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要約

この論文は、オリエンタルショウジョウバエBactrocera dorsalisのCRISPR/Cas9突然変異誘発のための段階的なプロトコルを提示します。この標準化されたプロトコルによって提供される詳細な手順は、B. dorsalisの機能的遺伝子研究のための突然変異ハエを生成するための有用なガイドとして役立ちます。

要約

オリエンタルショウジョウバエ、 Bactrocera dorsalis は、非常に侵略的で適応性のある害虫種であり、世界中の柑橘類や150を超える他の果物作物に被害をもたらします。成虫のショウジョウバエは飛行能力が高く、雌は果実の皮の下に卵を産むため、害虫との直接接触を必要とする殺虫剤は通常、野外ではあまり機能しません。分子生物学的ツールとハイスループットシーケンシング技術の開発により、多くの科学者が環境に優しい害虫管理戦略を開発しようとしています。これらには、さまざまな害虫の探索行動に関与する嗅覚遺伝子などの遺伝子(分子標的)を下方制御またはサイレンシングするRNAiまたは遺伝子編集ベースの農薬が含まれます。これらの戦略を東洋のショウジョウバエ防除に適応させるためには、機能遺伝子研究のための効果的な方法が必要です。 B. dorsalis の生存と繁殖に重要な機能を持つ遺伝子は、遺伝子ノックダウンおよび/またはサイレンシングの優れた分子標的として機能します。CRISPR/Cas9システムは、特に昆虫の遺伝子編集に使用される信頼性の高い技術です。本論文では、 B. dorsalisのCRISPR/Cas9変異誘発のための体系的な方法を提示し、ガイドRNAの設計と合成、胚の収集、胚注入、昆虫飼育、変異体スクリーニングを含む。これらのプロトコルは、 B. dorsalisの機能遺伝子研究に関心のある研究者にとって、突然変異ハエを生成するための有用なガイドとして役立ちます。

概要

オリエンタルショウジョウバエ、バ クトセラ・ドルサリス は、グアバ、マンゴー、ユージニア属、スリナムチェリー、柑橘類、ビワ、パパイヤなど、150種以上の果物作物に被害を与える国際的な害虫種です1。広東省(中国)だけでも2億元以上の被害が見込まれています。成体の雌は、熟した果実または熟した果実の皮の下に卵を挿入し、果実の腐敗と脱落を引き起こし、果実の品質と作物の全体的な収量を低下させます2。成虫のショウジョウバエは飛行能力が高く、幼虫が果実の皮に穴を開けるため、害虫との直接接触を必要とする殺虫剤は野外ではあまり機能しません。さらに、殺虫剤の広範な使用により、さまざまな農薬に対する B.dorsalis の耐性が高まり、これらの有害な害虫の防除がさらに困難になっています3。したがって、効果的で環境に優しい害虫管理戦略の開発が切実に必要とされています。

近年、分子生物学的ツールやハイスループットシーケンシング技術の開発により、様々な害虫の重要な遺伝子(分子標的)の機能を対象としたRNAiなどの環境にやさしい害虫管理戦略の開発が試みられています。有害生物の生存と繁殖に重要な遺伝子は、機能遺伝子研究を通じて同定することができ、さらに、特異的に標的を絞った環境に優しい害虫管理ツールの改善のための潜在的な分子標的として役立つ可能性があります4。このような戦略を東洋のショウジョウバエ防除に適応させるためには、機能遺伝子研究のための効果的な方法が必要です。

CRISPR/Cas(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復/CRISPR関連)エンドヌクレアーゼシステムは、細菌や古細菌で最初に発見され、バクテリオファージの感染によって導入されるような外来細胞内DNAの認識と分解に関与する適応メカニズムであることが判明しました5。II型CRISPRシステムでは、Cas9エンドヌクレアーゼは小さな関連RNA(crRNAおよびtracrRNA)によって誘導され、不法侵入DNAを切断し6,7,8、現在までに遺伝子編集に最も広く使用されているツールの1つになっています9,10,11,12。CRISPR/Cas9システムには、遺伝子サイレンシングの高効率や低コストなどのいくつかの利点があるため、ネッタイシマカ13,14、イナマカ渡り15、ボンビクスモリ16など、さまざまな昆虫種の遺伝子編集にすでに適用されています。B. dorsalisでは、CRISPR/Cas917,18,19を用いて、体色、翅二型、性決定に関する遺伝子のノックアウトに成功しています。しかし、この昆虫におけるCRISPR/Cas9の適用のための詳細な手順は不完全なままです。さらに、B. dorsalis遺伝子編集のために研究者によって提供されたいくつかのステップも多様であり、標準化が必要です。例えば、Cas9の形態は、公開された参考文献17,18,19では異なっていた。

