Protocoles pour la mutagenèse CRISPR/Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis

Résumé

Cet article présente les protocoles étape par étape pour la mutagénèse CRISPR / Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis. Les étapes détaillées fournies par ce protocole normalisé serviront de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.

Résumé

La mouche orientale des fruits, Bactrocera dorsalis, est une espèce de ravageur très envahissante et adaptative qui cause des dommages aux agrumes et à plus de 150 autres cultures fruitières dans le monde. Étant donné que les mouches des fruits adultes ont une grande capacité de vol et que les femelles pondent leurs œufs sous la peau des fruits, les insecticides nécessitant un contact direct avec le ravageur donnent généralement de mauvais résultats au champ. Avec le développement d’outils de biologie moléculaire et de technologie de séquençage à haut débit, de nombreux scientifiques tentent de développer des stratégies de lutte antiparasitaire respectueuses de l’environnement. Il s’agit notamment de pesticides basés sur l’ARNi ou l’édition de gènes qui régulent à la baisse ou réduisent au silence les gènes (cibles moléculaires), tels que les gènes olfactifs impliqués dans la recherche du comportement, chez divers insectes nuisibles. Pour adapter ces stratégies à la lutte contre la mouche orientale des fruits, des méthodes efficaces de recherche de gènes fonctionnels sont nécessaires. Les gènes ayant des fonctions critiques dans la survie et la reproduction de B. dorsalis servent de bonnes cibles moléculaires pour l’élimination et/ou le silençage des gènes. Le système CRISPR/Cas9 est une technique fiable utilisée pour l’édition de gènes, en particulier chez les insectes. Cet article présente une méthode systématique pour la mutagénèse CRISPR / Cas9 de B. dorsalis, y compris la conception et la synthèse d’ARN guides, la collecte d’embryons, l’injection d’embryons, l’élevage d’insectes et le dépistage des mutants. Ces protocoles serviront de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les chercheurs intéressés par les études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.

Introduction

La mouche orientale des fruits, Bactrocera dorsalis , est une espèce d’insecte ravageur cosmopolite qui cause des dommages à plus de 150 espèces de cultures fruitières, dont la goyave, la mangue, Eugenia spp., la cerise du Surinam, les agrumes, le nèfle et la papaye¹. Les dégâts causés dans la seule province du Guangdong (Chine) sont estimés à plus de 200 millions de yuans. Les femelles adultes insèrent leurs œufs sous la peau des fruits mûrs ou mûrs, provoquant la pourriture et l’abscission du fruit, ce qui diminue la qualité des fruits et le rendement global de la culture². Étant donné que les mouches des frui....

Protocole

1. Conception de cibles et synthèse in vitro de l’ARNg

1. Prédire la structure des gènes cibles d’intérêt et déterminer les limites entre les exons et les introns grâce à l’analyse bioinformatique du génome de B. dorsalis (les applications logicielles utilisées ici sont répertoriées dans le tableau des matériaux).
   REMARQUE: BLAT²⁰ a été utilisé pour rechercher des loci génétiques potentiels dans le génome. Les lectures de séquençage d’ARN de haute qualité (transcriptome) ont été alignées sur les loci génétiques acquis à l’aide de Hisat2²¹. Samtools

Résultats

Ce protocole présente des étapes détaillées pour le développement de mutants de B. dorsalis à l’aide de la technologie CRISPR / Cas9, y compris des résultats représentatifs de la sélection de l’ADNg, de la collecte d’embryons et de la micro-injection, de l’entretien des insectes et du dépistage des mutants.

L’exemple du site cible du gène sélectionné est situé dans le troisième exon (Figure 1C). Ce site est hautement conservé, et.......

Discussion

Le système CRISPR/Cas9 est l’outil d’édition de gènes le plus largement utilisé et a diverses applications, telles que la sélection génique³⁰, la sélection des cultures³¹ et les études fondamentales des fonctions génétiques³². Ce système a déjà été appliqué à l’édition de gènes chez diverses espèces d’insectes et a servi d’outil efficace pour les études de gènes fonctionnels chez les ravageurs. Les protocoles que nous .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6x DNA Loading Buffer	TransGen Biotech	GH101-01
Artificial climate chamber	ShangHai BluePard	MGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit	Axygen	AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT	NA	NA	For searching potential gene loci in the genome
Capillary Glass	WPI	1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf	InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	A29377
Hisat2	NA	NA	For aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGV	NA	NA	For visualizing the results from Transdecoder
Microgrinder	NARISHIGE	EG-401
Olympus Microscope	Olympus Corporation	SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit	TransGen Biotech	CB101-02	https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers	Instrument Company		https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix)	Takara Biomedical Technology	R040A
SAMtools	NA	NA	For generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AI	NA	NA	sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter	Instrument Company	P-97
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101-02
Transdecoder	NA	NA	For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo Fisher Scientific	A36498
Ultra-trace biological detector	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000C