resultó ser un mecanismo adaptativo implicado en el reconocimiento y degradación del ADN intracelular extraño, como el introducido por bacteriófagos infectantes⁵. En el sistema CRISPR tipo II, la endonucleasa Cas9 es guiada por pequeños ARN asociados (crRNA y tracrRNA) para escindir^{el ADN 6,7,8} y se ha convertido en una de las herramientas más utilizadas para la edición de genes hasta la fecha^9,10,11,12. Dado que el sistema CRISPR / Cas9 tiene varias ventajas, como la alta eficiencia del silenciamiento génico y el bajo costo, ya se ha aplicado para la edición de genes en varias especies de insectos, incluyendo Aedes aegypti^13,14, Locusta migratoria¹⁵ y Bombyx mori¹⁶. En B. dorsalis, los genes relacionados con el color del cuerpo, el dimorfismo del ala y la determinación del sexo han sido eliminados con éxito utilizando CRISPR / Cas9^17,18,19. Sin embargo, los procedimientos detallados para la aplicación de CRISPR/Cas9 en este insecto siguen siendo incompletos. Además, algunos pasos proporcionados por los investigadores para la edición de genes de B. dorsalis también son variados y necesitan estandarización. Por ejemplo, las formas de Cas9 fueron diferentes en las referencias publicadas^17,18,19.

Este documento proporciona un método sistemático para la mutagénesis de B. dorsalis utilizando el sistema CRISPR / Cas9, incluido el diseño y la síntesis de ARN guía, la recolección de embriones, la inyección de embriones, la cría de insectos y la detección de mutantes. Este protocolo servirá como una guía útil para generar moscas mutantes para los investigadores que estén interesados en los estudios de genes funcionales en B. dorsalis.

Protocolo

1. Diseño de diana y síntesis in vitro de sgRNA

1. Predecir la estructura de los genes diana de interés y determinar los límites entre exones e intrones mediante el análisis bioinformático del genoma de B. dorsalis (las aplicaciones de software utilizadas aquí se enumeran en la Tabla de materiales).
   NOTA: BLAT²⁰ se utilizó para buscar posibles loci de genes en el genoma. Las lecturas de RNA-seq de alta calidad (transcriptoma) se alinearon con los loci de genes adquiridos utilizando Hisat2²¹. Samtools²² se utilizó para generar los archivos bam ordenados. Los archivos bam ordenados se introdujeron en Stringtie2²³ para proporcionar las transcripciones de ensamblaje. Las transcripciones ensambladas y la información de loci de genes fueron combinadas por Transdecoder²⁴. Los resultados adquiridos de Transdecoder fueron visualizados en las herramientas IGV²⁵ y se pudieron determinar los límites entre exones e intrones.
2. Identificar las regiones diana adecuadas dentro del sitio del gen diana candidato. La longitud total debe ser inferior a 750 pb para una secuenciación más conveniente (Figura 1B). Diseñar cebadores específicos para amplificar el área diana a partir de ADN genómico de tipo salvaje mediante PCR (Figura 1B) (Primers: F-primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Clone los productos de PCR en un vector final contundente^{26 y seleccione 20} colonias bacterianas individuales para su secuenciación para determinar qué tan conservada está la región objetivo en las poblaciones de insectos de laboratorio.
3. Un sitio objetivo típico contiene un motivo de secuencia de tres nucleótidos (NGG o CCN) y una secuencia de 20 pb adyacente a los motivos NGG o CCN (20 pb-NGG o CCN-20 pb). Explotar los sitios objetivo candidatos contra el genoma de B. dorsalis y asegurarse de que la eficiencia prevista sea lo suficientemente alta y la tasa de desorientación sea baja; Varios programas de software de código abierto pueden predecir esto automáticamente. En este protocolo, sgRNAcas9 -AI²⁷ se utiliza para seleccionar y evaluar los objetivos óptimos. Los detalles de uso se pueden encontrar en el manual de este software.
   NOTA: Se favorecen los posibles sitios diana cerrados a la UTR 5' del gen diana y 1-2 Gs al inicio de la secuencia de 20 pb. Para lograr una gran deleción que se identificará mediante PCR seguida de electroforesis en gel de agarosa, se recomienda diseñar dos dianas²⁸ separadas por más de 100 pb (Figura 1C).
4. Utilice el kit de síntesis de ARNg disponible comercialmente para generar el ARNg diseñado. Realice cada paso siguiendo la guía del usuario. Resuspender el producto de ARNg en agua libre de nucleasas, cuantificar la concentración utilizando un espectrofotómetro UV-Vis y almacenar a -80 °C antes de su uso (la concentración de ARNg único sintetizado con éxito [10 μL] con el kit utilizado aquí es de aproximadamente 4000-6000 ng / μL, o incluso más).
   NOTA: Aunque la generación de las moscas mutantes es el primer paso para todos los investigadores, el control negativo apropiado para el experimento/análisis aguas abajo es crítico. Generar estos controles junto con los mutantes ahorra tiempo y esfuerzo a los investigadores. Por ejemplo, establezca sgRNA codificado como control negativo.

