Protocolli per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis

Riepilogo

Questo articolo presenta i protocolli passo-passo per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis. I passaggi dettagliati forniti da questo protocollo standardizzato serviranno come guida utile per generare mosche mutanti per studi genetici funzionali in B. dorsalis.

Abstract

La mosca della frutta orientale, Bactrocera dorsalis, è una specie di parassiti altamente invasiva e adattativa che causa danni agli agrumi e ad oltre 150 altre colture da frutto in tutto il mondo. Poiché i moscerini della frutta adulti hanno una grande capacità di volo e le femmine depongono le uova sotto le bucce della frutta, gli insetticidi che richiedono il contatto diretto con il parassita di solito funzionano male sul campo. Con lo sviluppo di strumenti biologici molecolari e la tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento, molti scienziati stanno tentando di sviluppare strategie di gestione dei parassiti rispettose dell'ambiente. Questi includono RNAi o pesticidi basati sull'editing genetico che sottoregolano o silenziano i geni (bersagli molecolari), come i geni olfattivi coinvolti nel comportamento di ricerca, in vari insetti nocivi. Per adattare queste strategie per il controllo del moscerino della frutta orientale, sono necessari metodi efficaci per la ricerca genica funzionale. I geni con funzioni critiche nella sopravvivenza e nella riproduzione di B. dorsalis servono come buoni bersagli molecolari per l'abbattimento e/o il silenziamento dei geni. Il sistema CRISPR / Cas9 è una tecnica affidabile utilizzata per l'editing genetico, specialmente negli insetti. Questo articolo presenta un metodo sistematico per la mutagenesi CRISPR/Cas9 di B. dorsalis, compresa la progettazione e la sintesi di RNA guida, la raccolta di embrioni, l'iniezione di embrioni, l'allevamento di insetti e lo screening mutante. Questi protocolli serviranno come guida utile per generare mosche mutanti per i ricercatori interessati agli studi sui geni funzionali in B. dorsalis.

Introduzione

La mosca orientale della frutta, Bactrocera dorsalis , è una specie cosmopolita di insetti nocivi che causa danni a oltre 150 specie di colture da frutto, tra cui guava, mango, Eugenia spp., ciliegia del Suriname, agrumi, nespolo e papaia¹. I danni causati nella sola provincia del Guangdong (Cina) sono stimati in oltre 200 milioni di yuan. Le femmine adulte inseriscono le loro uova sotto la buccia dei frutti maturi o maturi, causando il decadimento e l'abscissione del frutto, che diminuisce la qualità dei frutti e la resa complessiva del raccolto². Poiché i moscerini della frutta adulti hanno una grande capacità di volo e le loro larve penetrano nella pelle del frutto, gli insetticidi che richiedono il contatto diretto con il parassita si comportano male sul campo. Inoltre, l'uso estensivo di insetticidi ha aumentato la resistenza di B. dorsalis contro vari prodotti chimici agricoli, rendendo ancora più difficile il controllo di questi parassiti dannosi³. Pertanto, lo sviluppo di strategie di gestione dei parassiti efficaci e rispettose dell'ambiente è disperatamente necessario.

Recentemente, con lo sviluppo di strumenti biologici molecolari e tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, gli scienziati stanno tentando di sviluppare strategie di gestione dei parassiti rispettose dell'ambiente, come RNAi, che mirano alla funzionalità di importanti geni (bersagli molecolari) di vari insetti nocivi. I geni fondamentali per la sopravvivenza e la riproduzione dell'organismo nocivo possono essere identificati mediante studi genetici funzionali e fungere ulteriormente da potenziali bersagli molecolari per il miglioramento di strumenti di gestione fitosanitaria specificamente mirati e rispettosi dell'ambiente⁴. Per adattare tali strategie al controllo del moscerino della frutta orientale, sono necessari metodi efficaci per la ricerca genica funzionale.

