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Resumen

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Resumen

Con una eficiencia, precisión y facilidad excepcionales, el sistema CRISPR / Cas9 ha mejorado significativamente la edición del genoma en cultivos celulares y experimentos con animales de laboratorio. Al generar modelos animales, la electroporación de cigotos ofrece una mayor eficiencia, simplicidad, costo y rendimiento como alternativa al método estándar de microinyección. La electroporación también es más suave, con mayor viabilidad, y suministra de manera confiable ribonucleoproteínas (RNP) Cas9 / ARN de guía única (sgRNA) en los cigotos de cepas comunes de ratones de laboratorio (por ejemplo, C57BL / 6J y C57BL / 6N) que se acerca al 100% de eficiencia de entrega. Esta técnica permite mutaciones de inserción/deleción (indeles), mutaciones puntuales, la deleción de genes enteros o exones, e inserciones pequeñas en el rango de 100-200 pb para insertar LoxP o etiquetas cortas como FLAG, HA o V5. Aunque se mejora constantemente, aquí presentamos el estado actual de CRISPR-EZ en un protocolo que incluye la producción de sgRNA a través de la transcripción in vitro , el procesamiento de embriones, el ensamblaje de RNP, la electroporación y el genotipado de embriones preimplantacionales. Un investigador de posgrado con experiencia mínima en la manipulación de embriones puede obtener embriones genéticamente editados en menos de 1 semana utilizando este protocolo. Aquí, ofrecemos un método sencillo, de bajo costo, eficiente y de alta capacidad que podría usarse con embriones de ratón.

Introducción

La edición del genoma en ratones vivos se ha simplificado considerablemente y se ha vuelto accesible y más asequible desde la aparición de la edición CRISPR 1,2,3. Los intentos iniciales de edición en animales utilizaron microinyección para administrar ARNm/sgRNA de CRISPR Cas9 en embriones en estadio pronuclear 4,5,6. Si bien la microinyección es bastante efectiva, la cantidad de práctica requerida para dominarla completamente podría no ser apropiada para aprendices y estudiantes y también requiere equipos costosos que un laboratorio modestamente financiado no puede pagar. La microinyección normalmente es realizada por técnicos expertos en instalaciones transgénicas con horarios y precios de servicio que limitan la velocidad para muchos investigadores. Un enfoque más accesible es el de la electroporación, que ha demostrado ser bastante eficaz para la entrega de ARNm/sgRNA de CRISPR Cas9 en embriones en estadio pronuclear7. Otras mejoras en las estrategias de edición y entrega del genoma CRISPR sugirieron que las RNP preensambladas que ya están comprometidas con sgRNAs pueden ser un medio eficaz para reducir el mosaicismo8.

La razón detrás del desarrollo y uso de este protocolo fue evitar muchas de las limitaciones y obstáculos asociados con la microinyección. Como su nombre lo indica, un método fácil, interno y rentable que pudiera determinar rápidamente si valdría la pena usar diseños de sgRNA no probados durante un experimento de microinyección sería un paso de control de calidad de primer paso muy conveniente (Figura 1). Si bien este método no puede reemplazar la microinyección para estrategias más complejas, como la introducción de secuencias largas de ADN del donante para resultados basados en la recombinación, es ideal para estrategias menos complejas como pequeñas deleciones o inserciones y etiquetado de genes. Este método es apropiado para investigadores con habilidades básicas de manipulación de embriones que tienen necesidades de edición simples, les gustaría probar su hipótesis dentro del marco de tiempo del desarrollo preimplantacional, o prefieren probar sgRNAs en embriones antes de programar una cita con un especialista en microinyección. Aquí, los reactivos de edición se administran transitoriamente en embriones en etapa pronuclear como RNP Cas9 / sgRNA a través de electroporación (una serie de pulsos eléctricos) para maximizar la eficiencia y disminuir el mosaicismo8. Utilizando un método de genotipado de embriones, los resultados de edición están disponibles en aproximadamente 1 semana9, lo que reduce la necesidad de varias aplicaciones de microinyección a un costo significativamente reducido.