2. Recogida y preparación de embriones

1. Coloque las pupas de B. dorsalis en jaulas de plástico. Proporcione una mezcla de azúcar y levadura (1:1) como alimento junto con una fuente de agua después de que los adultos se cierren (Figura 2A, B). Las condiciones de crianza son 55% de humedad relativa (HR), 26.5 ° C y un ciclo de 14:10 L / D (luces encendidas a las seis de la mañana, luces apagadas a las ocho de la tarde).
2. La mayoría de los adultos alcanzan la madurez sexual 10 días después de la emergencia. Proporcione un ambiente adecuado para ayudar a las moscas adultas a aparearse tanto como sea posible. Lo ideal es utilizar un soporte de luz con una luz de 30-50 lux. Esto puede mejorar la fecundidad de las hembras, por lo tanto, mejorar la eficiencia de la recolección de embriones.
   NOTA: Poner a los adultos (de 5 a 6 días después de la emergencia) en un ambiente poco iluminado (<100 lux) puede promover el apareamiento. Generalmente, el pico de oviposición ocurre a las 03:00 p.m. (14:10/L:D, luces encendidas a las 06:00 a.m., luces apagadas a las 08:00 p.m.); Para obtener suficientes embriones, se recomienda colocar cámaras de oviposición en las jaulas 30 min antes de las 15:00 horas.
3. Coloque una gasa de malla 200 en la cámara de oviposición, a 1-2 mm de distancia de la tapa de la cámara. Esto ayudará a obtener tantos embriones como sea posible.
   NOTA: Evite dejar que los embriones se empapen en jugo de naranja o se froten con una gasa, ya que esto puede disminuir significativamente la tasa de supervivencia de los embriones.
4. Coloque una nueva cámara de oviposición en la jaula cuando la configuración de microinyección esté lista. Recoja los embriones cada 10 minutos con un cepillo fino y húmedo, luego alinearlos en una placa de inyección de fabricación propia (plexiglás con una longitud de 55 mm, un ancho de 13.75 mm y una altura de 5 mm, Se abre una ranura poco profunda de 45 mm x 5 mm x 0.3 mm en el medio para facilitar la colocación de huevos). Si los embriones tienen una presión interna alta, la desecación leve a <10% HR durante 10 minutos es opcional. Sumerja los embriones en aceite de halocarbono durante la inyección para evitar una mayor desecación (Figura 2C).