Il sistema endonucleasico CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) è stato inizialmente scoperto nei batteri e negli archei e si è scoperto essere un meccanismo adattativo coinvolto nel riconoscimento e nella degradazione del DNA intracellulare estraneo, come quello introdotto dall'infezione dei batteriofagi⁵. Nel sistema CRISPR di tipo II, l'endonucleasi Cas9 è guidata da piccoli RNA associati (crRNA e tracrRNA) per scindere^{il DNA 6,7,8} ed è diventato uno degli strumenti più utilizzati per l'editing genetico fino ad oggi^9,10,11,12. Poiché il sistema CRISPR / Cas9 ha diversi vantaggi, come l'alta efficienza del silenziamento genico e il basso costo, è già stato applicato per l'editing genetico in varie specie di insetti, tra cui Aedes aegypti^13,14, Locusta migratoria¹⁵ e Bombyx mori¹⁶. In B. dorsalis, i geni relativi al colore del corpo, al dimorfismo delle ali e alla determinazione del sesso sono stati eliminati con successo usando CRISPR / Cas9^17,18,19. Tuttavia, le procedure dettagliate per l'applicazione di CRISPR / Cas9 in questo insetto rimangono incomplete. Inoltre, alcuni passaggi forniti dai ricercatori per l'editing genetico di B. dorsalis sono anche vari e necessitano di standardizzazione. Ad esempio, le forme di Cas9 erano diverse nei riferimenti pubblicati^17,18,19.

Questo articolo fornisce un metodo sistematico per la mutagenesi di B. dorsalis utilizzando il sistema CRISPR / Cas9, compresa la progettazione e la sintesi di RNA guida, la raccolta di embrioni, l'iniezione di embrioni, l'allevamento di insetti e lo screening mutante. Questo protocollo servirà come guida utile per generare mosche mutanti per i ricercatori che sono interessati agli studi sui geni funzionali in B. dorsalis.

Protocollo

1. Progettazione del target e sintesi in vitro di sgRNA

1. Prevedere la struttura dei geni bersaglio di interesse e determinare i confini tra esoni e introni tramite l'analisi bioinformatica del genoma di B. dorsalis (le applicazioni software utilizzate qui sono elencate nella Tabella dei materiali).
   NOTA: BLAT²⁰ è stato utilizzato per cercare potenziali loci genici nel genoma. Le letture di alta qualità dell'RNA-seq (trascrittoma) sono state allineate ai loci genici acquisiti utilizzando Hisat2²¹. Samtools²² è stato utilizzato per generare i file bam ordinati. I file bam ordinati sono stati inseriti in Stringtie2²³ per fornire le trascrizioni di assemblaggio. Le trascrizioni assemblate e le informazioni sui loci genici sono state combinate da Transdecoder²⁴. I risultati acquisiti da Transdecoder sono stati visualizzati negli strumenti IGV²⁵ e i confini tra esoni e introni hanno potuto essere determinati.
2. Identificare le regioni target adatte all'interno del sito del gene bersaglio candidato. La lunghezza totale deve essere inferiore a 750 bp per un sequenziamento più conveniente (Figura 1B). Progettare primer specifici per amplificare l'area bersaglio dal DNA genomico wild-type mediante PCR (Figura 1B) (Primer: F-primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Clonare i prodotti PCR in un vettore terminale smussato^{26 e selezionare 20} singole colonie batteriche per il sequenziamento per determinare quanto è conservata la regione bersaglio nelle popolazioni di insetti di laboratorio.
3. Un tipico sito bersaglio contiene un motivo di sequenza a tre nucleotidi (NGG o CCN) e una sequenza di 20 bp adiacente ai motivi NGG o CCN (20 bp-NGG o CCN-20 bp). Far esplodere i siti bersaglio candidati contro il genoma di B. dorsalis e assicurarsi che l'efficienza prevista sia abbastanza alta e che il tasso di off-targeting sia basso; Diversi programmi software open source possono prevederlo automaticamente. In questo protocollo, sgRNAcas9 -AI²⁷ viene utilizzato per selezionare e valutare i bersagli ottimali. I dettagli di utilizzo possono essere trovati nel manuale di questo software.
   NOTA: Sono favoriti i possibili siti bersaglio chiusi alla 5' UTR del gene bersaglio e 1-2 G all'inizio della sequenza di 20 bp. Al fine di ottenere una grande delezione che sarà identificata mediante PCR seguita da elettroforesi su gel di agarosio, si raccomanda di progettare due target²⁸ separati da oltre 100 bp (Figura 1C).
4. Utilizzare il kit di sintesi del gRNA disponibile in commercio per generare lo sgRNA progettato. Eseguire ogni passaggio seguendo la guida dell'utente. Risospendere il prodotto di gRNA in acqua priva di nucleasi, quantificare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis e conservare a -80 °C prima dell'uso (la concentrazione di gRNA singolo sintetizzato con successo [10 μL] con il kit utilizzato qui è di circa 4000-6000 ng/μL, o anche superiore).
   NOTA: Sebbene la generazione delle mosche mutanti sia il primo passo per ogni ricercatore, il controllo negativo appropriato per l'esperimento/analisi a valle è fondamentale. Generare questi controlli insieme ai mutanti consente ai ricercatori di risparmiare tempo e fatica. Ad esempio, impostare sgRNA criptato come controllo negativo.