La efectividad de este método alcanza su punto máximo en la etapa embrionaria pronuclear, cuando el embrión aún no ha fusionado los pronúcleos materno y paterno o no ha entrado en fase S (Figura 2). La superovulación se utiliza para maximizar el número de cigotos, pero produce cigotos pronucleares y óvulos no fertilizados. Los cigotos sanos también se pueden preseleccionar antes de la electroporación para aumentar la eficiencia general. Como otros protocolos de electroporación han editado eficientemente cigotos sin necesidad de incluir un paso similar 7,10,11,12,13,14,15, un paso opcional de este protocolo es la ligera erosión de la zona pelúcida (ZP). La ZP es una capa de glicoproteína que ayuda a la unión de los espermatozoides, la respuesta acrosómica y la fertilización que rodea a los embriones en etapa pronuclear. En nuestra experiencia, encontramos que una suave erosión a base de ácido de la ZP proporciona una entrega confiable de electroporación Cas9 RNP con solo un impacto marginal en la viabilidad.

Hemos observado tasas de entrega de RNP de hasta 100% de eficiencia a través de electroporación en cepas de ratón que se utilizan comúnmente en investigaciones como C57BL / 6J y C57BL / 6N 9,16. Grupos independientes también han desarrollado procedimientos basados en electroporación con eficiencias mayores o equivalentes a la microinyección 11,12,13,14,15,17, con protocolos de electroporación que funcionan bien en rata18,19, cerdo 20,21,22 y vaca 23 , por lo que sugerimos que los lectores comparen los protocolos para encontrar las condiciones que mejor se adapten a sus necesidades experimentales y de equipo. El sistema descrito aquí utiliza materiales y equipos comunes, que requieren solo habilidades básicas de manipulación de embriones. Esta técnica es efectiva para una variedad de estrategias de edición, lo que hace que este método sea ampliamente accesible para la comunidad de investigación.

El diseño de ARN guía pequeños ideales (sgRNAs) es esencial para una edición eficiente. Recomendamos cribar de dos a tres estrategias de sgRNA por sitio objetivo directamente en embriones de ratón, especialmente si se desea la generación de línea de ratón. Una vez diseñados, se recomiendan métodos libres de clonación como la transcripción in vitro (IVT) para producir sgRNAs de alta calidad3. Los RNPs y sgRNAs se mezclan con 30-50 embriones procesados en estadio pronuclear y se exponen a una serie de pulsos eléctricos para permeabilizar primero temporalmente la ZP y la membrana celular, con pulsos posteriores para mantener los poros abiertos y electrophorese los RNPs a través del cigoto24. Después de la optimización, encontramos que seis pulsos de 3 ms a 30 V para embriones a granel (~ 50) fueron óptimos para la efectividad y viabilidad de la edición, proporcionando una entrega de Cas9 / sgRNA RNP altamente eficiente 9,16,25. Los eventos de edición en mórulas individuales de ratón pueden confirmarse utilizando una variedad de estrategias de validación comunes para la edición CRISPR, como el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), la digestión de endonucleasas T7 y la secuenciación de Sanger de la región de interés26.

El método actual es más apropiado para esquemas de edición simples (Figura 3), como inserciones/deleciones (indeles), deleciones de tamaño de exón del orden de 500-2000 pb, y la entrega de mutaciones puntuales e inserciones pequeñas como etiquetas C- o N-Terminal (por ejemplo, FLAG, HA o V5)9,16,27. El potencial para la edición compleja del genoma, como grandes inserciones de etiquetas fluorescentes o alelos condicionales, sigue siendo incierto y es el foco actual de las próximas mejoras.

Este método se domina fácilmente y se puede utilizar para probar rápidamente sgRNAs en embriones de ratón cultivados en 1 semana9 (Figura 1). En este trabajo se presenta un protocolo de seis pasos, que incluye 1) diseño de sgRNA; 2) síntesis de sgRNA; 3) superovulación y apareamiento; 4) cultivo, recolección y procesamiento de embriones; 5) montaje y electroporación de RNP; 6) cultivo embrionario y genotipado. Se proporciona información sobre todos los materiales utilizados (Tabla de materiales). Como control positivo, los reactivos para editar el locus 9,16 de la tirosinasa (Tyr) se han incluido en la Tabla suplementaria 1.

