Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis

Resumo

Este trabalho apresenta os protocolos passo-a-passo para a mutagênese CRISPR/Cas9 da mosca da fruta oriental Bactrocera dorsalis. Passos detalhados fornecidos por este protocolo padronizado servirão como um guia útil para a geração de moscas mutantes para estudos de genes funcionais em B. dorsalis.

Resumo

A mosca da fruta oriental, Bactrocera dorsalis, é uma espécie de praga altamente invasiva e adaptativa que causa danos aos citros e a mais de 150 outras culturas frutíferas em todo o mundo. Como as moscas da fruta adultas têm grande capacidade de voo e as fêmeas colocam seus ovos sob as cascas das frutas, os inseticidas que exigem contato direto com a praga geralmente têm um desempenho ruim no campo. Com o desenvolvimento de ferramentas biológicas moleculares e tecnologia de sequenciamento de alto rendimento, muitos cientistas estão tentando desenvolver estratégias de manejo de pragas ambientalmente amigáveis. Estes incluem RNAi ou pesticidas baseados em edição de genes que regulam ou silenciam genes (alvos moleculares), como genes olfativos envolvidos no comportamento de busca, em várias pragas de insetos. Para adaptar essas estratégias para o controle oriental da mosca da fruta, são necessários métodos eficazes para a pesquisa de genes funcionais. Genes com funções críticas na sobrevivência e reprodução de B. dorsalis servem como bons alvos moleculares para derrubada e/ou silenciamento de genes. O sistema CRISPR/Cas9 é uma técnica confiável usada para edição de genes, especialmente em insetos. Este trabalho apresenta um método sistemático para a mutagênese CRISPR/Cas9 de B. dorsalis, incluindo o desenho e síntese de RNAs guia, coleta de embriões, injeção de embriões, criação de insetos e triagem mutante. Esses protocolos servirão como um guia útil para a geração de moscas mutantes para pesquisadores interessados em estudos de genes funcionais em B. dorsalis.

Introdução

A mosca da fruta oriental, Bactrocera dorsalis , é uma espécie de praga de insetos cosmopolita que causa danos a mais de 150 espécies de culturas frutíferas, incluindo goiaba, manga, Eugenia spp., cereja do Suriname, cítricos, nêspera e mamão¹. Os danos causados apenas na província de Guangdong (China) são estimados em mais de 200 milhões de yuans. As fêmeas adultas inserem seus ovos sob a pele dos frutos amadurecidos ou amadurecidos, causando decomposição e abscisão do fruto, o que diminui a qualidade dos frutos e o rendimento geral da cultura². Como as moscas da fruta adultas têm grande capacidade de voo e suas larvas penetram na casca da fruta, os inseticidas que exigem contato direto com a praga têm um desempenho ruim no campo. Além disso, o uso extensivo de inseticidas aumentou a resistência de B. dorsalis contra diversos produtos químicos agrícolas, dificultando ainda mais o controle dessas pragas danosas³. Portanto, o desenvolvimento de estratégias eficazes e ambientalmente amigáveis de manejo de pragas é desesperadamente necessário.

Recentemente, com o desenvolvimento de ferramentas biológicas moleculares e tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, os cientistas estão tentando desenvolver estratégias de manejo de pragas ambientalmente amigáveis, como o RNAi, que visam a funcionalidade de genes importantes (alvos moleculares) de várias pragas de insetos. Genes que são críticos para a sobrevivência e reprodução da praga podem ser identificados por meio de estudos genéticos funcionais e ainda servem como potenciais alvos moleculares para a melhoria de ferramentas de manejo de pragas especificamente direcionadas e ambientalmente amigáveis⁴. Para adaptar tais estratégias ao controle oriental da mosca da fruta, são necessários métodos eficazes para a pesquisa de genes funcionais.