2. Raccolta e preparazione degli embrioni

1. Metti le pupe di B. dorsalis in gabbie di plastica. Fornire una miscela di zucchero e lievito (1:1) come cibo insieme a una fonte d'acqua dopo che gli adulti si sono chiusi (Figura 2A, B). Le condizioni di allevamento sono il 55% di umidità relativa (RH), 26,5 °C, e un ciclo di 14:10 L/D (luci accese alle sei del mattino, luci spente alle otto di sera).
2. La maggior parte degli adulti raggiunge la maturità sessuale 10 giorni dopo l'emergenza. Fornire un ambiente adatto per aiutare le mosche adulte ad accoppiarsi il più possibile. Idealmente, utilizzare un supporto luminoso con una luce di 30-50 lux. Questo può migliorare la fecondità delle femmine, migliorando quindi l'efficienza della raccolta degli embrioni.
   NOTA: Mettere gli adulti (di età compresa tra 5-6 giorni dopo l'emergenza) in un ambiente scarsamente illuminato (<100 lux) può favorire l'accoppiamento. Generalmente, il picco di deposizione delle uova avviene alle 15:00 (14:10/L:D, luci accese alle 06:00, luci spente alle 20:00); Per ottenere un numero sufficiente di embrioni, si raccomanda di posizionare le camere di deposizione delle uova nelle gabbie 30 minuti prima delle 15:00.
3. Posizionare una garza a 200 maglie nella camera di deposizione delle uova, a 1-2 mm di distanza dal coperchio della camera. Questo aiuterà a ottenere il maggior numero possibile di embrioni.
   NOTA: Evitare di lasciare che gli embrioni vengano immersi nel succo d'arancia o strofinati con una garza, poiché ciò può ridurre significativamente il tasso di sopravvivenza degli embrioni.
4. Inserire una nuova camera di ovodeposizione nella gabbia quando la configurazione della microiniezione è pronta. Raccogliere gli embrioni ogni 10 minuti usando una spazzola umida fine, quindi allinearli su una piastra di iniezione fatta da sé (plexiglass con una lunghezza di 55 mm, una larghezza di 13,75 mm e un'altezza di 5 mm, Una scanalatura poco profonda di 45 mm x 5 mm x 0,3 mm è aperta nel mezzo per facilitare il posizionamento delle uova). Se gli embrioni hanno un'alta pressione interna, una leggera essiccazione a <10% di umidità relativa per 10 minuti è facoltativa. Immergere gli embrioni in olio di alocarbonio durante l'iniezione per evitare un'ulteriore essiccazione (Figura 2C).