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Protocolo

Todo el cuidado y uso de animales a lo largo de este protocolo se adhirió a las políticas de la Ley de Bienestar Animal, la Guía ILAR para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y siguió las pautas de la AVMA para la eutanasia y las pautas y políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania (IACUC). El protocolo de cuidado y uso de animales fue revisado y aprobado por la Universidad de Pensilvania IACUC para este proyecto. Como cuestión de cumplimiento y precaución, busque todas las autorizaciones necesarias antes de intentar este protocolo.

1. sgRNA y diseño opcional de oligo donante

  1. Diseño de sgRNA
    1. Seleccione sgRNAs candidatos de cualquier algoritmo en línea ampliamente utilizado, como Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 o CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Como cada plataforma es única, lea atentamente las instrucciones del usuario para diseñar sgRNAs ideales. Para experimentos in/del, seleccione dos o tres sgRNAs para probar. Para las deleciones, se sugieren sgRNAs que flanquean la región objetivo, por ejemplo, dos sgRNAs aguas arriba del objetivo y dos sgRNAs aguas abajo del objetivo.
      NOTA: Si bien varios algoritmos de sgRNA en línea tienen en cuenta los objetivos fuera de los objetivos para evitar diseños de sgRNA defectuosos, la herramienta BLAST del NCBI es útil para confirmar la calidad de las secuencias de sgRNA seleccionadas.
    2. Insertar 19-20 nucleótidos (nt) determinados a partir del paso anterior (1.1.1) en la región variable del oligo de sgRNA (Tabla suplementaria 1) y comprar sgRNA sintetizados como oligos de ADN personalizados.
      NOTA: No se requiere purificación de PAGE.
  2. (Opcional) Diseño de oligo donante para knock-in mediado por reparación dirigida por homología (HDR).
    1. Diseñar el oligodesoxinucleótido monocatenario (ssODN) apropiado basado en el resultado experimental deseado (mutación puntual precisa, inserción de loxP, inserción de etiqueta pequeña, etc.), manteniendo la longitud total a 100-200 nt con brazos homólogos de 50 nt o más flanqueando la región central.
    2. Para garantizar una mayor eficiencia de knock-in, diseñe el sgRNA para que sea complementario al ssODN30 y reemplace la secuencia de motivos adyacentes al protoespaciador (PAM) con una mutación silenciosa para evitar el corte recurrente por la enzima Cas9.
    3. Ordene ssODN usando la opción oligo personalizada.

2. Síntesis de sgRNA

  1. Generación de plantillas para transcripción in vitro (IVT)
    1. Para generar la plantilla de ADN para la IVT de ARNg a través de PCR, prepare una reacción de IVT en un tubo de tira de PCR que esté libre de ARNasa. (véase el cuadro complementario 2).
    2. Utilice las siguientes condiciones del termociclador:
      95 °C durante 2 min; 30 ciclos de 95 °C durante 2 min, 57 °C durante 10 s y 72 °C durante 10 s; luego 72 °C durante 2 min
    3. Para verificar el éxito de la reacción PCR de la plantilla de ADN sgRNA, electroforese 5 μL del producto combinado con 1 μL de colorante de carga 6x en un gel de agarosa al 2% (peso / vol).
      NOTA: El tamaño de producto previsto es de 127 pb. Cualquier reacción de PCR restante puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 5 meses.
  2. Transcripción in vitro (IVT) de sgRNA
    1. Para generar el sgRNA, prepare la mezcla de reacción (T7 IVT según las instrucciones del fabricante) en un tubo de PCR y deslice para mezclar los reactivos.
      NOTA: Consulte la Tabla complementaria 3 para ver el ejemplo de configuración de reacciones. La reacción IVT es sensible a la contaminación por RNasa; por lo tanto, haga todo lo posible para proporcionar un entorno libre de RNasa.
    2. Para permitir que la reacción se inicie y proceda, incubar la mezcla de reacción IVT durante >18 h a 37 °C en un termociclador o en un bloque térmico.
    3. Para degradar la plantilla de ADN original (paso 2.1.3), introducir 1 μL de DNasa I (2 unidades por reacción) e incubar la reacción durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
    4. Para promover la unión del ARN a las perlas de purificación magnética, combine 129 μL de etanol al 100% en la reacción, que ahora será de 150 μL.
    5. Para resuspender las perlas de purificación, que tienden a asentarse durante el almacenamiento, voráige la alícuota durante al menos 10 s.
    6. Para purificar los sgRNAs, añadir 100 μL de las perlas resuspendidas (paso 2.2.5) a la reacción IVT (paso 2.2.4) y mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10x.
    7. Para permitir la unión, deje reposar la mezcla a RT durante 5 minutos.
    8. Para aislar el sgRNA de los productos de reacción no incorporados, coloque la reacción en los soportes magnéticos durante 5 minutos en RT y espere hasta que se forme un pequeño gránulo.
    9. Para lavar los sgRNAs, primero deseche cuidadosamente el sobrenadante y luego agregue 200 μL de etanol al 80% del pellet.
      NOTA: Durante el paso de lavado con etanol al 80% (vol/vol), es fundamental evitar alterar el pellet mediante el pipeteo, ya que esto reducirá considerablemente las concentraciones de sgRNA. En su lugar, pipetear suavemente el etanol al 80% para que el pellet quede sumergido, y retire suavemente el volumen con una pipeta.
    10. Repita el paso anterior (paso 2.2.9) y seque al aire el pellet durante no más de 5-6 minutos o el sgRNA se asociará permanentemente con las perlas.
    11. Eluya el sgRNA con 20μL de agua libre de nucleasas pipeteando el pellet 10x, incubando durante 2 min at (RT), y luego colocándolo de nuevo en el soporte magnético para separar las perlas del sgRNA ahora purificado.
    12. Para evaluar la calidad y cantidad del sgRNA, use un instrumento como un espectrofotómetro o un bioanalizador. Alternativamente, en un gel de agarosa al 2%, ejecute 2 μL de sgRNAs, similar al paso 2.1.3.
      NOTA: La calidad se confirma mediante una sola banda transparente. El resto del sgRNA puede utilizarse inmediatamente o almacenarse en condiciones de -80 °C.

