Protocoles pour la mutagenèse CRISPR/Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis

Résumé

Cet article présente les protocoles étape par étape pour la mutagénèse CRISPR / Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis. Les étapes détaillées fournies par ce protocole normalisé serviront de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.

Résumé

La mouche orientale des fruits, Bactrocera dorsalis, est une espèce de ravageur très envahissante et adaptative qui cause des dommages aux agrumes et à plus de 150 autres cultures fruitières dans le monde. Étant donné que les mouches des fruits adultes ont une grande capacité de vol et que les femelles pondent leurs œufs sous la peau des fruits, les insecticides nécessitant un contact direct avec le ravageur donnent généralement de mauvais résultats au champ. Avec le développement d’outils de biologie moléculaire et de technologie de séquençage à haut débit, de nombreux scientifiques tentent de développer des stratégies de lutte antiparasitaire respectueuses de l’environnement. Il s’agit notamment de pesticides basés sur l’ARNi ou l’édition de gènes qui régulent à la baisse ou réduisent au silence les gènes (cibles moléculaires), tels que les gènes olfactifs impliqués dans la recherche du comportement, chez divers insectes nuisibles. Pour adapter ces stratégies à la lutte contre la mouche orientale des fruits, des méthodes efficaces de recherche de gènes fonctionnels sont nécessaires. Les gènes ayant des fonctions critiques dans la survie et la reproduction de B. dorsalis servent de bonnes cibles moléculaires pour l’élimination et/ou le silençage des gènes. Le système CRISPR/Cas9 est une technique fiable utilisée pour l’édition de gènes, en particulier chez les insectes. Cet article présente une méthode systématique pour la mutagénèse CRISPR / Cas9 de B. dorsalis, y compris la conception et la synthèse d’ARN guides, la collecte d’embryons, l’injection d’embryons, l’élevage d’insectes et le dépistage des mutants. Ces protocoles serviront de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les chercheurs intéressés par les études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.

Introduction

La mouche orientale des fruits, Bactrocera dorsalis , est une espèce d’insecte ravageur cosmopolite qui cause des dommages à plus de 150 espèces de cultures fruitières, dont la goyave, la mangue, Eugenia spp., la cerise du Surinam, les agrumes, le nèfle et la papaye¹. Les dégâts causés dans la seule province du Guangdong (Chine) sont estimés à plus de 200 millions de yuans. Les femelles adultes insèrent leurs œufs sous la peau des fruits mûrs ou mûrs, provoquant la pourriture et l’abscission du fruit, ce qui diminue la qualité des fruits et le rendement global de la culture². Étant donné que les mouches des fruits adultes ont une grande capacité de vol et que leurs larves pénètrent dans la peau du fruit, les insecticides nécessitant un contact direct avec le ravageur donnent de mauvais résultats au champ. De plus, l’utilisation intensive d’insecticides a accru la résistance de B. dorsalis à divers produits chimiques agricoles, rendant la lutte contre ces ravageurs nuisibles encore plus difficile³. Par conséquent, l’élaboration de stratégies de lutte antiparasitaire efficaces et respectueuses de l’environnement est désespérément nécessaire.

Récemment, avec le développement d’outils de biologie moléculaire et de technologies de séquençage à haut débit, les scientifiques tentent de développer des stratégies de lutte antiparasitaire respectueuses de l’environnement, telles que l’ARNi, qui ciblent la fonctionnalité de gènes importants (cibles moléculaires) de divers insectes nuisibles. Les gènes essentiels à la survie et à la reproduction de l’organisme nuisible peuvent être identifiés au moyen d’études de gènes fonctionnels et servir en outre de cibles moléculaires potentielles pour l’amélioration d’outils de lutte antiparasitaire spécifiquement ciblés et respectueux de l’environnement⁴. Pour adapter ces stratégies à la lutte contre la mouche orientale des fruits, des méthodes efficaces de recherche de gènes fonctionnels sont nécessaires.