3. Microiniezione dell'embrione

1. Preparare l'ago per iniezione di vetro utilizzando un estrattore di micropipette.
   NOTA: l'impostazione dei parametri seguendo la guida dell'utente è importante. In questi protocolli, è possibile realizzare diverse forme di aghi utilizzando i parametri suggeriti dal manuale dell'estrattore di micropipette. Il capillare di vetro deve essere il più pulito possibile per evitare che la polvere ostruisca l'ago.
2. Preparare la soluzione di lavoro. Mescolare la proteina Cas9 e il corrispondente sgRNA alle seguenti concentrazioni di lavoro: sgRNA, 300 ng/μL; Cas9 proteina, 150 ng/μL. Aggiungere 1 μL di rosso fenolo alla miscela per servire come un modo conveniente per marcare gli embrioni iniettati. Posizionare la miscela preparata su ghiaccio per evitare la degradazione dello sgRNA.
   NOTA: Utilizzare puntali per pipette privi di nucleasi e provette per PCR. La concentrazione della proteina Cas9 deve essere inferiore o uguale a 150 ng/μL; Concentrazioni più elevate sono tossiche e riducono significativamente il tasso di sopravvivenza dell'embrione. Cas9 potrebbe anche essere consegnato in formato DNA o mRNA per ottenere un editing genetico di successo^17,19. In questo protocollo, la proteina Cas9 è raccomandata poiché gli mRNA sono suscettibili alla degradazione e l'espressione della proteina Cas9 dal DNA plasmidico richiede tempo per la trascrizione e la traduzione.
3. Impostare i parametri per l'iniettore. Il programma iniziale è Pi-500 hPa, Ti-0.5 s e PC-200 hPa. Regolare ulteriormente questi parametri secondo necessità durante la microiniezione.
4. Aggiungere 3 μL della miscela nell'ago per iniezione. Evitare di introdurre bolle d'aria che possono ostruire l'ago. Aprire l'ago utilizzando un Microgrinder.
5. Collegare l'ago al micromanipolatore secondo la guida per l'utente (Figura 2E).
6. Metti il piatto con gli embrioni allineati sul tavolo obiettivo. Regolare la posizione della micropipetta sotto un microscopio ottico fine, impostando la micropipetta e l'embrione sullo stesso piano. Regolare il volume delle gocce premendo il pedale; 1/10 del volume degli embrioni è raccomandato.
7. Inserire la punta dell'ago nella parte posteriore (polo vegetale) dell'embrione. Consegnare le miscele nell'embrione premendo il pedale dall'iniettore. Se viene aggiunto rosso fenolo, si osserva immediatamente un colore leggermente rossastro.
   NOTA: Un piccolo volume di riflusso citoplasmatico dal foro stenopeico non diminuirà il tasso di sopravvivenza dell'embrione. L'iniezione di 200 embrioni è sufficiente per il successo della mutagenesi di un gene. L'aggiunta di più olio di alocarbonio per immergere gli embrioni può prevenire un ulteriore essiccamento. L'iniezione deve essere eseguita prima della formazione delle cellule polari, il che garantisce che ogni mutazione possa essere ereditata in modo efficiente.

4. Allevamento di insetti post-iniezione

1. Mettere la piastra di iniezione con gli embrioni iniettati in una camera climatica artificiale mantenuta al 55% di umidità relativa, 26,5 °C e un ciclo di 14:10 L/D (luci accese alle sei del mattino, luci spente alle otto di sera).
2. Dopo l'iniezione, la formazione dell'embrione richiede solitamente 24 ore per completare e 36 ore per schiudersi. Utilizzare un pennello a punta fine per trasferire le larve su una dieta larvale preparata. Raccogli le larve tre o quattro volte al giorno fino a quando non si schiudono più le larve. Generalmente, le larve impiegano 2-3 giorni per terminare la schiusa e si impupano entro 7 giorni.
   NOTA: Per nutrire le larve è stata utilizzata una dieta a base di mais. La ricetta contiene 150 g di farina di mais, 150 g di banana, 0,6 g di benzoato di sodio, 30 g di lievito, 30 g di saccarosio, 30 g di tovagliolo di carta, 1,2 ml di acido cloridrico e 300 ml di acqua²⁹. Ridurre al minimo il tempo in cui le larve vengono lasciate in olio (<2 ore). Spostare le larve sulla dieta immediatamente dopo la schiusa il più lontano possibile. Questo può aumentare significativamente i tassi di sopravvivenza e pupa. Non fornire troppa dieta (una dieta con 2/3 di una capsula di Petri da 90 mm è sufficiente per 30 larve); Altrimenti, diventerà ammuffito e diminuirà il tasso di sopravvivenza larvale.
3. Metti le larve mature nella sabbia bagnata per impuparsi. La fase di pupa dura circa 10 giorni. Sposta le pupe in gabbie di plastica prima che inizi l'eclosione.