3. Superovulación

  1. Para proporcionar suficientes embriones para probar cada diseño de sgRNA, superovular de dos a tres hembras C57BL / 6J que tengan entre 3 y 5 semanas de edad, como se describió anteriormente9. Se recomienda electroporar 20-30 embriones por sgRNA para generar suficientes resultados para confirmar la efectividad.
    NOTA: Si la fertilización es exitosa, espere 10-20 embriones por apareamiento.
  2. Para inducir la ovulación, siga este programa de inyección de hormonas:
    1. Día 1: Administrar 5 UI de gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG) (100 μL) a través de una inyección intraperitoneal (IP) con una jeringa de 26 G en ratones hembra de 3-5 semanas de edad.
    2. Día 3: Después de 46-48 h de inyección de PMSG, inyecte 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG) (100 μL) a través de una inyección IP para inducir la ovulación.
    3. Para establecer la reproducción, empareje a las hembras 1: 1 con un macho de reproducción confiable justo después de la inyección de hCG.
      NOTA: Para evitar que las hormonas se degraden y pierdan actividad, realice inyecciones en menos de 30 minutos de descongelación.

4. Recolección y procesamiento de embriones

  1. Recolección de embriones
    1. Para practicar la eutanasia a las mujeres y recuperar el material necesario, como se describió anteriormente31, asegúrese de confirmar primero el método apropiado de acuerdo con las políticas institucionales. Por ejemplo, use asfixia porCO2 , dislocación cervical y/u otros métodos aprobados.
      NOTA: Normalmente, el >75% de las hembras estimuladas por hormonas muestran tapones copulatorios, lo que indica un apareamiento exitoso.
    2. Para evitar que los pelos dificulten la recolección de tejido, coloque a las hembras sacrificadas sobre sus espaldas y rocíe etanol al 70% (vol / vol) en la región del abdomen para abrirla quirúrgicamente.
      NOTA: A partir de este momento, se recomienda realizar los pasos quirúrgicos en una campana ventilada para mantener un ambiente aséptico y reducir el potencial de contaminación.
    3. Para abrir la cavidad abdominal y extraer los oviductos, corte la capa de piel/cabello (subcutánea) con tijeras quirúrgicas y localice los ovarios (Figura 4), que se encuentran cerca del riñón y comparten una sección de una almohadilla de grasa. Los oviductos se localizan proximales a los ovarios (Figura 4). Extirpar quirúrgicamente ambos oviductos de la hembra y colocarlos en gotitas individuales de 50 μL de medio M2+BSA (4 mg/mL BSA) (Figura 5A).
      NOTA: Las instrucciones detalladas para esta sección del procedimiento se pueden ver visualmente31 o seguir paso a paso9 utilizando protocolos publicados anteriormente.
    4. Para liberar los complejos cúmulo-ovocitos (CoC) que contienen ovocitos (Figura 4), use pinzas de disección para cortar la ampolla del oviducto mientras observa a través de un microscopio estereoscópico.
    5. Para reducir la cantidad de residuos (sangre, grasa, tejido), transfiera y combine cada CoC a una sola gota de 50 μL de medios M2 + BSA con una pipeta de mano ajustada a 20-30 μL para evitar el arrastre de desechos.