3. Microinyección del embrión

1. Prepare la aguja de inyección de vidrio con un extractor de micropipetas.
   NOTA: Es importante establecer los parámetros siguiendo la guía del usuario. En estos protocolos, se pueden hacer diferentes formas de aguja utilizando los parámetros sugeridos por el manual del extractor de micropipetas. El capilar de vidrio debe estar lo más limpio posible para evitar que el polvo obstruya la aguja.
2. Prepare la solución de trabajo. Mezclar la proteína Cas9 y el sgRNA correspondiente a las siguientes concentraciones de trabajo: sgRNA, 300 ng/μL; Proteína Cas9, 150 ng/μL. Agregue 1 μL de rojo fenol a la mezcla para que sirva como una forma conveniente de marcar los embriones inyectados. Coloque la mezcla preparada en hielo para evitar la degradación del sgRNA.
   NOTA: Utilice puntas de pipeta sin nucleasa y tubos de PCR. La concentración de proteína Cas9 debe ser inferior o igual a 150 ng/μL; Las concentraciones más altas son tóxicas y disminuyen significativamente la tasa de supervivencia del embrión. Cas9 también podría administrarse en formato de ADN o ARNm para lograr una edición exitosa de genes^17,19. En este protocolo, se recomienda la proteína Cas9 ya que los ARNm son susceptibles a la degradación, y la expresión de la proteína Cas9 del ADN plásmido lleva tiempo para la transcripción y traducción.
3. Establezca los parámetros para el inyector. El programa inicial es Pi-500 hPa, Ti-0.5 s y PC-200 hPa. Ajuste estos parámetros aún más según sea necesario durante la microinyección.
4. Añadir 3 μL de la mezcla en la aguja de inyección. Evite introducir burbujas de aire que puedan obstruir la aguja. Abra la aguja con un micromolinillo.
5. Conecte la aguja al micromanipulador de acuerdo con la guía del usuario (Figura 2E).
6. Coloque el plato con embriones alineados en la mesa objetiva. Ajustar la posición de la micropipeta bajo un microscopio óptico fino, colocando la micropipeta y el embrión en el mismo plano. Ajuste el volumen de la gota presionando el pedal; Se recomienda 1/10 del volumen de embriones.
7. Inserte la punta de la aguja en la parte posterior (polo vegetal) del embrión. Administre las mezclas en el embrión presionando el pedal del inyector. Si se agrega rojo fenol, se observa un color ligeramente rojizo al instante.
   NOTA: Un pequeño volumen de reflujo citoplasmático del agujero de alfiler no disminuirá la tasa de supervivencia del embrión. La inyección de 200 embriones es suficiente para la mutagénesis exitosa de un gen. Agregar más aceite de halocarbono para sumergir los embriones puede prevenir una mayor desecación. La inyección debe realizarse antes de la formación de células polares, lo que garantiza que cada mutación pueda heredarse de manera eficiente.

4. Cría de insectos después de la inyección

1. Coloque la placa de inyección con los embriones inyectados en una cámara climática artificial mantenida al 55% HR, 26.5 ° C y un ciclo de 14:10 L / D (luces encendidas a las seis de la mañana, luces apagadas a las ocho de la tarde).
2. Después de la inyección, la formación del embrión suele tardar 24 h en completarse y 36 h en eclosionar. Use un cepillo de punta fina para transferir las larvas a una dieta larvaria preparada. Recoja las larvas tres o cuatro veces al día hasta que no eclosionen más. En general, las larvas tardan de 2 a 3 días en terminar de eclosionar y pupan dentro de los 7 días.
   NOTA: Se utilizó una dieta a base de maíz para alimentar a las larvas. La receta contiene 150 g de harina de maíz, 150 g de plátano, 0,6 g de benzoato de sodio, 30 g de levadura, 30 g de sacarosa, 30 g de toalla de papel, 1,2 mL de ácido clorhídrico y 300 mL de agua²⁹. Minimizar el tiempo que las larvas se dejan en aceite (<2 h). Mueva las larvas a la dieta inmediatamente después de la eclosión en la medida de lo posible. Esto puede aumentar significativamente las tasas de supervivencia y pupación. No proporcione demasiada dieta (una dieta con 2/3 de una placa de Petri de 90 mm es suficiente para 30 larvas); de lo contrario, se moverá y disminuirá la tasa de supervivencia larval.
3. Ponga las larvas maduras en la arena húmeda para pupar. La etapa de pupación dura unos 10 días. Mueva las pupas a jaulas de plástico antes de que comience la eclosión.

