Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Zusammenfassung

Mit außergewöhnlicher Effizienz, Genauigkeit und Leichtigkeit hat das CRISPR/Cas9-System die Genom-Editierung in Zellkultur- und Labortierversuchen deutlich verbessert. Bei der Erstellung von Tiermodellen bietet die Elektroporation von Zygoten eine höhere Effizienz, Einfachheit, Kosten und einen höheren Durchsatz als Alternative zur Goldstandardmethode der Mikroinjektion. Die Elektroporation ist auch schonender, mit höherer Lebensfähigkeit und liefert zuverlässig Cas9 / Single-Guide-RNA (sgRNA) Ribonukleoproteine (RNPs) in die Zygoten gängiger Labormausstämme (z. B. C57BL / 6J und C57BL / 6N), die eine 100%ige Liefereffizienz erreichen. Diese Technik ermöglicht Insertions-/Deletionsmutationen (Indels), Punktmutationen, die Deletion ganzer Gene oder Exons und kleine Insertionen im Bereich von 100-200 bp, um LoxP oder kurze Tags wie FLAG, HA oder V5 einzufügen. Während es ständig verbessert wird, präsentieren wir hier den aktuellen Stand von CRISPR-EZ in einem Protokoll, das die sgRNA-Produktion durch In-vitro-Transkription , Embryo-Prozessierung, RNP-Assemblierung, Elektroporation und die Genotypisierung von Präimplantationsembryonen umfasst. Ein Forscher mit minimaler Erfahrung in der Manipulation von Embryonen kann mit diesem Protokoll in weniger als 1 Woche genetisch veränderte Embryonen erhalten. Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige, effiziente und leistungsfähige Methode an, die mit Mausembryonen verwendet werden könnte.

Einleitung

Die Genom-Editierung bei lebenden Mäusen wurde erheblich vereinfacht und ist seit dem Aufkommen der CRISPR-Editierung^{zugänglicher} und erschwinglicher geworden ^1,2,3. Erste Versuche zur Bearbeitung von Tieren verwendeten Mikroinjektionen, um CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium zu liefern ^4,5,6. Während die Mikroinjektion sehr effektiv ist, ist die Menge an Übung, die erforderlich ist, um sie vollständig zu beherrschen, möglicherweise nicht für Auszubildende und ....

Protokoll

Die gesamte Tierpflege und -verwendung während dieses Protokolls entsprach den Richtlinien des Tierschutzgesetzes, dem ILAR-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien der AVMA für Euthanasie und den Richtlinien und Richtlinien und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pennsylvania. Das Tierpflege- und Verwendungsprotokoll wurde von der University of Pennsylvania IACUC für dieses Projekt überprüft und genehmigt. Bitte holen Sie aus Gründen der Einhaltung und Vorsicht alle erforderlichen Genehmigungen ein, bevor Sie dieses Protokoll ausprobieren.

1. sgRNA u....

Ergebnisse

Diese Methode erzeugt mehr als 100 μg sgRNA (20 μL bei >6.000 ng/L Konzentration) für eine effiziente Cas9/sgRNA-RNP-Assemblierung. Die hier beschriebene routinemäßige Superovulationsmethode produziert typischerweise 10-20 lebensfähige Embryonen pro verstopftem Weibchen. Aufgrund von Handhabungsfehlern und typischen Verlusten, die mit der Manipulation von Embryonen verbunden sind, sind voraussichtlich 80% der Embryonen befruchtet, lebensfähig und in ausgezeichnetem Zustand nach der Elektroporation. Um den Forscher.......

Diskussion

Hier wird eine einfache und hocheffiziente Maus-Genom-Editing-Technologie vorgestellt. Die Elektroporation kann verwendet werden, um modifizierte Embryonen in 1-2 Wochen zu erzeugen (Abbildung 1) und kann innerhalb von 6 Wochen editierte Mäuse produzieren⁹. Im Vergleich zu zeitgleich entwickelten elektroporationsbasierten Protokollen, die RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32 liefern, ist die hier beschriebene Methode konzeptionell ähnlich und bietet Wirkungsgr.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-cm-gap electroporation cuvette	Bio-Rad	cat. no. 1652089	Electroporation
26-G, 1/2-inch needle	BD	cat. no. 305111	Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice	JAX	cat. no. 000664	Superovulation
35-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 627-160	Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 628-160	Embryo Processing
6x loading dye	Thermo Fisher Scientific	cat. no. R0611	sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade	Sigma-Aldrich,	cat. no. T1788	Embryo Processing
BSA, embryo culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. A3311	Embryo Processing and Culture
Cas9 protein	Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS	cat. no. 1074181	Electroporation
DNase I, RNase-free	New England BioLabs,	cat. no. M0303	sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)	Gibco	cat. no. 14190-144	Embryo Processing
EcoRI	NEB	cat. no. R3101S	Genotyping
EDTA, anhydrous	Sigma-Aldrich	cat. no. EDS-100G	RNP Buffer
Ethanol	Koptec	cat. no. V1016	sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade	Fisher,	cat. no. G7-500	Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP229	RNP Buffer
Taq Polymerase	Promega	cat. no. M712	Genotyping
HEPES, cell culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. H4034	RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)	NEB	cat. no. R0155S	Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England BioLabs,	cat. no. E2040	sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)	Millipore	cat. no. 230734	Superovulation
Hyaluronidase/M2	Millipore	cat. no. MR-051-F	Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)	Zenith Biotech	cat. no. ZEKS-050	Embryo Culture
LE agarose, analytical grade	BioExpress	cat. no. E-3120-500	sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium	Zenith Biotech	cat. no. ZFM2-050	Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. no. M8266	RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil	Millipore	cat. no. ES-005C	Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)	Sigma-Aldrich	cat. no. 74385	Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade	Ambion	cat. no. AM9937	sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping	Integrated DNA Technologies	custom orders	sgRNA Design
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	cat. no. 31985062	Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase	New England BioLabs,	cat. no. M0530	sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)	Sigma-Aldrich	cat. no. P9333	RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)	ProspecBio	cat. no. HOR-272	Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP1700-100	Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube	VWR	cat. no. 20170-333	sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes	VWR	cat. no. 82006-606	sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads	GE Healthcare	cat. no. 65152105050250	sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	cat. no. C4706	RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade	Teknova	cat. no. T1085	Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade	Sigma-Aldrich	cat. no. P7949-500	Lysis Buffer