  2. Eliminación de células cúmulos
    1. Para comenzar la eliminación de las células cúmulos de los cigotos (Figura 4), transfiera CoC con el menor medio adicional posible a una gota de 100 μL M2 + hialuronidasa (Figura 5B), y mezcle suavemente pipeteando los CoC hasta que los embriones estén visiblemente separados de las células cúmulos mucho más pequeñas. Asegúrese de mantener la exposición de M2 + hialuronidasa a los embriones al mínimo, ya que podría afectar la viabilidad.
      NOTA: Se puede precalentar (37 °C) o añadir 50 μL adicionales de M2+hialuronidasa si los embriones no se separan de las células cúmulos en 2 min.
    2. Para diluir la hialuronidasa y eliminar las células cúmulos sueltas de los cigotos, use una pipeta operada por la boca para mover los cigotos a una gota fresca de 50 μL M2 + BSA.
      NOTA: La mayoría de los pasos más allá de este punto requieren el uso de una pipeta operada por la boca a menos que se indique lo contrario. Si bien el riesgo de contaminación por parte del usuario es bajo, se recomienda el uso de un filtro de aire en línea para mantener un ambiente aséptico. Por favor, consulte los métodos descritos anteriormente para preparar y utilizar este instrumento 9,31.
    3. Usando una pipeta bucal, pasar los embriones a través de al menos cuatro o cinco gotitas más de 50 μL M2 + BSA para reducir el número de células cúmulas.
  3. (OPCIONAL) Adelgazamiento de la zona pelúcida con solución de tiro ácido (AT).
    1. Para erosionar la zona pelúcida del embrión y reducir los obstáculos físicos adicionales para la administración del reactivo, transfiera los embriones a una gota precalentada (37 °C) de 100 μL de solución de AT en una placa de 60 mm (Figura 5C). Observar continuamente los cigotos utilizando un estereomicroscopio hasta que aproximadamente el 30% de la zona pelúcida se erosione9. La exposición total a AT debe ser de 60-90 s. La exposición prolongada a AT puede disolver completamente la zona pelúcida y poner en peligro la viabilidad embrionaria.
      NOTA: Para obtener instrucciones detalladas e imágenes de esta sección del procedimiento, consulte los métodos publicados anteriormente 9,16.
    2. Para diluir el AT, use una pipeta bucal para pasar los embriones a través de al menos cuatro gotitas de 50 μL de M2 + BSA.
    3. Para determinar si se ha procesado un número apropiado de embriones, use un microscopio estereoscópico para contar los embriones. Dependiendo del número de ratones hembra utilizados, se pueden esperar aproximadamente 10-20 cigotos viables por hembra.
      NOTA: En esta etapa, los embriones deben estar relativamente libres de desechos que impidan la evaluación de la cantidad y la calidad. Por ejemplo, si se usan cinco hembras, el número esperado de cigotos probablemente estaría entre 50-100, y un contador celular mecánico sería apropiado para realizar un seguimiento de los embriones. Es común perder alrededor del 10% -20% de los embriones debido a la falta de fertilización o la ovulación de ovocitos de baja calidad. Durante el siguiente paso, almacene brevemente los embriones en 50 μL de M2 + BSA durante no más de 30 minutos en una incubadora.