O sistema de endonuclease CRISPR/Cas (agrupado regularmente interespaçado repetições palindrômicas curtas/CRISPR-associado) foi inicialmente descoberto em bactérias e arqueias e encontrado para ser um mecanismo adaptativo envolvido no reconhecimento e degradação de DNA intracelular estranho, como o introduzido pela infecção de bacteriófagos⁵. No sistema CRISPR tipo II, a endonuclease Cas9 é guiada por pequenos RNAs associados (crRNA e tracrRNA) para clivar o DNA invasor ^6,7,8 e tornou-se uma das ferramentas mais utilizadas para edição de genes até o momento 9,10,11,12. Como o sistema CRISPR/Cas9 apresenta diversas vantagens, como alta eficiência de silenciamento de genes e baixo custo, já foi aplicado para edição gênica em diversas espécies de insetos, incluindo Aedes aegypti^13,14, Locusta migratoria¹⁵ e Bombyx mori¹⁶. Em B. dorsalis, genes relacionados à cor corporal, dimorfismo das asas e determinação do sexo foram nocauteados com sucesso usando CRISPR/Cas9^17,18,19. No entanto, os procedimentos detalhados para a aplicação de CRISPR/Cas9 neste inseto permanecem incompletos. Além disso, algumas etapas fornecidas pelos pesquisadores para a edição do gene B. dorsalis também são variadas e precisam de padronização. Por exemplo, as formas de Cas9 foram diferentes nas referências publicadas^17,18,19.

Este artigo fornece um método sistemático para mutagênese de B. dorsalis usando o sistema CRISPR/Cas9, incluindo o desenho e síntese de RNAs guia, coleta de embriões, injeção de embriões, criação de insetos e triagem mutante. Este protocolo servirá como um guia útil para a geração de moscas mutantes para pesquisadores interessados nos estudos de genes funcionais em B. dorsalis.

Protocolo

1. Concepção do alvo e síntese in vitro do sgRNA

1. Prever a estrutura dos genes-alvo de interesse e determinar os limites entre éxons e íntrons através da análise bioinformática do genoma de B. dorsalis (as aplicações de software usadas aqui estão listadas na Tabela de Materiais).
   NOTA: O BLAT²⁰ foi usado para pesquisar potenciais loci genéticos no genoma. As leituras de RNA-seq de alta qualidade (transcriptoma) foram alinhadas aos loci genéticos adquiridos usando Hisat2²¹. O Samtools²² foi usado para gerar os arquivos bam classificados. Os arquivos bam classificados foram inseridos no Stringtie2²³ para fornecer as transcrições de montagem. Os transcritos de montagem e as informações dos loci gênicos foram combinados pelo Transdecodificador²⁴. Os resultados obtidos com o Transdecoder foram visualizados em ferramentas IGV²⁵ e os limites entre éxons e íntrons puderam ser determinados.
2. Identifique as regiões-alvo adequadas dentro do local do gene alvo candidato. O comprimento total deve ser inferior a 750 pb para um sequenciamento mais conveniente (Figura 1B). Projetar primers específicos para amplificar a área-alvo a partir do DNA genômico do tipo selvagem por PCR (Figura 1B) (Primers: F-primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Clone os produtos de PCR em um vetor final contundente^{26 e selecione 20} colônias bacterianas individuais para sequenciamento para determinar o quão conservada a região-alvo está nas populações de insetos de laboratório.
3. Um local alvo típico contém um motivo de sequência de três nucleotídeos (NGG ou CCN) e uma sequência de 20 pb adjacente aos motivos NGG ou CCN (20 bp-NGG ou CCN-20 pb). Exploda os locais-alvo candidatos contra o genoma de B. dorsalis e certifique-se de que a eficiência prevista é alta o suficiente e a taxa de desdirecionamento é baixa; vários programas de software de código aberto podem prever isso automaticamente. Neste protocolo, o sgRNAcas9 -AI²⁷ é usado para selecionar e avaliar os alvos ideais. Detalhes de uso podem ser encontrados no manual para este software.
   NOTA: Possíveis locais-alvo fechados para a UTR de 5' do gene alvo e 1-2 Gs no início da sequência de 20 pb são favorecidos. A fim de alcançar uma grande deleção que será identificada por PCR seguida de eletroforese em gel de agarose, recomenda-se o desenho de dois alvos²⁸ separados por mais de 100 pb (Figura 1C).
4. Use o kit de síntese de gRNA comercialmente disponível para gerar o sgRNA projetado. Execute cada etapa seguindo o guia do usuário. Ressuspeite o produto de gRNA em água livre de nuclease, quantifique a concentração usando um espectrofotômetro UV-Vis e armazene a -80 °C antes do uso (a concentração de gRNA único sintetizado com sucesso [10 μL] com o kit usado aqui é de cerca de 4000-6000 ng / μL, ou até superior).
   NOTA: Embora a geração das moscas mutantes seja o primeiro passo para todos os pesquisadores, o controle negativo apropriado para experimentos/análises a jusante é fundamental. Gerar esses controles ao lado dos mutantes economiza tempo e esforço dos pesquisadores. Por exemplo, defina o sgRNA embaralhado como um controle negativo.