Le système endonucléase CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) a été initialement découvert chez les bactéries et les archées et s’est avéré être un mécanisme adaptatif impliqué dans la reconnaissance et la dégradation de l’ADN intracellulaire étranger, tel que celui introduit par l’infection des bactériophages⁵. Dans le système CRISPR de type II, l’endonucléase Cas9 est guidée par de petits ARN associés (ARNcr et ARNtrac) pour cliver l’ADN ^6,7,8 et est devenue l’un des outils les plus utilisés pour l’édition de gènes à ce jour^9,10,11,12. Étant donné que le système CRISPR / Cas9 présente plusieurs avantages, tels qu’une efficacité élevée du silençage génique et un faible coût, il a déjà été appliqué à l’édition de gènes chez diverses espèces d’insectes, notamment Aedes aegypti^13,14, Locusta migratoria¹⁵ et Bombyx mori¹⁶. Chez B. dorsalis, les gènes liés à la couleur du corps, au dimorphisme des ailes et à la détermination du sexe ont été éliminés avec succès à l’aide de CRISPR / Cas9^17,18,19. Cependant, les procédures détaillées pour l’application de CRISPR/Cas9 chez cet insecte restent incomplètes. De plus, certaines étapes fournies par les chercheurs pour l’édition du gène B. dorsalis sont également variées et nécessitent une normalisation. Par exemple, les formes de Cas9 étaient différentes dans les références publiées^17,18,19.

Cet article fournit une méthode systématique pour la mutagénèse de B. dorsalis en utilisant le système CRISPR / Cas9, y compris la conception et la synthèse d’ARN guides, la collecte d’embryons, l’injection d’embryons, l’élevage d’insectes et le dépistage des mutants. Ce protocole servira de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les chercheurs qui s’intéressent aux études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.

Protocole

1. Conception de cibles et synthèse in vitro de l’ARNg

1. Prédire la structure des gènes cibles d’intérêt et déterminer les limites entre les exons et les introns grâce à l’analyse bioinformatique du génome de B. dorsalis (les applications logicielles utilisées ici sont répertoriées dans le tableau des matériaux).
   REMARQUE: BLAT²⁰ a été utilisé pour rechercher des loci génétiques potentiels dans le génome. Les lectures de séquençage d’ARN de haute qualité (transcriptome) ont été alignées sur les loci génétiques acquis à l’aide de Hisat2²¹. Samtools²² a été utilisé pour générer les fichiers bam triés. Les fichiers bam triés ont été entrés dans Stringtie2²³ pour fournir les transcriptions assemblées. Les transcriptions d’assemblage et les informations sur les loci géniques ont été combinées par Transdecoder²⁴. Les résultats obtenus à partir de Transdecoder ont été visualisés dans les outils IGV²⁵ et les limites entre exons et introns ont pu être déterminées.
2. Identifier les régions cibles appropriées dans le site du gène cible candidat. La longueur totale doit être inférieure à 750 pb pour un séquençage plus pratique (Figure 1B). Concevoir des amorces spécifiques pour amplifier la zone cible à partir de l’ADN génomique de type sauvage par PCR (Figure 1B) (Amorces : A-amorce : AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, amorce R : CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Cloner les produits de PCR en un vecteur final émoussé^{26 et sélectionner 20} colonies bactériennes individuelles pour le séquençage afin de déterminer le degré de conservation de la région cible dans les populations d’insectes de laboratoire.
3. Un site cible typique contient un motif de séquence à trois nucléotides (NGG ou CCN) et une séquence de 20 pb adjacente aux motifs NGG ou CCN (20 pb-NGG ou CCN-20 pb). Faire exploser les sites cibles candidats contre le génome de B. dorsalis et s’assurer que l’efficacité prévue est suffisamment élevée et que le taux de ciblage hors ciblage est faible; Plusieurs logiciels open source peuvent automatiquement prédire cela. Dans ce protocole, sgRNAcas9 -AI²⁷ est utilisé pour sélectionner et évaluer les cibles optimales. Les détails d’utilisation peuvent être trouvés dans le manuel de ce logiciel.
   NOTE: Les sites cibles possibles fermés à l’UTR 5' du gène cible et 1-2 Gs au début de la séquence de 20 pb sont favorisés. Afin d’obtenir une délétion importante qui sera identifiée par PCR suivie d’une électrophorèse sur gel d’agarose, il est recommandé de concevoir deux cibles²⁸ séparées par plus de 100 pb (Figure 1C).
4. Utilisez le kit de synthèse d’ARNg disponible dans le commerce pour générer le sgRNA conçu. Effectuez chaque étape en suivant le guide de l’utilisateur. Remettez en suspension le produit d’ARNg dans de l’eau sans nucléase, quantifiez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis et stockez à -80 °C avant utilisation (la concentration d’ARNg unique synthétisé avec succès [10 μL] avec le kit utilisé ici est d’environ 4000-6000 ng / μL, voire plus).
   NOTE: Bien que la génération des mouches mutantes soit la première étape pour chaque chercheur, le contrôle négatif approprié pour l’expérience / analyse en aval est essentiel. La génération de ces contrôles aux côtés des mutants permet aux chercheurs d’économiser du temps et des efforts. Par exemple, définissez scrambled sgRNA comme contrôle négatif.