5. Montaje y electroporación de RNP

  1. Asamblea RNP
    1. Para ensamblar el complejo RNP, use las tablas de ejemplo adjuntas para combinar las mezclas de reacción apropiadas basadas en la estrategia de edición deseada en el tampón RNP (100 mM HEPES pH 7.5, 750 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 50% de glicerol y 100 mM de clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina [TCEP] en agua libre de nucleasa)
      NOTA: TCEP es un agente reductor conveniente, pero tiene una vida media corta en soluciones acuosas; por lo tanto, agregue TCEP justo antes del ensamblaje complejo RNP.
      1. Para los indeles mediados por unión de extremos no homólogos (NHEJ), consulte la Tabla complementaria 4.
      2. Para la edición mediada por reparación dirigida por homología (HDR), consulte la Tabla complementaria 5.
      3. Para las deleciones de ingeniería utilizando sgRNAs pareados, consulte la Tabla suplementaria 6.
        1. Independientemente de la estrategia, combine los reactivos deseados en RT en un tubo de PCR.
        2. Para permitir la formación del complejo RNP, incubar la mezcla durante 10 min a 37 °C.
          NOTA: El complejo RNP puede ser almacenado en RT por hasta 1 h.
  2. Electroporación
    1. Para diluir la BSA antes de la electroporación, pasar los embriones a través de al menos dos gotitas de 50 μL de medios séricos reducidos.
      NOTA: La BSA aumenta la resistencia durante la electroporación y podría dañar los cigotos.
    2. Para preparar y mezclar los cigotos (paso 4.3.2) con el complejo RNP (paso 5.1.1.2) para la electroporación, pipetear en la boca 25-30 embriones en una gota de 10 μL de medios séricos reducidos, y luego usar una pipeta de mano para agregar 10 μL del complejo RNP (paso 5.1.1.2).
    3. Para diluir el glicerol viscoso del complejo RNP y homogeneizar la muestra, mezclar pipeteando 10x o hasta que la mezcla ya no muestre signos de viscosidad (patrón de remolino) utilizando un estereomicroscopio.
    4. Para preparar la muestra para su inserción en el electroporador, pipetear esta mezcla de 20 μL de embrión + RNP en una cubeta de electroporación de 0,1 cm evitando burbujas.
    5. Para administrar los reactivos de edición en el cigoto, electroporar los embriones utilizando un protocolo de onda cuadrada con estas condiciones: 30 V, 4-6 pulsos, 3 ms de longitud de pulso e intervalos de pulso de 100.
    6. Para recuperar cigotos de la cubeta, use una pipeta de mano para administrar 50 μL de KSOM + BSA (1 mg / ml de BSA) en la parte superior de la cubeta para enjuagar los embriones que pueden haberse asentado en la parte inferior. Pipetear suavemente esta mezcla hacia afuera y sobre una placa de 60 mm.
    7. Repita el paso 5.2.6 al menos 2x-3x y combine cada lavado en una placa de 60 mm hasta que se recuperen la mayoría de los embriones.
      NOTA: Una recuperación típica es >90% de los embriones cargados originalmente. Para garantizar la supervivencia del embrión, pruebe la incubadora y verifique las fechas de vencimiento de todos los reactivos. Los embriones son susceptibles a condiciones de cultivo no ideales como la temperatura, el nivel deCO2 , la humedad y el pH.