2. Colheita e preparação de embriões

1. Coloque as pupas de B. dorsalis em gaiolas de plástico. Fornecer uma mistura de açúcar e levedura (1:1) como alimento, juntamente com uma fonte de água após o fechamento dos adultos (Figura 2A, B). As condições de criação são 55% de umidade relativa (UR), 26,5 °C e um ciclo de 14:10 L / D (luzes acesas às seis da manhã, luzes apagadas às oito da noite).
2. A maioria dos adultos atinge a maturidade sexual 10 dias após a emergência. Forneça um ambiente adequado para ajudar as moscas adultas a acasalar, tanto quanto possível. Idealmente, use um suporte de luz com uma luz de 30-50 lux. Isso pode melhorar a fecundidade das fêmeas, portanto, melhorando a eficiência da coleta de embriões.
   NOTA: Colocar os adultos (com idade entre 5-6 dias após a emergência) em um ambiente mal iluminado (<100 lux) pode promover o acasalamento. Geralmente, o pico de oviposição acontece às 15h00 (14h10/L:D, luzes acesas às 06h00, luzes apagadas às 20h00); para obter embriões suficientes, recomenda-se a colocação de câmaras de oviposição nas gaiolas 30 min antes das 15:00.
3. Coloque uma gaze de 200 malhas na câmara de oviposição, a 1-2 mm de distância da tampa da câmara. Isso ajudará na obtenção do maior número possível de embriões.
   NOTA: Evite deixar os embriões ficarem embebidos em suco de laranja ou esfregados com gaze, pois isso pode diminuir significativamente a taxa de sobrevivência dos embriões.
4. Coloque uma nova câmara de oviposição na gaiola quando a configuração de microinjeção estiver pronta. Colete os embriões a cada 10 minutos usando uma escova fina e úmida e, em seguida, alinhe-os em uma placa de injeção feita por conta própria (plexiglass com um comprimento de 55 mm, uma largura de 13,75 mm e uma altura de 5 mm, A 45 mm x 5 mm x 0,3 mm sulco raso é aberto no meio para facilitar a colocação do ovo). Se os embriões tiverem alta pressão interna, uma leve dessecação a <10% UR por 10 min é opcional. Mergulhe os embriões em óleo de halocarbono durante a injeção para evitar mais dessecação (Figura 2C).