5. Cribado mutante

1. Un diagrama de flujo de la criba mutante se ilustra en la Figura 3A. Cruza adultos G0 obtenidos por microinyección con adultos de tipo salvaje para obtener líneas heterocigotas. Verificar el tipo de mutaciones que porta la descendencia (G1) mediante genotipado.
2. Autocruzamiento de G1 con el mismo genotipo mutante para obtener líneas homocigotas en G2. Si los genotipos de los mutantes en G1 son completamente diferentes, cruce los heterocigotos con moscas de tipo salvaje. Las líneas homocigotas se obtienen generalmente en G3. Mantener dos o tres líneas homocigotas para experimentos posteriores de fenotipado.
3. Utilice el ADN genómico de un pupario fresco o de una sola pierna media de adultos individuales para realizar el genotipado. Diseñar cebadores específicos para amplificar el área objetivo; Los cebadores deben establecer al menos 50 bps aguas arriba y aguas abajo del sitio de destino. Consulte el paso 1.2 para obtener los detalles de la imprimación.
   NOTA: Dado que la cantidad de ADN en un pupario es extremadamente baja, se recomiendan kits de extracción de ADN disponibles comercialmente.
4. Realizar PCR utilizando las siguientes condiciones de ciclo: 98 °C durante 3 min, seguido de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 15 s a una temperatura de recocido apropiada para los cebadores diseñados, 72 °C durante 35 s, seguido de una extensión final de 72 °C durante 10 min.
5. Secuenciar los productos de PCR purificados. Cuando se detectan múltiples picos superpuestos adyacentes al sitio de destino (Figura 3B), se ha producido una mutagénesis exitosa. Subclonar los productos de PCR purificados en un vector de extremo romo y seleccionar 10 colonias bacterianas individuales para su secuenciación para verificar el genotipo de los mutantes. Mantener las líneas con mutaciones de desplazamiento de marco y terminaciones de traslación prematuras (Figura 3C).
   NOTA: No es necesario realizar la secuenciación de un solo clon para verificar el genotipo de los individuos G0. Simplemente secuencie los productos de PCR y mantenga a los individuos con múltiples picos de superposición obvios adyacentes al sitio objetivo. Después de la inyección inicial, se recomienda seleccionar 10 embriones para extraer ADN genómico y secuenciar los productos de PCR según los estándares del paso 5.3. Esto puede ayudar a predecir las tasas de mutación por adelantado. En este estudio, la secuenciación de Sanger para determinar el genotipo fue realizada por una compañía de secuenciación.

Resultados

Este protocolo presenta pasos detallados para el desarrollo de mutantes de B. dorsalis utilizando la tecnología CRISPR / Cas9, incluidos los resultados representativos de la selección de ADNg, la recolección de embriones y microinyección, el mantenimiento de insectos y la detección de mutantes.

El ejemplo del sitio objetivo del gen seleccionado se encuentra en el tercer exón (Figura 1C). Este sitio está altamente conservado, y se detectó una sola ...

Discusión

El sistema CRISPR/Cas9 es la herramienta de edición de genes más utilizada y tiene varias aplicaciones, como la trepida 30, el mejoramiento de cultivos³¹ y los estudios básicos de funciones genéticas³². Este sistema ya se ha aplicado para la edición de genes en varias especies de insectos y ha servido como una herramienta eficaz para el estudio de genes funcionales en plagas. Los protocolos que presentamos aquí estandarizan el procedimiento de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6x DNA Loading Buffer	TransGen Biotech	GH101-01
Artificial climate chamber	ShangHai BluePard	MGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit	Axygen	AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT	NA	NA	For searching potential gene loci in the genome
Capillary Glass	WPI	1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf	InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	A29377
Hisat2	NA	NA	For aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGV	NA	NA	For visualizing the results from Transdecoder
Microgrinder	NARISHIGE	EG-401
Olympus Microscope	Olympus Corporation	SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit	TransGen Biotech	CB101-02	https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers	Instrument Company		https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix)	Takara Biomedical Technology	R040A
SAMtools	NA	NA	For generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AI	NA	NA	sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter	Instrument Company	P-97
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101-02
Transdecoder	NA	NA	For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo Fisher Scientific	A36498
Ultra-trace biological detector	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000C