本論文では、CRISPR/Cas9システムを用いた B. dorsalis の突然変異誘発法について、ガイドRNAの設計・合成、胚の採取、胚注入、昆虫飼育、変異体スクリーニングなど、体系的な方法を提供します。このプロトコルは、 B. dorsalisの機能的遺伝子研究に関心のある研究者にとって、突然変異ハエを生成するための有用なガイドとして役立ちます。

プロトコル

1. sgRNAのターゲット設計と インビトロ 合成

  1. B. dorsalisゲノムのバイオインフォマティクス解析により、目的の標的遺伝子の構造を予測し、エクソンとイントロンの境界を決定します(ここで使用されるソフトウェアアプリケーションは、材料表に記載されています)。
    注:BLAT20 は、ゲノム内の潜在的な遺伝子座を検索するために使用されました。高品質のRNA-seqリード(トランスクリプトーム)を、Hisat221を用いて取得した遺伝子座にアラインメントした。Samtools22 は、ソートされた bam ファイルを生成するために使用されました。ソートされた bam ファイルは、アセンブル トランスクリプトを提供するために Stringtie223 に入力されました。アセンブル転写物および遺伝子座情報は、トランスデコーダ24によって結合された。トランスデコーダから得られた結果はIGVツール25 で視覚化され、エクソンとイントロンの間の境界を決定することができた。
  2. 候補標的遺伝子部位内の適切な標的領域を同定する。より便利なシーケンシングのために、全長は750bp未満でなければなりません(図1B)。PCRにより野生型ゲノムDNAから標的領域を増幅するための特異的プライマーを設計する(図1B)(プライマー:Fプライマー:AACATTGAATCTGGAATCAGGTAACT、Rプライマー:CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC)。PCR産物を平滑末端ベクター26 にクローニングし、シーケンシングのために20の個々の細菌コロニーを選択して、実験室の昆虫集団における標的領域の保存状態を決定します。
  3. 典型的な標的部位は、3ヌクレオチド配列モチーフ(NGGまたはCCN)およびNGGまたはCCNモチーフに隣接する20bp配列(20bp-NGGまたはCCN-20bp)を含む。 B. dorsalis ゲノムに対して候補標的部位を爆破し、予測効率が十分に高く、オフターゲティング率が低いことを確認します。いくつかのオープンソースソフトウェアプログラムは、これを自動的に予測できます。このプロトコルでは、sgRNAcas9 -AI27 を使用して、最適なターゲットを選択および評価します。使用の詳細は、このソフトウェアのマニュアルに記載されています。
    注:標的遺伝子の5' UTRに閉鎖された可能性のある標的部位と、20 bp配列の開始時に1〜2 Gsが推奨されます。PCRとそれに続くアガロースゲル電気泳動によって同定される大きな欠失を達成するためには、100 bp以上離れた2つのターゲット28 を設計することが推奨されます(図1C)。
  4. 市販のgRNA合成キットを使用して、設計したsgRNAを生成します。ユーザーズガイドに従って各手順を実行します。gRNA産物をヌクレアーゼフリーの水に再懸濁し、UV-Vis分光光度計を使用して濃度を定量し、使用前に-80°Cで保存します(ここで使用したキットで合成に成功した単一gRNA[10 μL]の濃度は約4000-6000 ng / μL、またはそれ以上です)。
    注:変異ハエの生成はすべての研究者にとって最初のステップですが、下流の実験/分析のための適切なネガティブコントロールは重要です。変異体と一緒にこれらのコントロールを生成することで、研究者の時間と労力を節約できます。例えば、スクランブルされたsgRNAをネガティブコントロールとして設定します。

2.胚の収集と準備

  1. B.背側の蛹をプラスチック製のケージに入れます。大人が閉じた後、砂糖と酵母の混合物(1:1)を水源と一緒に食物として提供します(図2A、B)。飼育条件は相対湿度55%RH、26.5°C、L/Dサイクル14:10(朝6時点灯、夜8時消灯)です。
  2. ほとんどの成人は出現後10日で性的成熟に達します。成虫のハエができるだけ交尾できるように、適切な環境を提供します。理想的には、30〜50ルクスのライトを備えたライトスタンドを使用してください。これは女性の繁殖力を改善することができ、それ故に胚収集の効率を改善することができる。
    注:成虫(出現後5〜6日齢)を薄暗い(<100ルクス)環境に置くと、交配を促進することができます。一般的に、産卵のピークは午後03:00に発生します(14:10 / L:D、午前06:00に点灯、午後08:00に消灯)。十分な胚を得るために、午後03:00の30分前に産卵室をケージに入れることをお勧めします。
  3. チャンバーの蓋から1〜2 mm離れた産卵室に200メッシュのガーゼを置きます。これはできるだけ多くの胚を得るのに役立ちます。
    注:胚をオレンジジュースに浸したり、ガーゼでこすったりすると、胚の生存率が大幅に低下する可能性があるため、避けてください。
  4. マイクロインジェクションのセットアップの準備ができたら、新しい産卵室をケージに入れます。細かいウェットブラシを使用して10分ごとに胚を収集し、自作の注射プレート(長さ55 mm、幅13.75 mm、高さ5 mmのプレキシガラス、45 mm x 5 mm x 0.3 mmの浅い溝を中央に開き、卵の配置を容易にします)。胚の内圧が高い場合、<10%RHで10分間のわずかな乾燥は任意である。さらなる乾燥を避けるために、注射中に胚をハロカーボンオイルに浸します(図2C)。