2. Collecte et préparation des embryons

1. Placer les pupes de B. dorsalis dans des cages en plastique. Fournir un mélange de sucre et de levure (1:1) comme nourriture avec une source d’eau après la fermeture des adultes (figure 2A, B). Les conditions d’élevage sont de 55 % d’humidité relative (HR), 26,5 °C et un cycle de 14h10 L/D (lumières allumées à six heures du matin, lumières éteintes à huit heures du soir).
2. La plupart des adultes atteignent la maturité sexuelle 10 jours après l’émergence. Fournir un environnement approprié pour aider les mouches adultes à s’accoupler autant que possible. Idéalement, utilisez un support lumineux avec une lumière de 30-50 lux. Cela peut améliorer la fécondité des femelles, améliorant ainsi l’efficacité de la collecte d’embryons.
   REMARQUE: Mettre les adultes (âgés de 5 à 6 jours après l’émergence) dans un environnement faiblement éclairé (<100 lux) peut favoriser l’accouplement. Généralement, le pic de ponte se produit à 15h00 (14h10/L:D, lumières allumées à 06h00, lumières éteintes à 20h00); Pour obtenir suffisamment d’embryons, il est recommandé de placer des chambres de ponte dans les cages 30 minutes avant 15h00.
3. Placez une gaze de 200 mailles dans la chambre de ponte, à 1-2 mm du couvercle de la chambre. Cela aidera à obtenir autant d’embryons que possible.
   REMARQUE: Évitez de laisser les embryons trempés dans du jus d’orange ou frottés avec de la gaze, car cela peut réduire considérablement le taux de survie des embryons.
4. Placez une nouvelle chambre de ponte dans la cage lorsque la configuration de micro-injection est prête. Recueillir les embryons toutes les 10 minutes à l’aide d’une fine brosse humide, puis les aligner sur une plaque d’injection faite par vous-même (plexiglas d’une longueur de 55 mm, d’une largeur de 13,75 mm et d’une hauteur de 5 mm, Une rainure peu profonde de 45 mm x 5 mm x 0,3 mm est ouverte au milieu pour faciliter le placement des œufs). Si les embryons ont une pression interne élevée, une légère dessiccation à <10% HR pendant 10 min est facultative. Trempez les embryons dans de l’huile d’halocarbure pendant l’injection pour éviter toute dessiccation supplémentaire (Figure 2C).