6. Cultivo de embriones y genotipado

  1. Cultivo de embriones
    1. Para cultivar cigotos a una etapa deseada, use una pipeta bucal para transferir 20-30 cigotos a una gota de KSOM + BSA en una placa de cultivo preequilibrada y mueva los embriones a la gota (Figura 5D). Incubar la placa durante la noche enCO2 al 5%, a 37 °C, con 95% de humedad.
      NOTA: Pre-equilibrar colocando una placa de cultivo preparada de 35 mm en una incubadora el día anterior o al menos 4 h antes de la incubación (Figura 5D).
    2. Para promover las condiciones ideales de crecimiento, transfiera solo embriones de dos células al día siguiente a una gota fresca de mezcla KSOM + BSA utilizando un microscopio estereoscópico y regrese a la incubadora. Asegúrese de dejar o descartar los embriones muertos o no fertilizados.
      NOTA: Los embriones en estadio pronuclear generalmente crecen en mórulas después de 72 h de cultivo y blastocistos después de 84 h.
  2. Genotipado
    1. Para diluir los componentes del medio que podrían interferir con una reacción de PCR, lave los embriones de mórula/blastocisto con una pipeta bucal pasando a través de dos gotas de DPBS.
    2. Para cargar embriones individuales para lisis, transfiera embriones individuales a un pocillo de una tira de PCR de 8 pocillos ajustando una pipeta a 1 μL, y luego agregue 10 μL de tampón de lisis (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8.5, 2.5 mM MgCl 2, 0.1 mg / ml gelatina, 0.45% Nonidet P-40, 0.45% Tween 20,0.2 mg / ml proteinasa K en H2O libre de nucleasa).
      NOTA: Agregue proteinasa K justo antes de preparar el tampón de lisis.
    3. Para lisar los embriones, programar un termociclador a 55 °C durante 4 h, y luego inactivar la proteinasa K con una incubación de 10 min a 95 °C.
      NOTA: Particularmente para usuarios primerizos, intente un experimento de edición en Tyr loci. Este flujo de trabajo ha sido optimizado y puede servir como un control positivo. Si es necesario, conservar el lisado embrionario a 4 °C durante 2-3 días o en el congelador hasta 2 semanas antes del análisis por PCR. Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación.
    4. Para aumentar las posibilidades de un análisis de genotipado exitoso, realice una estrategia de PCR anidada amplificando fragmentos de ADN ligeramente más largos que flanquean el sitio objetivo, así como regiones que se utilizarán para amplificar un fragmento de ADN más preciso. Siga las condiciones de la Tabla Suplementaria 7.
    5. Siga las condiciones del termociclador mencionadas a continuación:
      95 °C durante 2 min
      30+ ciclos: 95 °C durante 2 min, 60 °C durante 10 s y 72 °C durante 10 s
      72 °C durante 2 min
    6. Para preparar la segunda etapa de una estrategia de PCR anidada, realice una dilución 1:10 del primer producto de PCR (paso 6.2.5) y cargue 2 μL de este en la siguiente reacción de PCR (con cebadores diseñados para estar dentro del amplicón anterior).
      NOTA: La primera reacción de PCR debe diluirse para reducir el arrastre de cebadores flanqueantes en la segunda reacción de PCR. Prepare la PCR anidada siguiendo los pasos de la Tabla suplementaria 8.
    7. Coloque la reacción de PCR en un termociclador utilizando las siguientes condiciones de ciclo:
      95 °C durante 2 min
      30 ciclos: 95 °C durante 2 min, 60 °C durante 10 s y 72 °C durante 10 s
      72 °C durante 2 min
      NOTA: Normalmente, el >90% de las reacciones de PCR son exitosas cuando el tamaño del amplicón es de 500 pb o menos.
    8. (Control opcional) Para mutaciones in/del mediadas por NHEJ que utilizan Tyr como control positivo, digerir 10 μL de los productos de PCR anidados del paso 6.2.7 incubando a 37 °C durante 4 h utilizando 10 U de HinfI en una reacción de 20 μL (ver Tabla complementaria 9). En un gel de agarosa al 2%, ejecute el producto digerido para evaluar la edición y use un producto de PCR no digerido como control de carga. Ejecute el gel a 135 V durante 30 min.
      NOTA: Se seleccionó el uso de HinfI como enzima de restricción apropiada debido a un sitio HinfI convenientemente ubicado presente dentro de la región diana de sgRNA que se predice que se ablacionará tras una edición exitosa de NHEJ. Un método detallado y resultados han sido descritos previamente 9,16.
    9. (Control opcional) Para las mutaciones mediadas por HDR que utilizan Tyr como control positivo, digerir 10 μL de los productos de PCR anidados del paso 6.2.7 incubando a 37 °C durante 4 h utilizando 10 U de EcoRI en una reacción de 20 μL (véase la Tabla complementaria 10). En un gel de agarosa al 2%, ejecute el producto digerido para evaluar la edición y use un producto de PCR no digerido como control de carga. Ejecute el gel a 135 V durante 30 min.
      NOTA: La elección de EcoRI como enzima de restricción diagnóstica aprovecha la secuencia original encontrada en la región diana de sgRNA, donde, tras un HDR exitoso, el sitio HinfI natural se reemplaza con un sitio EcoRI, y se fuerza una mutación de cambio de marco que interfiere con el gen Tyr. Para el análisis HDR, realice análisis NHEJ (paso 6.2.8) y HDR (paso 6.2.9) en cada muestra, ya que ambos resultados pueden ocurrir y pueden ayudar a determinar el mosaicismo. Un método detallado y resultados han sido descritos previamente 9,16.