5. Screening mutante

1. Un diagramma di flusso dello screening mutante è illustrato nella Figura 3A. Cross G0 adulti ottenuti per microiniezione con adulti wild-type per ottenere linee eterozigoti. Verificare il tipo di mutazioni che la prole (G1) porta dalla genotipizzazione.
2. Auto-incrociare G1 con lo stesso genotipo mutante per ottenere linee omozigoti in G2. Se i genotipi dei mutanti in G1 sono completamente diversi, incrociare gli eterozigoti con mosche selvatiche. Le linee omozigoti sono solitamente ottenute in G3. Mantenere due o tre linee omozigoti per i successivi esperimenti di fenotipizzazione.
3. Utilizzare il DNA genomico da un pupario fresco o da una singola gamba centrale di singoli adulti per eseguire la genotipizzazione. Progettare primer specifici per amplificare l'area target; I primer devono essere impostati almeno 50 bps a monte e a valle del sito target. Fare riferimento al passaggio 1.2 per i dettagli del primer.
   NOTA: Poiché la quantità di DNA in un pupario è estremamente bassa, si raccomandano kit di estrazione del DNA disponibili in commercio.
4. Eseguire la PCR utilizzando le seguenti condizioni cicliche: 98 °C per 3 minuti, seguito da 35 cicli di 98 °C per 10 s, 15 s a una temperatura di ricottura appropriata per i primer progettati, 72 °C per 35 s, seguita da un'estensione finale di 72 °C per 10 min.
5. Sequenziare i prodotti PCR purificati. Quando vengono rilevati più picchi sovrapposti adiacenti al sito bersaglio (Figura 3B), si è verificata una mutagenesi riuscita. Sub-clonare i prodotti PCR purificati in un vettore smussato e selezionare 10 singole colonie batteriche per il sequenziamento per verificare il genotipo dei mutanti. Mantenere le linee con mutazioni frameshift e terminazioni premature della traduzione (Figura 3C).
   NOTA: Non è necessario eseguire il sequenziamento di un singolo clone per verificare il genotipo degli individui G0. Basta sequenziare i prodotti PCR e mantenere gli individui con evidenti picchi di sovrapposizione multipla adiacenti al sito target. Dopo l'iniezione iniziale, si raccomanda di selezionare 10 embrioni per estrarre il DNA genomico e sequenziare i prodotti PCR in base agli standard nella fase 5.3. Questo può aiutare a prevedere i tassi di mutazione in anticipo. In questo studio, il sequenziamento del siero per determinare il genotipo è stato fatto da una società di sequenziamento.

Risultati

Questo protocollo presenta passaggi dettagliati per lo sviluppo di mutanti di B. dorsalis utilizzando la tecnologia CRISPR / Cas9, compresi i risultati rappresentativi della selezione del gDNA, la raccolta di embrioni e microiniezione, il mantenimento degli insetti e lo screening dei mutanti.

L'esempio del sito bersaglio del gene selezionato si trova nel terzo esone (Figura 1C). Questo sito è altamente conservato e una singola banda è stata rilevata med...

Discussione

Il sistema CRISPR / Cas9 è lo strumento di editing genetico più utilizzato e ha varie applicazioni, come il gene threpy³⁰, il crop breeding 31 e gli studi di base sulle funzioni geniche³². Questo sistema è già stato applicato per l'editing genetico in varie specie di insetti ed è servito come strumento efficace per gli studi genetici funzionali nei parassiti. I protocolli che presentiamo qui standardizzano la procedura di progettazione e sintesi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6x DNA Loading Buffer	TransGen Biotech	GH101-01
Artificial climate chamber	ShangHai BluePard	MGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit	Axygen	AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT	NA	NA	For searching potential gene loci in the genome
Capillary Glass	WPI	1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf	InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	A29377
Hisat2	NA	NA	For aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGV	NA	NA	For visualizing the results from Transdecoder
Microgrinder	NARISHIGE	EG-401
Olympus Microscope	Olympus Corporation	SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit	TransGen Biotech	CB101-02	https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers	Instrument Company		https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix)	Takara Biomedical Technology	R040A
SAMtools	NA	NA	For generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AI	NA	NA	sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter	Instrument Company	P-97
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101-02
Transdecoder	NA	NA	For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo Fisher Scientific	A36498
Ultra-trace biological detector	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000C