3. Microinjeção do embrião

1. Prepare a agulha de injeção de vidro usando um puxador de micropipeta.
   Observação : definir os parâmetros seguindo o guia do usuário é importante. Nesses protocolos, diferentes formas de agulhas podem ser feitas usando os parâmetros sugeridos pelo manual do puxador de micropipeta. O capilar de vidro deve estar o mais limpo possível para evitar que o pó obstrua a agulha.
2. Prepare a solução de trabalho. Misturar a proteína Cas9 e o sgRNA correspondente às seguintes concentrações de trabalho: sgRNA, 300 ng/μL; Proteína Cas9, 150 ng/μL. Adicione 1 μL de vermelho de fenol à mistura para servir como uma maneira conveniente de marcar embriões injetados. Coloque a mistura preparada no gelo para evitar a degradação do sgRNA.
   NOTA: Use pontas de pipeta sem nuclease e tubos de PCR. A concentração da proteína Cas9 precisa ser menor ou igual a 150 ng/μL; concentrações mais altas são tóxicas e diminuem significativamente a taxa de sobrevivência embrionária. A Cas9 também poderia ser entregue no formato de DNA ou mRNA para alcançar uma edição de genes bem-sucedida^17,19. Neste protocolo, a proteína Cas9 é recomendada, uma vez que os mRNAs são suscetíveis à degradação, e a expressão da proteína Cas9 a partir do DNA plasmídico leva tempo para transcrição e tradução.
3. Defina os parâmetros para o injetor. O programa inicial é Pi-500 hPa, Ti-0.5 s e PC-200 hPa. Ajuste estes parâmetros ainda mais, conforme necessário, durante a microinjeção.
4. Adicionar 3 μL da mistura à agulha de injecção. Evite introduzir bolhas de ar que possam entupir a agulha. Abra a agulha usando um Microgrinder.
5. Conecte a agulha ao micromanipulador de acordo com o guia do usuário (Figura 2E).
6. Coloque o prato com embriões alinhados na mesa objetiva. Ajuste a posição da micropipeta sob um microscópio óptico fino, colocando a micropipeta e o embrião no mesmo plano. Ajuste o volume da gota pressionando o pedal; 1/10 o volume de embriões é recomendado.
7. Insira a ponta da agulha no posterior (polo vegetal) do embrião. Entregue as misturas no embrião pressionando o pedal do injetor. Se o vermelho fenólico for adicionado, uma cor ligeiramente avermelhada é observada instantaneamente.
   NOTA: Um pequeno volume de refluxo citoplasmático do orifício não diminuirá a taxa de sobrevivência do embrião. A injeção de 200 embriões é suficiente para a mutagênese bem-sucedida de um gene. Adicionar mais óleo de halocarbono para imergir os embriões pode evitar mais dessecação. A injeção precisa ser realizada antes da formação de células polares, o que garante que cada mutação possa ser herdada de forma eficiente.

4. Criação de insetos pós-injeção

1. Coloque a placa de injeção com os embriões injetados em uma câmara climática artificial mantida a 55% UR, 26,5 °C e um ciclo de 14:10 L / D (luzes acesas às seis da manhã, luzes apagadas às oito da noite).
2. Após a injeção, a formação do embrião geralmente leva 24 h para completar e 36 h para eclodir. Use uma escova de ponta fina para transferir as larvas para uma dieta larval preparada. Colete larvas três ou quatro vezes ao dia até que não haja mais larvas eclodindo. Geralmente, as larvas levam 2-3 dias para terminar a eclosão e pupato dentro de 7 dias.
   NOTA: Uma dieta à base de milho foi usada para alimentar as larvas. A receita contém 150 g de farinha de milho, 150 g de banana, 0,6 g de benzoato de sódio, 30 g de levedura, 30 g de sacarose, 30 g de papel toalha, 1,2 mL de ácido clorídrico e 300 mL de água²⁹. Minimizar o tempo que as larvas são deixadas no óleo (<2 h). Mova as larvas para a dieta imediatamente após a eclosão, tanto quanto possível. Isso pode aumentar significativamente as taxas de sobrevivência e pupação. Não forneça muita dieta (uma dieta com 2/3 de uma placa de Petri de 90 mm é suficiente para 30 larvas); caso contrário, ficará mofado, diminuirá a taxa de sobrevivência larval.
3. Coloque as larvas maduras na areia molhada para pupate. O estágio de pupação leva cerca de 10 dias. Mova as pupas para gaiolas de plástico antes do início da eclosão.