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Resultados

Este método genera más de 100 μg de sgRNA (20 μL a >concentración de 6,000 ng / L) para un ensamblaje eficiente de Cas9 / sgRNA RNP. El método de superovulación de rutina descrito aquí produce típicamente 10-20 embriones viables por hembra tapada. Debido a los errores de manejo y las pérdidas típicas asociadas con la manipulación embrionaria, se espera que el 80% de los embriones sean fertilizados, viables y en excelentes condiciones después de la electroporación. Para ayudar a los investigadores a ejecutar...

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Discusión

Aquí se presenta una tecnología de edición del genoma del ratón sencilla y altamente eficiente. La electroporación se puede utilizar para generar embriones modificados en 1-2 semanas (Figura 1) y puede producir ratones editados dentro de las 6 semanas9. En comparación con los protocolos basados en electroporación desarrollados contemporáneamente que entregan RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, el método descrito aquí es conceptualmente similar y ofrece eficiencia...

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Divulgaciones

No hay declaraciones financieras pertinentes de los autores.

Agradecimientos

A.J.M. creó el concepto original que condujo al desarrollo de CRISPR-EZ y produjo las figuras. C.K.D. compiló y adaptó los protocolos internos y publicados para este manuscrito actual. A.J.M. es compatible con NIH (R00HD096108).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-cm-gap electroporation cuvetteBio-Radcat. no. 1652089Electroporation
26-G, 1/2-inch needleBDcat. no. 305111Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female miceJAXcat. no. 000664Superovulation
35-mm Tissue culture dishGreiner Bio-One,cat. no. 627-160Embryo Culture
60-mm Tissue culture dishGreiner Bio-One,cat. no. 628-160Embryo Processing
6x loading dyeThermo Fisher Scientificcat. no. R0611sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture gradeSigma-Aldrich,cat. no. T1788Embryo Processing
BSA, embryo culture gradeSigma-Aldrichcat. no. A3311Embryo Processing and Culture
Cas9 proteinAlt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLScat. no. 1074181Electroporation
DNase I, RNase-freeNew England BioLabs,cat. no. M0303sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)Gibcocat. no. 14190-144Embryo Processing
EcoRINEBcat. no. R3101SGenotyping
EDTA, anhydrousSigma-Aldrichcat. no. EDS-100GRNP Buffer
EthanolKopteccat. no. V1016sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory gradeFisher,cat. no. G7-500Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology gradeFishercat. no. BP229RNP Buffer
Taq PolymerasePromegacat. no. M712Genotyping
HEPES, cell culture gradeSigma-Aldrichcat. no. H4034RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)NEBcat. no. R0155SGenotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BioLabs,cat. no. E2040sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)Milliporecat. no. 230734Superovulation
Hyaluronidase/M2Milliporecat. no. MR-051-FEmbryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)Zenith Biotechcat. no. ZEKS-050Embryo Culture
LE agarose, analytical gradeBioExpresscat. no. E-3120-500sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 mediumZenith Biotechcat. no. ZFM2-050Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)Sigma-Aldrichcat. no. M8266RNP and Lysis Buffer
Mineral OilMilliporecat. no. ES-005CEmbryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)Sigma-Aldrichcat. no. 74385Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology gradeAmbioncat. no. AM9937sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotypingIntegrated DNA Technologiescustom orderssgRNA Design
Reduced serum mediumThermo Fisher Scientificcat. no. 31985062Embryo Culture
High-fidelity DNA polymeraseNew England BioLabs,cat. no. M0530sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)Sigma-Aldrichcat. no. P9333RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)ProspecBiocat. no. HOR-272Superovulation
Proteinase K, molecular-biology gradeFishercat. no. BP1700-100Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tubeVWRcat. no. 20170-333sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubesVWRcat. no. 82006-606sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beadsGE Healthcarecat. no. 65152105050250sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-Aldrichcat. no. C4706RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology gradeTeknovacat. no. T1085Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology gradeSigma-Aldrichcat. no. P7949-500Lysis Buffer

Referencias

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