3.胚のマイクロインジェクション

  1. マイクロピペットプラーを使用してガラス注射針を準備します。
    注意: ユーザーガイドに従ってパラメータを設定することが重要です。これらのプロトコルでは、マイクロピペットプーラーのマニュアルで提案されているパラメータを使用して、さまざまな針の形状を作成できます。ガラスキャピラリーは、ほこりが針を詰まらせるのを防ぐために、できるだけ清潔でなければなりません。
  2. 実用的な解決策を準備します。Cas9タンパク質と対応するsgRNAを次の使用濃度に混合します:sgRNA、300 ng / μL;Cas9タンパク質、150 ng/μL。 1 μLのフェノールレッドを混合物に加えると、注入された胚に印を付けるのに便利な方法になります。調製した混合物を氷上に置いて、sgRNAの分解を避ける。
    注:ヌクレアーゼフリーのピペットチップとPCRチューブを使用してください。Cas9タンパク質の濃度は150 ng / μL以下である必要があります。高濃度は毒性があり、胚の生存率を著しく低下させます。Cas9は、遺伝子編集を成功させるためにDNAまたはmRNA形式で送達することもできます17,19。このプロトコルでは、mRNAは分解を受けやすく、プラスミドDNAからのCas9タンパク質の発現には転写と翻訳に時間がかかるため、Cas9タンパク質が推奨されます。
  3. インジェクターのパラメータを設定します。初期プログラムはPi-500 hPa、Ti-0.5 s、PC-200 hPaです。マイクロインジェクション中に必要に応じて、これらのパラメータをさらに調整します。
  4. 3μLの混合物を注射針に加えます。針を詰まらせる可能性のある気泡の導入は避けてください。マイクログラインダーを使用して針を開きます。
  5. ユーザーガイドに従って針をマイクロマニピュレーターに接続します(図2E)。
  6. 胚を並べたプレートを客観的なテーブルに置きます。マイクロピペットの位置を微細光学顕微鏡で調整し、マイクロピペットと胚を同じ平面上にセットします。ペダルを踏んで液滴の音量を調整します。胚の体積の1/10が推奨されます。
  7. 針先を胚の後方(植物極)に挿入します。インジェクターからペダルを押して、混合物を胚に送ります。フェノールレッドを加えると、わずかに赤みがかった色がすぐに観察されます。
    注:ピンホールからの少量の細胞質逆流は、胚の生存率を低下させません。200個の胚の注射は、1つの遺伝子の突然変異誘発を成功させるのに十分です。胚を浸すためにさらにハロカーボンオイルを追加すると、それ以上の乾燥を防ぐことができます。注射は極細胞形成の前に実行する必要があり、これによりすべての突然変異を効率的に継承できます。

4.注射後の昆虫飼育

  1. 注入された胚を含む注射プレートを、55%RH、26.5°C、および14:10 L / Dサイクル(朝6時に点灯、夕方8時に消灯)に保たれた人工気候室に入れます。
  2. 注射後、胚形成は通常、完了するのに24時間、孵化するのに36時間かかります。細い先端のブラシを使用して、幼虫を準備した幼虫の食事に移します。幼虫が孵化しなくなるまで、毎日3〜4回幼虫を集めます。一般的に、幼虫は孵化を終え、7日以内に蛹になるまでに2〜3日かかります。
    注:幼虫を養うためにトウモロコシベースの食事が使用されました。レシピには、150 gのコーンフラワー、150 gのバナナ、0.6 gの安息香酸ナトリウム、30 gの酵母、30 gのスクロース、30 gのペーパータオル、1.2 mLの塩酸、および300 mLの水が含まれています29。幼虫が油に残される時間を最小限に抑えます(<2時間)。可能な限り孵化した直後に幼虫を食事に移します。これにより、生存率と蛹化率が大幅に向上する可能性があります。あまり多くの食事を提供しないでください(90 mmのペトリ皿の2/3の食事は30匹の幼虫に十分です)。そうしないと、カビが生え、幼虫の生存率が低下します。
  3. 成熟した幼虫を湿った砂に入れて蛹にします。蛹化段階は約10日かかります。閉鎖が始まる前に、蛹をプラスチック製のケージに移動します。