3. Micro-injection de l’embryon

1. Préparez l’aiguille d’injection de verre à l’aide d’un extracteur de micropipette.
   REMARQUE: La définition des paramètres suivant le guide de l’utilisateur est importante. Dans ces protocoles, différentes formes d’aiguilles peuvent être réalisées en utilisant les paramètres suggérés par le manuel de l’extracteur de micropipettes. Le capillaire en verre doit être aussi propre que possible pour empêcher la poussière de boucher l’aiguille.
2. Préparez la solution de travail. Mélanger la protéine Cas9 et l’ARNg correspondant aux concentrations de travail suivantes : ARNs, 300 ng/μL; Protéine Cas9, 150 ng/μL. Ajouter 1 μL de rouge de phénol au mélange pour servir de moyen pratique de marquer les embryons injectés. Placer le mélange préparé sur de la glace pour éviter la dégradation de l’ARNg.
   REMARQUE: Utilisez des embouts de pipette sans nucléase et des tubes PCR. La concentration de protéine Cas9 doit être inférieure ou égale à 150 ng/μL; Des concentrations plus élevées sont toxiques et diminuent considérablement le taux de survie de l’embryon. Cas9 pourrait également être livré au format ADN ou ARNm pour réussir l’édition de gènes^17,19. Dans ce protocole, la protéine Cas9 est recommandée car les ARNm sont sensibles à la dégradation et l’expression de la protéine Cas9 à partir de l’ADN plasmidique prend du temps pour la transcription et la traduction.
3. Réglez les paramètres de l’injecteur. Le programme initial est Pi-500 hPa, Ti-0.5 s et PC-200 hPa. Ajustez davantage ces paramètres au besoin pendant la micro-injection.
4. Ajouter 3 μL du mélange dans l’aiguille d’injection. Évitez d’introduire des bulles d’air qui peuvent éventuellement obstruer l’aiguille. Ouvrez l’aiguille à l’aide d’un microbroyeur.
5. Connectez l’aiguille au micromanipulateur conformément au guide de l’utilisateur (Figure 2E).
6. Placez l’assiette avec des embryons alignés sur la table objective. Ajustez la position de la micropipette sous un microscope optique fin, en plaçant la micropipette et l’embryon sur le même plan. Ajustez le volume des gouttelettes en appuyant sur la pédale; 1/10 du volume d’embryons est recommandé.
7. Insérez l’extrémité de l’aiguille dans la partie postérieure (pôle végétal) de l’embryon. Administrer les mélanges dans l’embryon en appuyant sur la pédale de l’injecteur. Si du rouge phénol est ajouté, une couleur légèrement rougeâtre est observée instantanément.
   REMARQUE: Un petit volume de reflux cytoplasmique du trou d’épingle ne diminuera pas le taux de survie de l’embryon. L’injection de 200 embryons est suffisante pour réussir la mutagénèse d’un gène. L’ajout de plus d’huile d’halocarbure pour immerger les embryons peut empêcher une dessiccation supplémentaire. L’injection doit être effectuée avant la formation des cellules polaires, ce qui garantit que chaque mutation peut être héritée efficacement.

4. Élevage d’insectes après injection

1. Placez la plaque d’injection avec les embryons injectés dans une chambre climatique artificielle maintenue à 55% HR, 26,5 ° C et un cycle de 14h10 L / D (lumières allumées à six heures du matin, lumières éteintes à huit heures du soir).
2. Après l’injection, la formation de l’embryon prend généralement 24 heures pour compléter et 36 heures pour éclore. Utilisez une brosse à pointe fine pour transférer les larves dans un régime larvaire préparé. Ramassez les larves trois ou quatre fois par jour jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de larves. Généralement, les larves prennent 2-3 jours pour terminer l’éclosion et se nymphosent dans les 7 jours.
   NOTE: Un régime à base de maïs a été utilisé pour nourrir les larves. La recette contient 150 g de farine de maïs, 150 g de banane, 0,6 g de benzoate de sodium, 30 g de levure, 30 g de saccharose, 30 g d’essuie-tout, 1,2 mL d’acide chlorhydrique et 300 mL d’eau²⁹. Minimiser le temps de laissage des larves dans l’huile (<2 h). Déplacez les larves dans le régime alimentaire immédiatement après l’éclosion autant que possible. Cela peut augmenter considérablement les taux de survie et de nymphose. Ne donnez pas trop de nourriture (un régime avec 2/3 d’une boîte de Petri de 90 mm suffit pour 30 larves); Sinon, il moisira et diminuera le taux de survie des larves.
3. Mettez les larves matures dans le sable humide pour les nymphoser. La phase de nymphose dure environ 10 jours. Déplacez les pupes dans des cages en plastique avant le début de l’éclosion.