5. Rastreio mutante

1. Um fluxograma da triagem mutante é ilustrado na Figura 3A. Adultos Cross G0 obtidos por microinjeção com adultos do tipo selvagem para obtenção de linhagens heterozigotas. Verifique o tipo de mutações que a prole (G1) carrega por genotipagem.
2. Autocruzar G1 com o mesmo genótipo mutante para obtenção de linhagens homozigotas no G2. Se os genótipos dos mutantes no G1 forem totalmente diferentes, cruze os heterozigotos com moscas selvagens. Linhagens homozigotas são geralmente obtidas no G3. Mantenha duas ou três linhas homozigotas para experimentos subsequentes de fenotipagem.
3. Use o DNA genômico de um pupário fresco ou de uma única perna média de adultos individuais para realizar a genotipagem. Projetar primers específicos para amplificar a área alvo; os primers devem fixar pelo menos 50 bps a montante e a jusante do local de destino. Consulte a etapa 1.2 para obter os detalhes da cartilha.
   NOTA: Como a quantidade de DNA em um pupário é extremamente baixa, kits de extração de DNA comercialmente disponíveis são recomendados.
4. Efectuar a PCR utilizando as seguintes condições de ciclo: 98 °C durante 3 min, seguidos de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 15 s a uma temperatura de recozimento adequada para os primers projectados, 72 °C durante 35 s, seguida de uma extensão final de 72 °C durante 10 min.
5. Sequenciar os produtos de PCR purificados. Quando vários picos sobrepostos adjacentes ao local de destino são detectados (Figura 3B), ocorreu mutagênese bem-sucedida. Subclone os produtos de PCR purificados em um vetor de extremidade contundente e selecione 10 colônias bacterianas individuais para sequenciamento para verificar o genótipo dos mutantes. Manter as linhas com mutações de deslocamento de quadro e terminações prematuras de tradução (Figura 3C).
   NOTA: Não há necessidade de realizar o sequenciamento de clone único para verificar o genótipo dos indivíduos G0. Basta sequenciar os produtos de PCR e manter os indivíduos com múltiplos picos de sobreposição óbvios adjacentes ao local de destino. Após a injeção inicial, recomenda-se selecionar 10 embriões para extrair DNA genômico e sequenciar os produtos de PCR com base nos padrões da etapa 5.3. Isso pode ajudar a prever as taxas de mutação com antecedência. Neste estudo, o sequenciamento de sanger para determinar o genótipo foi feito por uma empresa de sequenciamento.

Resultados

Este protocolo apresenta etapas detalhadas para o desenvolvimento de mutantes de B. dorsalis usando a tecnologia CRISPR/Cas9, incluindo resultados representativos da seleção de gDNA, coleta de embriões e microinjeção, manutenção de insetos e triagem de mutantes.

O exemplo do sítio alvo do gene selecionado está localizado no terceiro éxon (Figura 1C). Este sítio é altamente conservado, e uma única banda foi detectada por eletroforese em gel pa...

Discussão

O sistema CRISPR/Cas9 é a ferramenta de edição de genes mais utilizada e tem várias aplicações, como o gene^{trepia 30}, o melhoramento de culturas³¹ e estudos básicos de funções gênicas³². Este sistema já foi aplicado para edição de genes em várias espécies de insetos e tem servido como uma ferramenta eficaz para estudos de genes funcionais em pragas. Os protocolos que apresentamos aqui padronizam o procedimento de desenho e síntese de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6x DNA Loading Buffer	TransGen Biotech	GH101-01
Artificial climate chamber	ShangHai BluePard	MGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit	Axygen	AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT	NA	NA	For searching potential gene loci in the genome
Capillary Glass	WPI	1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf	InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	A29377
Hisat2	NA	NA	For aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGV	NA	NA	For visualizing the results from Transdecoder
Microgrinder	NARISHIGE	EG-401
Olympus Microscope	Olympus Corporation	SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit	TransGen Biotech	CB101-02	https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers	Instrument Company		https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix)	Takara Biomedical Technology	R040A
SAMtools	NA	NA	For generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AI	NA	NA	sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter	Instrument Company	P-97
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101-02
Transdecoder	NA	NA	For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo Fisher Scientific	A36498
Ultra-trace biological detector	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000C