5. 変異体スクリーニング

  1. 変異体スクリーニングのフローチャートを 図3Aに示す。得られた成体G0を野生型成体とマイクロインジェクションにより交配し、ヘテロ接合株を得た。子孫(G1)が持っている突然変異の種類をジェノタイピングによって確認します。
  2. G1を同じ変異遺伝子型で自己交配し、G2のホモ接合株を得る。G1の変異体の遺伝子型がまったく異なる場合は、ヘテロ接合体を野生型のハエと交配します。ホモ接合株は通常G3で得られます。その後の表現型実験のために2つまたは3つのホモ接合株を維持します。
  3. 新鮮な蛹または個々の成人の単一の中脚からのゲノムDNAを使用して、ジェノタイピングを実行します。標的領域を増幅するための特異的プライマーを設計する。プライマーは、標的部位の上流および下流に少なくとも50 bpsを設定する必要があります。プライマーの詳細については、ステップ 1.2 を参照してください。
    注:蛹のDNA量が極めて少ないため、市販のDNA抽出キットを推奨します。
  4. 次のサイクル条件を使用してPCRを実行します:98°Cで3分間、続いて98°Cで10秒間、設計したプライマーに適したアニーリング温度で15秒間、72°Cで35秒間、その後72°Cで10分間の最終伸長。
  5. 精製されたPCR産物をシーケンスします。標的部位に隣接する複数の重複するピークが検出されると(図3B)、突然変異誘発が成功している。精製されたPCR産物を平滑末端ベクターにサブクローニングし、シーケンシングのために10個の個々の細菌コロニーを選択して、変異体の遺伝子型を検証します。フレームシフト変異と早期翻訳終了のあるラインを維持します(図3C)。
    注:G0個体の遺伝子型を検証するためにシングルクローンシーケンシングを実行する必要はありません。PCR産物を配列決定し、標的部位に隣接する明らかな複数のオーバーラップピークを持つ個体を維持するだけです。最初の注射後、ゲノムDNAを抽出するために10個の胚を選択し、ステップ5.3の標準に基づいてPCR産物を配列決定することをお勧めします。これは、突然変異率を事前に予測するのに役立ちます。この研究では、遺伝子型を決定するためのサンガーシーケンシングは、シーケンシング会社によって行われました。

結果

このプロトコルは、gDNA選択、胚の収集とマイクロインジェクション、昆虫の維持、変異体のスクリーニングからの代表的な結果を含む、CRISPR/Cas9技術を使用した B.dorsalis 変異体の開発のための詳細な手順を示しています。

選択された遺伝子の標的部位の例は、第3エクソンに位置する(図1C)。この部位は高度に保存されており、合成gRNA(

ディスカッション

CRISPR/Cas9システムは、最も広く使用されている遺伝子編集ツールであり、遺伝子スレピー30、作物育種31、遺伝子機能の基礎研究32など、さまざまな用途があります。このシステムは、すでに様々な昆虫種の遺伝子編集に応用されており、害虫の機能的遺伝子研究に有効なツールとして役立っています。ここで紹介するプロトコルは、ガイ?...

開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

この作業は、深セン科学技術プログラム(助成金番号。 KQTD20180411143628272)および深セン大鵬新区の科学技術革新と産業開発のための特別基金(助成金番号PT202101-02)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
6x DNA Loading BufferTransGen BiotechGH101-01
Artificial climate chamberShangHai BluePardMGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction KitAxygenAP-MN-MS-GDNA-250G
BLATNANAFor searching potential gene loci in the genome
Capillary GlassWPI 1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulatorEppendorfInjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis KitThermo Fisher ScientificA29377
Hisat2NANAFor aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGVNANAFor visualizing the results from Transdecoder
MicrogrinderNARISHIGEEG-401
Olympus MicroscopeOlympus CorporationSZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning KitTransGen BiotechCB101-02https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solutionSigma-AldrichP0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette PullersInstrument Company https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix)Takara Biomedical TechnologyR040A
SAMtoolsNANAFor generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AINANAsgRNA design
http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Company P-97
Trans2K DNA MarkerTransGen BiotechBM101-02
TransdecoderNANAFor combining the results of assemble transcripts and gene loci information
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2Thermo Fisher ScientificA36498
Ultra-trace biological detectorThermo Fisher ScientificNanodrop 2000C

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