5. Dépistage des mutants

1. Un organigramme du dépistage des mutants est illustré à la figure 3A. Croisement d’adultes G0 obtenus par micro-injection avec des adultes de type sauvage pour obtenir des lignées hétérozygotes. Vérifier le type de mutations que la progéniture (G1) porte par génotypage.
2. Auto-croisement G1 avec le même génotype mutant pour obtenir des lignées homozygotes dans G2. Si les génotypes des mutants de G1 sont entièrement différents, croiser les hétérozygotes avec des mouches de type sauvage. Les lignées homozygotes sont généralement obtenues en G3. Maintenir deux ou trois lignées homozygotes pour les expériences de phénotypage ultérieures.
3. Utilisez l’ADN génomique d’un puparium frais ou d’une seule jambe médiane d’adultes individuels pour effectuer le génotypage. Concevoir des amorces spécifiques pour amplifier la zone cible; Les amorces doivent fixer au moins 50 points de base en amont et en aval du site cible. Reportez-vous à l’étape 1.2 pour les détails de l’amorce.
   REMARQUE: Étant donné que la quantité d’ADN dans un puparium est extrêmement faible, les kits d’extraction d’ADN disponibles dans le commerce sont recommandés.
4. Effectuer la PCR dans les conditions de cyclage suivantes : 98 °C pendant 3 min, suivi de 35 cycles de 98 °C pendant 10 s, 15 s à une température de recuit appropriée pour les amorces conçues, 72 °C pendant 35 s, suivi d’une extension finale de 72 °C pendant 10 min.
5. Séquencer les produits PCR purifiés. Lorsque plusieurs pics de chevauchement adjacents au site cible sont détectés (Figure 3B), une mutagénèse réussie s’est produite. Sous-cloner les produits de PCR purifiés en un vecteur émoussé et sélectionner 10 colonies bactériennes individuelles pour le séquençage afin de vérifier le génotype des mutants. Maintenir les lignes présentant des mutations de décalage d’image et des terminaisons de translation prématurées (Figure 3C).
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’effectuer le séquençage d’un seul clone pour vérifier le génotype des individus G0. Il suffit de séquencer les produits de PCR et de maintenir les individus avec des pics de chevauchement multiples évidents adjacents au site cible. Après l’injection initiale, il est recommandé de sélectionner 10 embryons pour extraire l’ADN génomique et de séquencer les produits PCR conformément aux normes de l’étape 5.3. Cela peut aider à prédire les taux de mutation à l’avance. Dans cette étude, le séquençage de sanger pour déterminer le génotype a été effectué par une société de séquençage.

Résultats

Ce protocole présente des étapes détaillées pour le développement de mutants de B. dorsalis à l’aide de la technologie CRISPR / Cas9, y compris des résultats représentatifs de la sélection de l’ADNg, de la collecte d’embryons et de la micro-injection, de l’entretien des insectes et du dépistage des mutants.

L’exemple du site cible du gène sélectionné est situé dans le troisième exon (Figure 1C). Ce site est hautement conservé, et...

Discussion

Le système CRISPR/Cas9 est l’outil d’édition de gènes le plus largement utilisé et a diverses applications, telles que la sélection génique³⁰, la sélection des cultures³¹ et les études fondamentales des fonctions génétiques³². Ce système a déjà été appliqué à l’édition de gènes chez diverses espèces d’insectes et a servi d’outil efficace pour les études de gènes fonctionnels chez les ravageurs. Les protocoles que nous ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6x DNA Loading Buffer	TransGen Biotech	GH101-01
Artificial climate chamber	ShangHai BluePard	MGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit	Axygen	AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT	NA	NA	For searching potential gene loci in the genome
Capillary Glass	WPI	1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf	InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	A29377
Hisat2	NA	NA	For aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGV	NA	NA	For visualizing the results from Transdecoder
Microgrinder	NARISHIGE	EG-401
Olympus Microscope	Olympus Corporation	SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit	TransGen Biotech	CB101-02	https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers	Instrument Company		https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix)	Takara Biomedical Technology	R040A
SAMtools	NA	NA	For generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AI	NA	NA	sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter	Instrument Company	P-97
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101-02
Transdecoder	NA	NA	For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo Fisher Scientific	A36498
Ultra-trace biological detector	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000C